RNAi技术在植物功能基因组学中的研究进展
RNA干扰与基因沉默
RNA干扰与基因沉默RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种通过特定RNA分子介导的基因沉默机制，被广泛应用于生物学研究、基因治疗等领域。
本文将深入探讨RNA干扰的原理、应用及未来发展方向。
一、RNA干扰的原理RNA干扰是一种高度保守且广泛存在于真核生物中的生物学过程。
它主要通过三种类型的RNA分子实现基因沉默：microRNA （miRNA）、small interfering RNA（siRNA）和Piwi-interacting RNA （piRNA）。
其中，siRNA是最为常见和被广泛应用的一种。
在RNA干扰中，siRNA与RNA诱导酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合物（RISC），RISC会通过碱基互补的方式与靶向RNA结合，并介导靶向RNA的降解，从而达到沉默该基因的效果。
这一过程使得基因的转录和翻译被有效地抑制，实现基因的沉默。
二、RNA干扰的应用1. 基因功能研究：RNA干扰技术被广泛应用于基因功能的研究中。
通过设计特定的siRNA，可以实现对目标基因的沉默，从而观察基因沉默对生物体的生理和生化过程产生的影响，揭示基因在细胞和生物体中的作用机制。
2. 疾病治疗：RNA干扰技术在基因治疗领域具有巨大潜力。
通过设计特异性的siRNA，可以实现对致病基因的沉默，从而治疗遗传性疾病、肿瘤和病毒感染等多种疾病。
此外，RNA干扰还可以用于研发新型药物和治疗手段。
3. 植物保护：在植物领域，RNA干扰技术也被广泛应用于植物保护。
通过设计特定的siRNA，可以实现对害虫和病原菌基因的沉默，从而提高作物的抗病虫性，减少对农药的依赖，实现绿色农业的发展。
三、RNA干扰的未来发展方向随着RNA干扰技术的不断发展，未来有望在以下几个方面取得重要进展：1. 靶向性增强：未来的RNA干扰技术将更加注重提高siRNA的靶向性，减少对非靶向基因的影响，从而提高沉黙效率和生物安全性。
2. 交叉学科应用：RNA干扰技术将与生物信息学、纳米技术等学科相结合，开拓全新的应用领域，如基因组编辑、精准医学等。
RNA干扰(RNA interference, RNAi)
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的研究生物体基因表达、调控与功能的一项崭新技术，它利用了由小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默(silencing)现象，其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合、降解，从而阻止mRNA的翻译。
RNAi是生物进化的结果，是生物体对病毒基因等外源核酸侵入的一种保护性反应。
它普遍存在于各种生物，具有抗病毒、稳定转座子及监控异常表达ｍRNA的生物学功能。
RNA干扰现象不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段，而且有可能在基因功能测定，基因治疗等方面开辟一条新思路。
1 RNAi的历史背景20世纪20年代，人们发现，植物受到野生型病毒感染后，能产生对另一种亲缘关系相近的病毒的抵抗力。
而真正发现双链RNA(dsRNA)能引起基因沉默现象，则在1995年。
当时，Guo和Kemphues用反义RNA技术阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)中parl基因的表达时发现反义RNA具有抑制该基因表达的功能，同时正义RNA也同样出现了类似的抑制效应，实验表明正义RNA和反义RNA均能阻抑基因功能表达，而且两者的作用是相互独立的，机制也各不相同。
1998年，Fire和Mello等人首次发现dsRNA能够特异地抑制C.elegans中的纹状肌细胞unc-22基因的表达，结果发现dsRNA所引起的基因沉默效应要比单单应用反义RNA或正义RNA强十几倍。
而且注射入C.elegans的性腺后，在其第一子代中也诱导出了同样基因的抑制现象，说明在原核生物中，RNAi具有可遗传性。
他们将这一现象称为RNAi。
因为RNAi作用发生在转录后水平，所以又被称为转录后基因沉默(PTGS)或共抑制。
此后，又在果蝇、锥虫、涡虫、无脊椎动物、脊椎动物、植物、真菌、斑马鱼及哺乳动物等真核生物中发现了RNAi现象。
