大肠埃希菌检查法(建议收藏)
大肠埃希菌检查法
Escherichia Coli Test Method
1。目的
建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。
2。范围
适用于大肠埃希菌检查的操作。
3。责任者
QC化验员。
4.程序：
4.1。简述
4。1.1。大肠埃希菌（Escherichia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外.在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体.大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌,可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌.。。..。。文档交流
4。1.2. 用4—甲基伞形酮葡糖苷酸（4—Methylumbelliferyl—β—D-glucuronide，MUG）和靛基质（Indole）试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为:增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养,多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。。。。.。.文档交流
4.1.3. 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。......文档交流
实验证明,96％的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶（β
-glucuronidase,GUD),约10%的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG
被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6％，鉴于98％的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUG 与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG 与Indole试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB
琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98％。如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌,其结果是含混的。。.。.。.文档交流
4。2.仪器、设备及用具
4.2.1. 无菌室
4.2.2。净化工作台
4.2。3。培养箱（36±1℃）
4。2。4. 高压蒸汽灭菌器
4.2.5。显微镜(1500X)
4.2。6. 微波炉
4。2.7. 恒温水浴（45±1℃）
4。2。8。离心机(500～4000r/min)
4.2。9。 0.45μm±0。02μm薄膜及过滤器
4.2。10。电冰箱
4。2.11. 匀浆仪
4.2.12. 366nm紫外灯
4.2.13。玻璃器皿、器具
4.3.试液、指示液
4.3.1. 0.9%无菌氯化钠溶液取氯化钠9。0g,加水使溶解成
1000ml，121℃灭菌20分钟。.....。文档交流
4.3.2. 靛基质试液取氯化二甲氨基苯甲醛5。0g，加入戊醇(或丁醇）75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇,以免聚热导致溶液色泽变深,或取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95％乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入。。....。文档交流
4.3.3。甲基红指示液取甲基红0。1g，加95％乙醇300ml，使溶解后加水至500ml，即得。。..。。。文档交流
4.3。4。 V—P试液
α—萘酚乙醇试液:取α－萘酚6。0g，加无水乙醇溶解使成
100ml。
氢氧化钾试液:取氢氧化钾40。0g、加水使溶解成100ml。
4。3。5。革兰染色液
4.3.
5.1。结晶紫染液取结晶紫1。0g、95％乙醇20ml、1％草酸铵[(NH4）2C2O4]溶液80ml。将结晶紫溶于乙醇后，与草酸铵混合，静
置48h，置密闭棕色瓶,可存放数月.。。。.。。文档交流
4.3.5。2. 革兰碘液碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300ml。用少量水溶碘化钾,再加碘,待全溶后,加蒸馏水至30ml,置棕色瓶备用。.。。。。.文档交流
4.3。
5.3。脱色液 95%乙醇
4.3.5。4。沙黄（番红）染液沙黄（SafranineO）0。25g、95％乙醇10ml、蒸馏水适量,将沙黄加入乙醇中，完全溶解后再加水至
100ml。。..。。.文档交流
4。3。6。亚甲蓝指示液取亚甲蓝0.5g，加水溶解使成100ml。4。3.7. 溴麝香草酚蓝指示液取溴麝香草酚蓝0.4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0。64ml使溶解，再加水稀释至100ml。变色范围pH6。0~7。6(黄→红)。。.。..文档交流
4.3.8. 酸性品红指示液取酸性品红0.5g，加水100ml溶解，再逐渐加1mol/L氢氧化钠溶液16ml，每加1滴需将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色;于沸水中保持15分钟，静置2小时，滤过，即得。变色范围pH6。0～7。4(黄→红）.。...。。文档交流
4.3。9。曙红钠指示液取曙红钠2。0g，加水溶解使成100ml。4.3。10。无菌聚山梨酯80-氯化钠溶液取聚山梨酯80 1ml加0。9％氯化钠溶液使成100ml，121℃灭菌20分钟。。。。..。文档交流
4.3.11。无菌磷酸盐缓冲液（pH7.2) 取磷酸氢二钠2
5.8g与磷酸二氢钠4。4g,加水稀释至1000ml，121℃灭菌20分钟。.。。..。文档交流
4.3.12. 无菌对氨基苯甲酸试液取对氨基苯甲酸0.1g，加入含10ml 水的具塞试管中，121℃灭菌20分钟。。。。。..文档交流
4。3.13. 中性红指示液取中性红1.0g，研细，加95％乙醇60ml 使溶解，再加水至100ml。变色范围。.。.。。文档交流
Ph6。8～8.0（红→黄）.