RNAi技术在遗传学方面的研究进展
RNAi技术在遗传学方面的研究进展高利华 朱孟玲 (江苏农林职业技术学院 江苏句容 212400)R NA干扰(RN Ai)是最近几年发现和发展起来的一门新兴的在转录水平上的基因阻断技术 1。
RNA i是由双链R NA介导的,在转录后mRNA水平上关闭相应基因表达的过程,也就是序列特异性的转录后基因沉默(post-transcrip tional gene silencing,PT G S)。
RNA i是生物体中存在的一种普遍现象,代表了一种古老的细胞反应通路。
RNA i作为一种新兴的基因阻断技术,在基因组基因功能研究、遗传病的基因治疗和蛋白质功能研究方面已显示出巨大的前景。
为此,RNA i被美国!Science∀和!N ature∀杂志评为2002年度最重要的科技成果之一。
RNA研究的重大突破性进展,是近20年来可以与HGP相提并论的最重大的成果之一。
1 研究历史与分子机制1.1 研究历史1990年,为加深矮牵牛花的紫色,Jorgensen等人导入了一个强启动子控制的色素基因,可是结果与预期相反,许多花瓣颜色并未加深,反而呈杂色甚至白色,这是由于转基因和同源的内源基因的表达都被抑制了,Jorgensen把这个现象命名为共抑制(cosuppression)。
1995年,康奈尔大学的Su Guo博士在用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现,反义R NA和正义RNA都阻断了基因的表达,他们对这个结果百思不得其解。
到1998年,A ndrew F ire的研究证明,在正义RNA阻断了基因表达的试验中,真正起作用的是双链R NA。
这些双链RNA是体外转录正义RN A时生成的,于是提出了R NAi 这个词。
2002年,Zernicka-Coetz等用双链RN A注射小鼠受精卵和着床前的胚胎,结果发现导入的双链RN A可以特异性地抑制C-mos、E-cadherin和GFP基因的表达。
Judy L ieberman和Pr emlata Shankar首先向公众宣布了在动物中利用RNA i技术治疗疾病的研究进展。
反向遗传学在植物研究中的应用
反向遗传学在植物研究中的应用作者：闫晓丹来源：《中国果菜》 2010年第3期摘要:反向遗传学是直接从遗传物质入手来研究生命现象与规律的, 其相应的操作技术已在生命科学研究的各个领域显示出了广泛的应用前景。
本文就反向遗传学在植物研究中的应用进行了评述, 并对其前景进行了阐述。
关键词：反向遗传学技术；反向遗传学1、反向遗传学及其技术介绍反向遗传学（reverse genetics）是相对于正向（经典）遗传学而提出的。
经典遗传学的系统研究是从孟德尔的豌豆花实验开始的，就是通过研究生物的表型、性状来推测其遗传物质组成、分布与传递规律等，从而研究生命过程的发生与发展规律的。
即正向遗传学主要研究生物突变性状的遗传行为，如控制突变性状的基因数目及其在染色体上的位置以及突变性状在后代中的传递规律等。
反向遗传学则是在已知基因序列的基础上，利用现代生物理论与技术，通过核苷酸序列的突变、缺失、插入等手段创造突变体并研究突变所造成的表型效应。
即反向遗传学是直接从生物的遗传物质入手来研究基因的生物学功能，阐述生物生命发生的本质现象与规律，如生物的繁殖复制机制、病毒的致病机制等。
而与反向遗传学操作相关的各种技术统称为反向遗传学技术（r e v e r s e g e n e t i c sapproach），包括RNA 干扰（RNA interference,RNAi）技术、基因沉默技术、基因体外转录技术等，是D N A 重组技术应用范围的扩展与延伸。
随着基因组序列测定技术的日渐成熟，反向遗传学技术的应用将越来越广泛。
目前反向遗传学技术已广泛应用于生命科学研究的各个领域，且在病毒研究方面已经显示出了巨大的作用，尤其是R N A 病毒的研究方面。
2、反向遗传学的应用2.1 用于拯救病毒或创造新型病毒根据一些病毒的有关的已知核酸序列，采用反向遗传学操作技术可以构建出“人为设计”的病毒，得到以人工合成的寡核苷酸或已消失的病毒核酸序列为基因组的新型病毒，这给获得高免疫原性的低致病力毒株来制造疫苗提供了一个全新的途径。
RNA干扰技术及其在水稻基因功能研究中的应用
Ｋｅ ｒ ｓ ｙ ｗｏ ｄ ：ＲＮＡｉ ｉｅ；Ａ ｒ ｂ ｔｒｕ ｍｅ ｉｔ ｄ；ｆ ｎ ｔ ｎ ｌ ｅ ｏ ｃ ；ｒ ｃ ｇ ｏ ａ ｅ ｉ ｍ— ｄ ａｅ ｕ ｃ ｉ ａ ｎ ｍｉｓ ｏ ｇ
１ ２月
Ｒ Ａ 干 扰 技 术 及 其在 水 稻 基 因功 能 研 究 中的 应 用 米 Ｎ
刘 维振 ， 吴茂森 范静华 何晨 阳 ， ，
（． １ 中国农业科学 院植 物保护研究所植物病虫 害生物 学国家重点实验室 ， 北京 １０ ９ ； ０ ０ ４ ２ 南农业大学 ， ． 农业生物 多样性 与病虫害控制教育部重点实验室 ， 云南 昆明 ６ ０ ０ ） ５ ２ １ 摘要 ：随着水稻 全基 因组测序的完成 ， 探究水稻 巾许多未知基 因的功 能成 了当前的研究重点 之一 。Ｒ Ａ干扰技 Ｎ 术（ Ｎ ｉ作 为新 发展起来 的基 功能研 究方法正在被广泛采用 。以农杆菌介导转 化水稻 技 术也逐渐 成熟 简 Ｒ Ａ）
要综述了 Ｒ Ａ 作用 机制及其在水稻基 因功 能研 究中的应用的最新进展 。 Ｎ ｉ 关键词 ： Ｎ ｉ 水稻 ；农杆菌介导 ； 能基因组学 Ｒ Ａ； 功 中图分类号 ： １． ３ Ｓ５ １０ ２ 文献标识 码 ： Ａ 文章编号 ： ０４— ９ Ｘ ２０ ）６— ７ １ ０ １０ ３ ０ （ ０ ６ ０ ０ １ — ４
ＲＮＡ ｎ ｅ ｆｒ ｎ ｅ Ｔｅ ｈ ｉ ｕ ｎ ｔ Ｉ ｔ ｒｅ ｅ ｃ ｃ ｎ ｑ ｅ ａ ｄ Ｉｓ Ａｐｐ ｉａ ｉｎ ｆ ｒ Ｆ ｃｉ ｎ ｌＡｎ ｌ ｓｓ ｏ ｃ ｎ ｓ ｌ ｔｏ ｏ ｕｎ ｔｏ ａ ａｙ ｉ ｆＲｉｅ Ｇｅ ｅ ｃ
南农生物技术制药第七章RNAi
多靶点联合治疗
拓展应用领域
通过同时沉默多个疾病相关 基因，实现多靶点联合治疗， 提高治疗效果和降低副作用。
RNAi技术不仅可用于疾病治 疗，还可应用于农业、畜牧 业等领域，提高农作物和家 畜的产量和品质。
技术创新
随着科学技术的不断进步， RNAi技术将不断创新和完善， 为生物医药领域的发展注入 新的活力。
与其他基因沉默现象比较
要点一
RNAi与DNA甲基化
DNA甲基化是一种通过改变DNA分子结构而实现的基因沉 默现象。与RNAi不同，DNA甲基化作用于基因组水平，且 通常具有持久性。此外，DNA甲基化主要影响转录因子的 结合，而RNAi则直接降解mRNA。
要点二
RNAi与组蛋白修饰
组蛋白修饰是一种通过改变染色质结构而实现的基因表达 调控现象。与RNAi相似，组蛋白修饰也可以影响基因的表 达水平。然而，组蛋白修饰主要作用于染色质水平，通过 影响染色质的紧密程度来调控基因的表达，而RNAi则直接 作用于mRNA水平。
提高传递效率和稳定性策略探讨
传递效率提高策略
通过优化RNAi分子设计、改进传递载体 等方式，提高RNAi分子的细胞摄取和胞 内释放效率。
VS
稳定性增强策略
采用化学修饰、环化等方法，提高RNAi 分子的稳定性和抗干扰能力，延长其在体 内的作用时间。
未来发展趋势预测
个性化治疗
随着精准医疗的发展，RNAi 技术将更多地应用于个性化 治疗领域，为患者提供更加 精准的治疗方案。
病害防治
通过沉默病原菌致病相关基因的表达，达到防治植物 病害的目的。
抗药性理
针对已产生抗药性的害虫或病原菌，利用RNAi技术 沉默其抗药基因，恢复药剂的防治效果。
RNAi-回顾
RNAi——回顾摘要：生物通技术特刊：RNAi技术专辑之一：RNAi的回顾（生物通编译）近年来的研究表明,一些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNA interference，RNAi，也译作RNA干预或者干涉）。
它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。
由于可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，可以毫不夸张的说，RNAi正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命，并将彻底改变这个领域的研究步伐。
为此被Science评为2001年最重要的的成果之一。
......前言转录后基因沉默（Post-transcriptional gene silencing，PTGS), 原来曾经一度被认为是矮牵牛和少数几种植物的特殊现象，如今已成为分子生物学领域最热门的研究课题之一了(1)。
在过去的几年中，研究表明这种现象在植物和动物中都会发生，并且参与抵抗病毒感染、转座子沉默机制（transposon silencing mechanisms）等过程。
其中最引人注意的，就是RNA干扰（RNA interference,RNAi，也有译作RNA干预或者干涉）——引入双链RNA（dsRNA），通过特异性结合互补链从而抑制基因的表达，或者说是通过双链RNA引发转录后沉默，从而作为一种抑制细胞中某个基因表达的有力工具。