4.3.14. 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH7.0）取磷酸二氢钾3。56g,磷酸氢二钠7.23g，氯化钠4。30g，蛋白胨1。0g，加水1000ml,加热使溶解,过滤。分装，灭菌。。.。.。。文档交流
4.4.培养基
4.4。1。营养肉汤培养基
胨 10g 氯化钠
5.0g。。。.。.文档交流
牛肉浸出粉 3。0g 水
1000ml。。。。..文档交流
取上述成份混合，微温溶解,调解pH为弱碱性，煮沸,调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。
4。4.2。营养琼脂培养基
胨 10g 氯化钠
5.0g。.。。。.文档交流
牛肉浸出粉 3.0g 水
1000ml.。.。.。文档交流
琼脂 14。0g
取上述成份混合，微温溶解,调解pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0。2，分装，灭菌.。.。...文档交流
4。4。3. 胆盐乳糖培养基（BL）
胨20。0g 磷酸二氢钾 1.3g
乳糖 5。0g 牛胆盐 2.0g
氯化钠5。0g （或去氧胆酸钠) （0.5g）
磷酸氢二钾 4.0g 水1000ml
除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7。4±0。2,煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠，分装，灭菌。。。。...文档交流
4。4。4. 4-甲基伞形酮葡萄糖化酶苷酸（4—methylumbellifery1-β—D-glu-curonide，MUG）培养基。.。.。.文档交流
胨10。0g 磷酸二氢钾（无水) 0。9g
硫酸锰0。5mg 磷酸氢二钠（无水） 6.2g
硫酸锌0.5mg 亚硫酸钠40mg
硫酸镁0。1g 去氧胆酸钠1。0g
氯化钠5。0g MUG 75mg
氯化钙50mg 水1000ml
除MUG外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入MUG，溶解，每管分装5ml,灭菌...。.。。文档交流
4.4。5。曙红亚甲基蓝琼脂培养基（EMB）
营养琼脂培养基100ml 曙红钠指示液2ml
20%乳糖溶液5ml 亚甲蓝指示液1。3-1。6ml
取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至60℃，按无菌操作加入灭
菌的其他
3种溶液，摇匀，倾注平皿。
4。4。6。麦康凯琼脂培养基（MacC）
胨20.0g 1%中性红指示液 3ml
乳糖 10。0g 琼脂 14。0g
牛胆盐5。0g 水1000ml
氯化钠5。0g
除乳糖1％中性红指示液、牛胆盐及琼脂外，取上述成分，混合，
微温溶解，调节pH值使灭菌后为7。2±0.2，加入琼脂，加热溶化后，
再加入其余各成分，摇匀,分装，灭菌，冷至约60℃,倾注平皿。.。.。。。
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4.4。7. 蛋白胨水培养基
胰蛋白胨 10g
氯化钠 5g
水 1000ml
取上述成分混合，加热溶化,调节pH使灭菌后为7。3±0.1，分
装于小试管，灭菌。
4。4.8。磷酸盐葡萄糖胨水培养基
胨 7g 磷酸氢二钾（K2HPO4) 2g..。..。文档交流
葡萄糖 5g 水
1000ml.。。.。.文档交流
取上述成分混合,微温溶解,调节pH使灭菌后为7.3±0.1,分装于
GB4789.38-2012卫生部标准大肠埃希菌检验方法
前言 本标准代替GB/T 4789.38-2008 《食品卫生微生物学检验大肠杆菌计数》。 本标准与GB/T 4789.38-2008 相比，主要变化如下： ——修改了标准的中文名称； ——修改了培养基和试剂； ——将“第二法大肠杆菌VRB-MUG 平板计数法”改为“大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）”；——删除了“第三法大肠杆菌Petrifilm TM 测试片计数法”； ——修改了附录A。 GB 4789.38-2012 1 食品安全国家标准 食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数 1 范围 本标准规定了食品中大肠埃希氏菌（Escherichia coli）计数的方法。 本标准适用于食品中大肠埃希氏菌的计数，其中大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）不适用于贝类产 品。 2 术语和定义 2.1 大肠埃希氏菌Escherichia coli 大肠杆菌 广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP 试验、柠檬酸盐）生化试验为＋＋－－或－＋－－的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品 的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。 2.2 最可能数 基于泊松分布的一种间接计数方法，简称为MPN。 3 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： a）恒温培养箱：36 ℃±1 ℃； b）冰箱：2 ℃～5 ℃； c）恒温水浴箱：44.5 ℃±0.2 ℃； d）天平：感量为0.1 g； c）均质器； d）振荡器； e）无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头；f）无菌锥形瓶：容量500 mL； g）无菌培养皿：直径90 mm； h） pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸； i）菌落计数器； j）紫外灯：波长360 nm～366 nm，功率≤6 W。