(reviewed in 1-3).RNAi是如何被发现的？以怎样一种机制工作？更重要的是如何利用这项强大的技术进行功能基因组的研究？本文将概要的介绍并将提供大家一些相关的资料。
20多年前，在对矮牵牛（petunias）进行的研究中有个奇怪的发现：Rich Jorgensen 和同事将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后，导入矮脚牵牛中，试图加深花朵的紫颜色，结果没看到期待中的深紫色花朵，多数花成了花斑的甚至白的。
RNAi的研究及应用_陈爱葵-2008
第28卷 第3期广东教育学院学报2008年6月Vol.28 N o.3Jour nal of Guangdo ng Education Institute Jun.2008RNAi的研究及应用陈爱葵,李梅红(广东教育学院生物系,广东广州510303)摘要:RNA干扰(RNA inter ference,RNAi)是由双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)引发的转录后基因沉默机制.RNAi可以调节和关闭基因的表达,进而调控细胞的各种高级生命活动,是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制.目前RNAi 的研究取得了很大进展,有可能为肿瘤基因治疗提供新策略.关键词:RNAi;基因沉默;siRNAs中图分类号:Q291 文献标识码:A 文章编号:1007-8754(2008)03-0069-05RNAi(RNA interference)即RNA干扰,是1998年由Fire首次发现并命名的转录后水平的基因沉默[1],是美国 Science 和 Nature 评出的2002年度最重要的科技成果之一,正成为基因功能研究和基因治疗研究的热点[2-7].1995年,康奈尔大学的Guo和,Kemphues等[8],利用反义RNA(antisense RNA)技术特异性地阻断秀丽新小杆线虫(C.eleg ans)中的par 1基因的表达以期得到与对照组注射正义RNA(sense RNA)相反的结果,但最终的结果却令他们费解,二者同样阻断了par 1基因的表达途径.直到1998年,Fire等[1]的研究证明,在正义RNA阻断了基因表达的试验中,真正起作用的是双链RNA.这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的,这种双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RN A干扰(RNA interference,RNAi).随后的研究发现,RNAi现象在多种生物中存在,如线虫、果蝇、斑马鱼、真菌以及植物等.生物体可利用RN Ai来抵御病毒的感染,阻断转座子的作用[9].到1999年T usch等[10]报道在哺乳动物中也存在RNAi,只是导入的RNA是小干扰RNA(siRNA);2001年Berstein等提出:只有22核苷酸才能特异性地阻断dsRNA,同时他们还发现了体内一个分解dsRNA为siRNA的叫Dicer的酶[11].近些年来,RNAi的研究取得了很大进展,它被 Science 杂志评为2001年的十大科学成就之一.2002年RNAi的研究又有了新的突破,发现它在基因表达调控中发挥重要作用,并名列2002年 Science 杂志评的十大科学成就之一[12].1 RN Ai的作用机制RNAi的作用机制可能是细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下,形成22bp大小的小干扰RNA(sm all interfering RNAs,siRNAs),siRNAs可进一步掺入多部分核酸酶并使其激活,从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA,完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达[7].现有的RNAi作用机制模型包括起始阶段和效应阶段:起始阶段:dsRNA进入细胞的方式可以是外源导入或者转基因、病毒感染等.引入的dsRNA被核酸酶RNase 家族中特异识别dsRNA的Dicer酶,以一种AT P依赖的方式逐步切割成长约21-23nt的由正反义链组成的双链小分子干扰RNA(siRNA),且每条单链的3 端都带有2个突出的非配对碱基(多数是UU).siRNA又被称为引导RNA(guide RNA),是识别靶RNA的标志.siRNA的生成启动了RNAi反应.效应阶段:siRNA结合一个核酶复合物,形成所谓的RNA诱导的沉默复合物(RNA induce silencing收稿日期:2007-12-06作者简介:陈爱葵(1962-),女,广东兴宁人,广东教育学院生物系副教授.70广东教育学院学报第28卷com plex,RISC).这个核酶复合物由内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA搜索活性蛋白四种成分组成.激活该复合物需要一个ATP依赖的将siRNA解双链的过程,活化以后的RISC定位到与siRNA中的反义链互补的靶mRNA转录本上,并在距离siRNA3 端12个碱基的位置切割mRNA.另外,通过遗传分析方法发现,线虫中的RDE 1、MU T 7和DNA/RNA解旋酶及其他PAZ/Piw i蛋白也参与到该阶段的反应.2 RN Ai的特点2.1 siRNA的结构和功能之间存在相关性dsRNA经过切割形成20 25nt的siRNA,它们具有5 末端的磷酸基,3 末端的羟基和2个突出的单链核苷酸.这种结构对于RNAi是十分必要的.N ykanen等的研究表明平末端的siRNA或失去5 磷酸基团的siRNA不具有RNAi的功能.所以,siRNA的三大结构特征是:长度为21~23nt、双链两端各有两个突出的3 碱基、5 端有磷酸基团.这些特征使得siRNA有别于其他的dsRNA,这也是细胞能够区分出真正的siRNA和其他dsRNA的分子基础.基于RNAi的这一特性,细胞可以自行监控异常的mRNA,并封闭该基因的表达.2.2 RNAi的特异性众多实验结果表明:导入生物体的siRNA只能引起同源基因表达的抑制,而无关基因不受影响.而且,在siRNA序列中配对的19~21nt中如果只改变一个核苷酸,就可以使该siRNA序列不对靶mRNA起作用,证明RNAi有明显的特异性.科学家可以通过制备外源性的siRNA并导入细胞内,特异性地抑制某些基因的过度表达和抑制突变基因的表达,研究基因的功能.2.3 RNAi的高效性dsRNA在Dicer作用下形成siRNA,siRNA解链与RISC形成复合物,这些RISC可专一性地与靶向的mRNA特异性结合.siRNA也有可能不与RISC结合,而是通过解链直接靶向结合mRNA.根据RISC结合位点或单链siRNA结合位点在RdRP(RNA依赖性的RNA聚合酶)作用下可形成新的dsRNA,后者被Dicer特异识别而将dsRNA切断,形成新的siRNA而再循环作用于靶向mRNA.切断后的mRNA或被核酸外切酶所降解,或可能成为异常RNA,在RdRP作用下又形成dsRN A,再次被Dicer识别并切断,形成新的siRNA进一步作用于靶向mRNA.这种不断放大的瀑布式作用形成大量新的siRNA,使RNA i作用在短时间内达到迅速并有效地抑制mRNA翻译形成蛋白质或多肽,从而有效地抑制了靶向基因蛋白质或多肽的合成.每个细胞只需少量dsRNA即能完全关闭相应基因表达,可见,RNAi过程具有生物催化反应的基本特征.2.4 RNAi的可扩散性Fire等观察到将dsRNA注射于线虫体内,这些dsRNA可以从注射处的细胞扩散到体内其他细胞,引起其他细胞的基因沉默[1].2.5 RNAi的可遗传性初期的实验观察到,在秀丽新小杆线虫、果蝇和小鼠的实验可以看到,细胞增殖50~100倍仍可保持RNAi效应.这说明RNAi有放大的效应,或者有高效的催化机制.然而,虽然RNAi的效应是长效的,甚至在受注射的秀丽新小杆线虫的子一代的整个生活周期里都能持续,但是由于它并不能产生DNA的修饰,随着细胞的不断分裂,dsRNA逐渐被稀释,最终不能持续地遗传下去.3 RN Ai的功能3.1 抗病毒功能Voinnet和Li等分别在植物和果蝇中发现了通过RNAi实现的抗外源核酸机制[13]:被大多数RNA病毒启动的RNA i可导致病毒基因组降解.