大肠埃希菌
大肠埃希菌 1.概况：大肠埃希菌是肠道中重要的正常菌群，婴儿出生数小时后就进入肠道中并终生伴随，能为宿主提供一些营养作用的合成代谢产物，宿主免疫能力下降或细菌侵入肠道外组织或器官，即可成为条件致病菌，引起肠外感染，以化脓性感染和泌尿道感染最为常见，某些血清型大肠埃希菌具有致病性，能导致人类腹泻。 2.形态：中等大小的革兰阴性杆菌无芽孢，多数菌株有周身鞭毛，能运动；有菌毛包括普通菌毛和性菌毛 3.体内分布：大肠杆菌在人和动物的肠道内，大多数于正常条件下是不致病的共栖菌，在特定条件下（如侵入肠外组织或器官）可致病。但少数大肠杆菌与人和动物的大肠杆菌病密切相关，它们是病原性大肠杆菌，正常情况下极少存在于健康机体。 4.培养：兼性厌氧菌，营养要求不高，在普通的琼脂平板37℃培养24小时后，埃希菌形成圆形凸起灰白色S型菌落。在液体培养基中均匀浑浊的生长。 5.生化反应：能发酵葡萄糖等多种糖类，产酸并产气，绝大多数菌株能发酵乳糖，可与沙门菌，志贺菌等区别。吲哚、甲基红、V-P、枸橼酸盐试验（IMViC试验）为++--，IMViC试验为此结果，可判断为典型的大肠埃希菌，表明被检物已被粪便污染，有传播肠道传染病的危险 6.抗原构造：大肠杆菌抗原主要有O、K和H三种，已确定的大肠杆菌菌体（O）抗原有173种，表面（K）抗原有80种，鞭毛（H）抗原有56种。O抗原凝聚相对较慢，呈颗粒状。H抗原刺激机体主要产生IgG类抗体，H抗原的凝集出现
较快，呈絮状。K抗原位于O抗原外层，为多糖，与细菌侵袭力有关。 7.生物学特性：本属细菌对干燥、腐败、日光等因素具有一定的抵抗力，在外界条件下可以生存数周或数月。对化学消毒剂的抵抗力不强，一般常用消毒剂和消毒方法均能达到消毒目的。通常情况下，对多种抗菌药物敏感。但由于长期滥用抗生素，对常用抗生素耐药现象普遍，不仅影响该病防制效果，而且亦成为公共卫生关注的问题。 8.致病物质 定植因子：又称黏附素（adhesin），可与黏膜表面细胞的特异性受体相结合而定植于黏膜，这是大肠杆菌引起的大多数疾病的先决条件。 外毒素：大肠杆菌可产生外毒素，最为人所知的是ETEC产生的由质粒编码的不耐热肠毒素（LT）和耐热肠毒素（ST）。LT有抗原性，分子量大，65℃经30min 即被灭活，可激活肠毛细血管上皮细胞的腺苷环化酶，增加环腺苷酸（cAMP）产生，使肠黏膜细胞分泌亢进，发生腹泻和脱水；ST无抗原性，分子量小，100℃加热30min而不失活，可激活回肠上皮细胞刷状缘绒毛上的颗粒性的鸟苷环化酶，增加环鸟苷酸（cGMP）产生，同样引起分泌性腹泻。 K抗原：具有吞噬作用 9.肠道外感染： 败血症：由大肠埃希菌尿道和肠道感染引起的。 新生儿脑膜炎：大肠埃希菌和B组链球菌是婴儿中枢神经系统感染的主要致病菌，约75%大肠埃希菌新生儿脑膜炎分离株具有K1荚膜抗原
微生物检验实验室致病性大肠埃希菌标准操作规程
微生物检验实验室致病性大肠埃希菌标准操作规程 1. 概述 致病性大肠埃希菌包括肠产毒型大肠埃希菌、肠致病型大肠埃希菌、肠侵袭型大肠埃希菌、肠出血型大肠埃希菌和肠凝聚型大肠埃希菌5群。与普通大肠埃希菌的生化反应相似，应结合血清反应（O、H和K抗原）、毒性试验（ST和LT肠毒素）和临床症状，分别鉴定5型致病性大肠埃希菌。 2. 标本类型 粪便标本。 3. 鉴定 3.1 形态染色与一般大肠埃希菌相同。 3.2 培养特性在麦康凯琼脂平板上形成不透明、粉红色或无色菌落。 3.3 生化反应与普通大肠埃希菌相似。 3.4 鉴别要点在山梨醇麦康凯琼脂平板上形成无色菌落。IMViC++--， 3.5 不发酵或迟发酵山梨醇，为本菌的主要特征。 3.6 操作步骤 3.6.1 氧化酶试验参见氧化酶试验标准操作规程。 3.6.2 致病型大肠埃希菌的鉴定 肠致病型大肠埃希菌（EPEC）婴幼儿水样或蛋花汤样便，鉴定为大肠埃希菌后用EPEC分型血清作O:H分型。
肠产毒型大肠埃希菌（ETEC）水样便，鉴定为大肠埃希菌后需要测定ST和LT两种肠毒素及血清分型。ST的检查可用兔肠段结扎试验，免疫学或分子生物学方法（DNA 探针）检测。 肠侵袭型大肠埃希菌（EIEC）细菌性痢疾样便，生化特性与志贺菌相似，不发酵或迟发酵乳糖，赖氨酸脱羧酶阴性，无动力，符合EIECO:H血清分型，豚鼠眼结膜试验、HELA细胞侵入试验阳性。 肠出血型大肠埃希菌(EHEC) 早期为水样便后为血便，有50多个血清型，最具代表性的是O157：H7不发酵或迟发酵山梨醇，在山梨醇麦康凯琼脂平板上形成无色菌落，可用EHECO:H诊断血清进行分型。 4. 药敏 参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSI M100-S20最新版本文件。 5. 质量控制 参见质量管理程序。 6. 检验结果解释与分析 疑似致病性大肠埃希菌感染，分离菌应先鉴定为大肠埃希菌，再通过不同的方法鉴定到种型，如分离到上述4种腹泻病原菌，应立即向临床发出报告。 7. 临床意义
大肠埃希菌的检查
药品中大肠埃希菌的检验 (1)按细菌总数测定方法制备供试液。 (2)取供试品l：10稀释液10mL，接种在制好的100mL胆盐乳糖培养基中,在37℃恒温箱中培养18～24 h，进行增菌培养。 (3)用接种环挑取上述培养物接种在麦康凯琼脂平板(MacC)或伊红美蓝琼脂平板(EMB)上，置37℃培养18～24 h，进行分离培养。观察有无鲜桃红色或微红色、中心深桃红色、圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑、湿润的菌落形成。 (4)挑取2～3个疑似大肠埃希菌菌落，分别接种在营养琼脂斜面培养基上，在37℃下培养18～24 h，进行纯培养。 (5)将疑似大肠杆菌的培养物涂片进行革兰染色，经镜检证明为G－无芽孢短杆菌的，应继续做生化试验。 (6)生化试验 ①乳糖发酵试验。将上述纯培养物接种在乳糖发酵管中，在37℃下培养24～ 48 h。凡大肠埃希菌，可发酵乳糖产酸产气。 ②靛基质试验。将上述纯培养物接种在蛋白胨水培养基中，在37℃下培养(48±2)h．加入0 .3～0 .5 mL靛基质试液(对二甲基氨基苯甲醛)，观察液面。液面呈玫瑰红色为阳性反应，呈试剂本色为阴性反应。 ③甲基红试验将纯培养物接种在磷酸盐葡萄糖胨水培养基内，在37℃下培养(48±2)h，在1 rnL培养液中加入l滴甲基红试剂，立即观察结果。呈鲜红色或橘红色为阳性反应。呈黄色为阴性反应。 ④乙酰甲基甲醇生成试验(VP试验)。将纯培养物接种在磷酸盐葡萄糖胨水培养基内，在37℃下培养(48±2)h，在2mL培养液中加入α一萘酚乙醇液1 mL_，混匀，再加入质量分数为40％的氢氧化钾溶液0.4mL后观察结果。培养液应在加入试剂后的4 h内呈红色为阳性反应，无红色为阴性反应。 ⑤枸橼酸盐利用试验。将纯培养物接种在枸橼酸盐斜面培养基上,在37℃下培养(48±2)h,观察结果。斜面有菌生长，培养基由绿色变为蓝色为阳性反应，斜面无菌生长培养基仍呈绿色为阴性反应。 (7)判断结果。经染色镜检证实为G–无芽孢短杆菌，乳糖发酵试验产酸产气，IMVC试验结果为++––或–+––的，可确认供试品中含有大肠埃希菌。
大肠埃希菌检查(新)
实训一大肠埃希菌的检查 一、实训目标 1．熟悉药品中大肠埃希菌的检验原理。。 2．掌握由口服药品中分离鉴定大肠埃希菌的程序及步骤。 3．学会分析检验结果，识别大肠埃希菌的特征。 4．掌握检验数据的处理，能够规范书写检验原始记录及检验报告书。 二、实训原理 大肠埃希菌是肠道中存在的正常菌群，故常来源于人和动物的粪便，所以常作为粪便污染的指标。一旦被检药物中查出大肠埃希菌，表明该药品已被粪便污染，可能存在肠道致病菌和寄生虫卵，患者服用该药物后有引起感染的危险。因此，大肠埃希菌被列为重要的卫生指标菌。国家药品卫生标准规定口服药品不得检出大肠埃希菌。 中国药典采用了MUG－Indole快速测定药品中大肠埃希菌。 在MUG试验中，将MUG（4-甲基伞形酮葡糖苷酸）作为目标菌的基本营养物加入培养基中，被大肠埃希菌的β-葡萄糖醛酸酶直接分解产物又作为一种指示系统，在366 nm紫外光下呈现兰白色荧光，即MUG阳性；若无荧光，即MUG阴性。 靛基质（Indole）试验中，大肠埃希菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。 因此根据大肠埃希菌的这一性质，对MUG呈阳性者，再加对-甲氨基苯甲醛试剂数滴，轻摇试管，培养液上层呈现玫瑰红色者(阳性)，报告检出大肠埃希菌。如果两者都为阴性，报告未检出大肠埃希菌。如果一阴一阳，需要进一步的培养和生化试验检查。 本方法对大肠埃希菌的检出率达98％。 培养温度：控制菌培养温度为30～35℃。 三、实训步骤 （一）实训用设备、仪器与试药的准备 100ml量筒、10ml吸量管、500ml烧杯、250ml锥形瓶、150ml锥形瓶、玻棒、大试管、6cm培养皿、吸耳球、小试管、1ml吸量管 乳糖胆盐培养基、MUG培养基、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、蛋白胨、1.0mol/l HCl溶液、1.0mol/lNaOH溶液、EMB、对二甲氨基苯甲醛、戊醇、盐酸 稀释液与培养基的配制 1）PH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液（200ml/2组） 磷酸二氢钾 0.7g 磷酸氢二钠 1.5g 氯化钠 0.9g 蛋白胨 0.2g 蒸馏水 200ml 配制：取上述成分混合，溶解，分装锥形瓶2个（用150ml锥形瓶），约90ml/个，包扎，标记，121。，15min灭菌。 乳糖胆盐培养基（400ml/2组） 2)乳糖胆盐培养基 12g 蒸馏水 400 ml PH=7.6 配制：称取，溶解，调节PH值，分装锥形瓶4个（用250ml锥形瓶），约100ml/个，包扎，标记，115。，15min灭菌
大肠埃希菌检查法.docx