例如在果蝇细胞中,Flock ho use virus(FH V)就能引发果蝇内部的RNAi反应,产生FH V特异性的siRNA来降解感染的FH V.Klatzmann等人最早发现了细胞表面的CD4分子是H IV的主要受体.H IV 1表面糖蛋白gp120能与CD4分子结合,通过引发胞内一系列信号传导途径,引起AIDS 病人体内有选择性的CD4+T 淋巴细胞减少[14],机体的细胞免疫功能受到损害.RNA i 技术出现后,研究发现siRNA s 可以作用于病毒感染的多个过程.Jacque 等针对H IV 1复制的早期和晚期,设计针对H IV 1基因组不同区域的siRNA s(LT R 、辅助基因vif 、nef),并转染人类细胞系及原始淋巴细胞、CD4+H ela 细胞[15].Novina 等合成分别针对H IV 1细胞受体CD4、病毒结构蛋白Gag 基因的siRNAs,发现siRNAs 能够有效抑制H IV 1进入细胞、H IV 1生活周期的整合前和整合后感染,证明siRNA s 在治疗H IV 1和其他病毒感染上有相当的潜力[16].3.2 基因调控目前在人、蠕虫、果蝇和植物等生物体中都发现了小RNA,有的通过结合3 非翻译区(UT R)和靶mRNA 抑制mRNA 翻译,有的作为siRN A 通过RNAi 机制破坏靶基因转录本,对基因表达水平进行调控.3.3 染色质浓缩内源的siRNA,一些小RNA 可能通过使染色质浓缩调节基因表达.一些研究小组发现dsRNA 结合到植物启动子区域能通过一种使DNA 甲基化的作用导致基因沉默;在蠕虫体内检测到许多Poly com b 蛋白(能结合染色质)是RNA i 过程所必须的;裂殖酵母中内源siRNA 可介导中心粒区染色质浓缩,导致这个位点的基因转录沉默.如Vera Schramke 等在裂殖酵母中通过合成shRNA(短发夹RNA)反式抑制同源位点,导致在mate 区沉默的Sw i6染色质浓缩.这些结果都提示一些内源性的siRNA 通过导致染色质浓缩来调节基因水平.3.4 转座子沉默目前,两方面的证据提示转座子沉默涉及siRNA.其一,发现蠕虫mut 7基因参与RNAi 和转位抑制.其二,从裂殖酵母的中心粒区也分离出siRNA,并检测到这些siRN A 介导此区内组蛋白甲基化.由于中心粒区包含重复序列 含转座子片段,在一些减数分裂基因中也发现了通过其附近的逆转录转座子LTR (长末端重复序列)介导的RNAi,推测在siRNA 介导的中心粒区域的组蛋白甲基化可能源于古老的转座子沉默作用.3.5 基因组重组siRNA 可能参与纤毛虫,四膜虫虫体间结合时的基因重组.结合到重组序列的siRNA,在虫体之间的结合过程中介导DNA 缺失和染色体断裂.有趣的是,在这些siRNA 介导的程序性DNA 删除事件中,也发现需要重组区域组蛋白的甲基化.4 RN Ai 的应用与前景4.1 高通量的研究基因功能在后基因组时代,需要大规模高通量的研究基因的功能,由于RNAi 能高效特异的阻断基因的表达,因而RNAi 成为研究基因功能的很好的工具.研究者将线虫三号染色体上2232个基因对应的dsRNA 合成出来,并注射到线虫性腺内,然后观察子代细胞分裂时出现的异常表型,结果发现了133个基因与细胞分裂异常有关.其中104个基因以前没有发现有这种功能.在另外一项研究中,线虫一号染色体上的2416个基因对应的dsRNA 被构建到细菌文库中,然后将细菌喂给线虫,观察形态学的异常、异常的运动、性别比例的变化、不孕的情况,结果将于这些表型有关的基因从70个增加到178个[6].最近,Silva 等、Yoshikaw a 等相继提出了RNAi 与Microarray 相结合的RNAi M icr oarrays 技术,其基本原理是:把表达shRNA 的载体点在 芯片 上,再加入转染试剂和哺乳动物细胞进行培养,而后对细胞表型进行扫描(或在m RNA 与蛋白质水平上检测),其中 芯片 上不同点代表了由不同shRNA 导致的细胞缺失表型,这给高通量的基因功能研究和药物开发带来了曙光[17,18].4.2 基因敲除在线虫的体内外试验中,RNAi 都能达到基因敲除的结果,从而成为研究这些基因功能的良好工具.对于哺乳动物,RNAi 能在体外培养的细胞达到基因敲除的效果,对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因,可以在体外培养的细胞中利用RNAi 技术研究它的功能.由于RNAi 能高效特异的阻断基因的表达,它71第3期 陈爱葵,等:RNAi 的研究及应用72广东教育学院学报第28卷成为研究信号传导通路的良好工具.在线虫体内,胰岛素和受体结合后可以活化DSOR1,它是MEK的类似物,DSOR1活化后可以激活ERKA,它是ERK的类似物.用以DSOR1为靶目标的dsRN A可以阻断DSOR1的表达,虽然总的ERKA的表达不受影响,但由于DSOR1的表达被抑制,因而胰岛素刺激后ERKA 不能活化.RNAi还被用来研究在发育过程中起作用的基因,如可用RNAi来阻断某些基因的表达,来研究它们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中其起着关键作用.4.3 基因治疗目前抑制基因表达常采用反义技术或转入没有功能的突变体与该基因竞争.