大肠埃希菌检查法 ESCheriChia COliTeSt MethOd 1. 目的 建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。 2. 范围 适用于大肠埃希菌检查的操作。 3. 责任者 QC化验员。 4. 程序： 4.1. 简述 4.1.1. 大肠埃希菌(ESCheriChia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属 的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠 埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大 肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。 4.1.2. 用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-MethylumbelliferyI- β -D-glucuronide , MUG和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。 4.1.3. 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应 作为指示系统来鉴定目标菌。 实验证明，96%的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase ，GUD) 约10%的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUGS GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6%,鉴于98%的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUGf靛基质试验结合，比单用MU可提高大肠埃希菌的检出率。如MUGf Indole 试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98%。 如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。 4.2. 仪器、设备及用具 4.2.1. 无菌室 4.2.2. 净化工作台 4.2.3. 培养箱(36 ± 1C ) 4.2.4. 高压蒸汽灭菌器 4.2. 5. 显微镜(1500X)
控制菌(大肠埃希菌)检查操作规程
控制菌（大肠埃希菌）检查操作规程 1.目的 建立一个控制菌大肠埃希菌控制菌大肠埃希菌检查标准工作程序，规范QC控制菌大肠埃希菌检查人员的控制菌大肠埃希菌检查的操作。 2.范围 适用于本公司的口服制剂完成内包后外包前的中间体和局部给药制剂产品的内包装材料的控制菌大肠埃希菌的检测。 3.责任者 QC控制菌大肠埃希菌检查人员；质量管理部 4.内容 4.1检测准备 4.1.1 QC人员接到控制菌大肠埃希菌检查的《工作进程计划单》后，核对《取样指令》，确定控制菌大肠埃希菌检查所需容器具、试液、培养基等项目和数量，执行微生物检查准备工作操作程序和培养基配制操作规程，进行控制菌大肠埃希菌检查前的准备工作。 4.1.2 为了保证被检品在取样后规定的时间内完成检验，取样前应准备好检验需要的各种器皿（清洗→干燥→包裹）、培养基和稀释剂等（配制→分装→包裹），并灭菌备用。 4.2 供试液的制备 4.2.1 供试液供试液是指按照供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法将供试品制成供试验用的均匀液体。 4.2.2 供试液的制备根据供试品的理化特性与生物需特性，采取适宜的方法制备供试液。如果使用了乳化剂、分散剂、中和剂和灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响性。 4.2.2.1 可溶性液体供试品
取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。 4.2.2.2 非水溶性液体供试品 油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100m，混匀，作为供试液。 4.2.2.3 水溶性固体、半固体或黏稠性供试品 称取供试品10g，置PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml中，用匀浆仪或其他适宜方法，混匀，作为1：10供试液。必要时可加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 4.2.2.4 非水溶性供试品 取供试品5g(5m1)，加入含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使其充分乳化，作为1:20供试液。 4.2.2.5肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品10 g，加PH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或PH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1:10的供试液。 4.2.2.7具抑菌成分供试品 当供试品抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查，一般使用培养基稀释法，取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。取低稀释级供试液（原液或1:10的供试液）2份，每份各1ml，分别注入5个或5个以上平皿中（每皿0.2ml或<0.2ml），每个平皿倾注培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，按每1ml分注的平皿点计菌落数之和计数，即为每1ml的菌落数，共得2组数据，再以2组数的平均数乘以稀释倍数的值报告菌数。 4.2.2.8 供试液的制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃，时间为30min。
大肠埃希菌检查法
大肠埃希菌检查法 Escherichia Coli Test Method 1.目的 建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。 2.范围 适用于大肠埃希菌检查的操作。 3.责任者 QC 化验员。 4.程序： 4.1.简述 4.1.1.大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等 5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。 4.1.2.用 4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β -D-glucuronide，MUG)和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种 MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如 MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。 4.1.3.原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。 实验证明，96％的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUD)，约 10 ％的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG 被 GUD 水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG 鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG 鉴别大肠埃希菌其漏检率达 6％，鉴于98％的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG与Indole 试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用 EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98％。如仅用 IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。 4.2.仪器、设备及用具 4.2.1.无菌室 4.2.2.净化工作台 4.2.3.培养箱(36±1℃) 4.2.4.高压蒸汽灭菌器
大肠埃希菌检查用培养基适用性检查验证方案汇总
1.概述:培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制是提供优质培养基的保证。供试品微生物限度检查中所使用的培养基应进行适用性检查。 2.验证目的：本次验证的目的是确认大肠埃希菌检查用的麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基的质量，以及其制备程序、保存条件等是否满足微生物限度检查用要求。 3.验证依据：《中国药典》2015年版四部“1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”、“9203药品微生物实验室质量管理指导原则”。 4.验证项目：麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基的适用性检查。 5.适用范围：成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。 6.验证周期：除另有规定外，在实验室中，若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查试验可以只进行一次。如果培养基的制备过程未经验证，那么每一灭菌批培养基均要进行适用性检查试验。 7.验证小组人员及职责： 7.1验证小组人员: 7.2验证人员职责及要求 7.2.1按验证方案及相关文件实施验证。 7.2.2认真观察并做好验证原始记录。 7.2.3对实施验证的结果负责。 7.3验证中各部门的职责 7.3.1验证领导组职责 7.3.1.1制订验证总计划，负责全公司验证工作的管理。 7.3.1.2确定验证项目及验证项目负责人。