这两种方法对基因表达的抑制都不如RNAi高效特异持久.作为基因治疗的工具,RNAi既高效特异,又简便易行.RNAi在某个基因表达异常增高引起的疾病中会非常有用,如病毒感染、肿瘤等.CDK 2是调控细胞周期的一个关键基因,用以CDK 2位靶目标的dsRN A能阻断99.7%的细胞中CDK 2的表达,而在对照中只有0.2%的细胞中CDK 2基因的表达降低.因而,以CDK 2位靶目标的dsRNA能治疗细胞异常增殖相关的疾病,如肿瘤等. DsRNA还可以抗病毒治疗.研究者们将H IV 1编码r ev的基因和与它同源的双链RNA共转染到293细胞中,rev基因的表达被显著抑制.CD4基因编码细胞表面H IV病毒的受体,用针对CD4的dsRNA能将细胞表面H IV病毒的受体表达减少75%,从而抵抗H IV病毒的感染.4.4 基因表达调控RNAi在Epigenetics中发挥重要作用.Epig enetics是指至少一代的基因表达的改变,而基因的编码没有改变.近年研究者发现,Epig enetics调控的一种类型是染色体的改变.通过改变染色体的形状(更紧或是更松),能够决定那一个基因表达.但什么促进了染色体形状的改变以前并不清楚.今年研究者发现,siRNA 在染色体形状的改变中起着非常重要的作用.这样RNAi能永久的关闭基因的表达,而不仅仅是短期的抑制它.通过在发育过程中关闭或开放基因的表达,siRNA可能指导着细胞的定向分化.RNAi已被证实能引导植物干细胞的分化,因而研究者认为RNAi也可能参与指导人的干细胞的分化.由于RNAi在基因表达调控中发挥重要的作用,对RNAi微小的干扰就可能导致肿瘤的发生.目前RNAi在非脊椎动物如线虫、果蝇,以及植物中的应用已经取得了很多重要的成果,但在哺乳动物中的应用还处于起步阶段.在哺乳动物细胞中,RNAi并不能完全阻断基因的表达,特别是表达异常高的基因.T uschl等人的研究工作中,有三个基因被抑制了90%,但有一个基因没有被抑制,这就是一个表达很高的基因.另外,运载体系一直是体内基因治疗的瓶颈,如何将双链RNA高效特异的转入体内仍是一个难题.目前已能用腺病毒作为载体在体内实现RNAi,但仍需要寻找更为安全有效的载体.5 结束语科学家预言,一旦RNAi技术能用于临床治疗艾滋病、肝炎和恶性肿瘤,这将是病毒性、寄生病原性、突变基因和癌基因表达等所引起的疾病在基因治疗方面的一场新的革命.而基因的突变在胰腺癌的发病及发展中均占有重要地位,通过改变癌基因的表达,可以杀灭肿瘤或抑制肿瘤生长或增加癌细胞对化疗药物的敏感性,RNAi将会是癌基因治疗的又一重要工具.参考文献:[1]FIRE A,X S,MONT GOM ERY M K,et al.Po tent and specific g enetic interference by do uble strandedRNA in Caenor habditis elegans[J].Natur e,1998,391(6669):806-811.[2]ELBA SH IR S M,H ARBORT H J,LENDECKEL W,et al.Duplexes of21 nucleotide RNAs m ediateRNA interference in cultured mam malian cells[J].Nature,2001,411:494-498.[3]SCH UT ZE N.siRNA technolog y[J].M ol Cel l Endo crinol,2004,213:115-119.[4]T ANG Fu chou,XUE You fang.RNA interference and g ene silencing[J].H eredi tas(Beijing),2001,23(2):167-172.[5]YU AN Wu zho u,BODM ER Ro lf,ZH U Chuan bing,et al.T he use of RNAi as a technique to study the function of heart related g enes in Drosophi la[J].Acta Genetica S inica,2002,29(1):34-38.