7.3.1.3负责验证方案的批准工作。 7.3.1.4负责验证资料及结果的审核工作。 7.3.1.5负责验证报告的批准工作。 7.3.2验证项目小组职责 7.3.2.1负责验证方案的起草工作。 7.3.2.2参与验证方案的讨论、确认工作。 7.3.2.3负责验证方案的实施。 7.3.2.4负责验证结果的分析、统计、报告工作。 7.3.2.5参与验证结果的评价工作。 7.3.3质量部职责 7.3.3.1负责公司验证日常管理工作。 7.3.3.2负责验证方案的审核工作。 7.3.3.3负责验证过程中仪器、仪表、计量器具的校验工作。 7.3.3.4负责检验仪器及检验方法的验证。 7.3.3.5负责验证中各项检测工作，提供验证的检验记录、检验报告，对验证过程中的各项检验工作负责。 7.3.3.6负责对验证人员的培训、考核工作。 7.3.3.7负责验证资料和报告的审核工作。 7.3.3.8负责验证文件回收、归档管理工作。 8.合格标准： 8.1被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致； 8.2被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。 9.验证实施条件
大肠杆菌检查法
目的：建立大肠杆菌检查法的标准操作程序，规范二大肠杆菌检查法的操作 范围：适用于大肠杆菌检查法 职责：检验科主管、检验员 规程： 1 简述 大肠杆菌即大肠埃希菌（Escherichia coli），为肠杆菌科埃希菌属的模式种，埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希菌等四个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠杆菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体，大肠埃希菌除普通大肠杆菌外尚有致病性大肠杆菌，可引起婴幼儿，成人爆发性腹泻，为保证人体健康，口服药品必须检查大肠杆菌。 用4-甲基伞形酮葡萄苷酸（4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，即MUG）和靛基质（Indole）试验检查大肠杆菌是一项新技术，其检验步聚为：增菌培养后，转种MUG蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG，Indole试验为阳性或阴性即可报告结果，如MUG与Indole试验不一致时，则需分离培养，革兰染色，镜检及生化试验鉴别。 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。 实验证明96%的大肠杆菌含β－葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUD），约10%的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠杆菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠杆菌其漏检率达6%，鉴于98%的大肠杆菌靛基质试验为阳性，故将MUG-靛基质试验结合，用EMB琼脂平板分离，辅以IMViC试验，在理论上可使大肠杆菌的检出率达99%。 2 仪器、设备及用具 2.1 无菌室［参照细菌，霉菌(酵母菌)计数2.1.1］。
SOP-QC4-010大肠埃希菌检查SOP
. 分发部门 质量管理部设备部物资部总经理办公室 质量保证室销售部生产部车间 质量控制室
●大肠埃希菌检查SOP 1.目的 建立一个规程，规范大肠埃希菌计数操作方法。 2.范围 本规程适用于xxxxxxxxxx公司质量控制室对水质、碳酸钙成品及其他的微生 物限度检查。 3.职责 QC检测人员负责按照本规程进行样品检测和记录；QC负责人及监管人员有权 对检测过程及结果进行监督检查，有权制止不符合规程的操作并向QA提出重试请求，得到QA批准后方可进行重试。必须开启偏差记录来解决不符合规程的操作。4. 物料和设备 4.1试剂和材料 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液： 取磷酸二氢钾3.56g、无水磷酸氢二钠5.77g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.00g，加水1000ml，微温溶解、滤清、分装、灭菌。 胰酪大豆胨液体培养基： 胰酪胨17.0g 氯化钠5.0g 大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g 磷酸氢二钾2.5g 以上成分混合加水1000ml，微温溶解，滤过，调节PH使灭菌后在25℃的pH 为7.3±0.2，加入无水葡萄糖2.3g或葡萄糖2.5g，分装，灭菌。20~25℃培养3～5天后无菌生长即可使用。 胰酪大豆胨琼脂培养基： 胨 10.0g 氯化钠5.0g 牛肉浸出粉3.0g 水1000ml 葡萄糖5.Og 除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇勻，滤清，调节pH使灭菌后在25°C的pH值为7.2士0.2，分装，灭菌。 麦康凯液体培养基 明胶胰酶水解物20.0g 溴甲酚紫10mg 乳糖10.0g 水1000ml牛胆盐 5.0g 除乳糖、溴甲酚紫外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH 使灭菌后在25℃的pH值为7.3±0.2，加入乳糖、溴甲酚紫，分装，灭菌。 麦康凯琼脂培养基 明胶胰酶水解物17.0g 中性红30.0mg 胨3.0g 结晶紫1mg 乳糖10.0g 琼脂13.5g 脱氧胆酸钠1.5g 水1000ml氯化钠 5.0g 除乳糖、中性红、结晶紫、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH 使灭菌后在25℃的pH值为7.1±0.2，加入乳糖、中性红、结晶紫、琼脂，加热煮沸1分钟，并不断振摇，分装，灭菌。 市售成品培养基按说明书配制。 革兰氏染色试剂：有商品供应，含结晶紫染剂、碘液固染剂、酒精脱色剂、复红复染剂。 4.2器材和设备 无菌器皿：吸管、量筒、锥形瓶或盐水瓶等。 其它器材和设备：接种针、酒精灯、玻片、细菌培养箱等。
大肠埃希菌的检测(一类特选)
幻灯片1 大肠埃希菌的检测 错误!未找到引用源。 幻灯片7 甲基伞形酮葡糖苷酸(MUG)培养基 ●胨10.0g 硫酸锰0.5mg ●硫酸锌0.5mg 硫酸镁0.1g ●氯化钠5.0g 氯化钙50.0mg ●磷酸二氢钾0.9g 磷酸氢二钠6.2g ●亚硫酸钠40.0mg 去氧胆酸钠1.0g ●MUG 75mg 水1000mL ●除MUG外，取上述成分，混合。微温溶解，调节PH7.2-7.4，加入MUG，溶解，每 管分装5mL，灭菌。 幻灯片8 实验步骤： ●取供试供试液1mL，直接或处理后接种在制好的100mL胆盐乳糖培养基中,在37℃ 恒温箱中培养18～24 h，进行增菌培养。 ●取上述培养物0.2mL,接种至含5mL MUG培养基的试管内培养，于5小时，24小时在 366nm紫外灯光下观察，同时用未接种的MUG培养基做本底对照。 ●若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性，不呈现荧光，则为MUG阴性。 幻灯片9 ●观察后，沿着培养管的管壁加入数滴靛基质试液，叶面呈玫瑰红色，为靛基质阳性， 呈试剂本色，为靛基质阴性。 ●本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。 ●靛基质实验原理 ●某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲 哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。 ● 幻灯片10 伊红美蓝培养基（EMB培养基） ● 蛋白胨水琼脂培养基100ml，20%乳糖溶液2ml，2%伊红水溶液2ml，0.5%美蓝水溶液1ml，将已灭菌的蛋白胨水琼脂培养基（pH7.6）加热溶化，冷却至60℃左右时，再把已灭菌的乳糖溶液，伊红水溶液及美蓝溶液按上述量以无菌操作加入。摇匀后，立即倒平板。乳糖在高温灭菌易被破坏必须严格控制灭菌温度，115℃灭菌20min。 幻灯片11
SOP-QC4-010大肠埃希菌检查SOP
页眉内容 分发部门 质量管理部设备部 质量保证室车间 质量控制室
●大肠埃希菌检查SOP 1.目的 建立一个规程，规范大肠埃希菌计数操作方法。 2.范围 本规程适用于xxxxxxxxxx公司质量控制室对水质、碳酸钙成品及其他的微生物限度检查。 3.职责 QC检测人员负责按照本规程进行样品检测和记录；QC负责人及监管人员有权对检测过程及结果进行监督检查，有权制止不符合规程的操作并向QA提出重试请求，得到QA批准后方可进行重试。必须开启偏差记录来解决不符合规程的操作。 4. 物料和设备 4.1试剂和材料 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液： 取磷酸二氢钾3.56g、无水磷酸氢二钠5.77g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.00g，加水1000ml，微温溶解、滤清、分装、灭菌。 胰酪大豆胨液体培养基： 胰酪胨17.0g 氯化钠5.0g 大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g 磷酸氢二钾2.5g 以上成分混合加水1000ml，微温溶解，滤过，调节PH使灭菌后在25℃的pH为7.3±0.2，加入无水葡萄糖2.3g或葡萄糖2.5g，分装，灭菌。20~25℃培养3～5天后无菌生长即可使用。 胰酪大豆胨琼脂培养基： 胨 10.0g 氯化钠5.0g 牛肉浸出粉3.0g 水1000ml 葡萄糖5.Og 除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇勻，滤清，调节pH使灭菌后在25°C的pH值为7.2士0.2，分装，灭菌。 麦康凯液体培养基 明胶胰酶水解物20.0g 溴甲酚紫10mg 乳糖10.0g 水1000ml牛胆盐 5.0g 除乳糖、溴甲酚紫外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH 使灭菌后在25℃的pH值为7.3±0.2，加入乳糖、溴甲酚紫，分装，灭菌。 麦康凯琼脂培养基 明胶胰酶水解物17.0g 中性红30.0mg 胨3.0g 结晶紫1mg 乳糖10.0g 琼脂13.5g 脱氧胆酸钠1.5g 水1000ml氯化钠 5.0g