[6]M A Jun,ZH OU H ong lin,SU Lei,et al.Influence of basonuclin gene ex pression in m ice oocyte using ex ogenous dsRNA[J].Science in China Series(C),2002,32(3):248-255.[7]ZH A NG Li Sheng,CH EN Da Yuan.RNA inter ference and its pr omising future [J].H ereditas(Bei jing ),2003,25(3):341-343.[8]GU O S,KEMPH UES K J.Par 1,a g ene requir ed for establishing po larity in C.elegans embryos,en codes a putativ e Ser/Thr kinase that is asymm etrically distributed[J].Cell,1995,81:611-620.[9]ZAM ORE P D,T USCH L T ,SH ARP P A,et al.RNAi:double stranded RNA directs the ATP depend ent cleavage of mRNA at 21to 23nucleotide interv als[J].Cell,2000,101:25-33.[10]TU SCH L T,ZAM ORE P D,LEH M ANN R,et al.T argeted mRNA degradation by double strandedRNA in vitr o[J].Genes Dev ,1999,13:3191-3197.[11]BERNN ST EIN E,CAUDY A A,H AM MOND S M ,et al.Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference[J].Nature,2001,409:363-366.[12]任玥欣,宋于刚,陈学清.RNAi 研究进展[J].世界华人消化杂志,2004,12(3):748-750.[13]张定样,樊斌,刘榜,等.RNA 干涉(RNAi)技术应用于哺乳动物细胞的研究策略[J].遗传,2005,27(5):839-844.[14]WILLEY R L,BON IFACIN O J S,POT TS B J,et al.Biosy nthesis ,cleavage,and degradation of thehuman imm unodeficiency virus ty pe 1env elo pe gly coprotein g p1601[J].Pr oc Natl Sci U SA,1988,85(24):9580-9584.[15]JACQUE J M,T RIQU ES K,STEVENSON M.M odulation of H IV 1replicatio n by RNA interference[J].Nature,2002,418(6896):435-438.[16]NOV INA C D,M URRAY M F,DYKXH OORN D M,et al.siRN A dir ected inhibition of H IV1infection[J].Nat Med ,2002,8(7):681-686.[17]SILVA J M ,MIZU NO H ,BRADY A,et al.RNA inter ference microarrays :H ig ht hroughput lossof function g enetics in mammalian cells[J].Pro c N at l Acad Sci U S A,2004,101:6548-6552.[18]YOSH IKAWA T ,U CH IM URA E,KISH I M ,et al.T ransfection micr oarray of human m esenchym al stem cells and o n chip siRNA gene kno ckdow n[J].J Cont rol Release,2004,96:227-232.The Research of RNAi and its ApplicationCH EN A i kui,LI M ei hong(Dept.of Bio logy,Guangdong Educatio n Institute,Guang zhou,Guang dong,510303,P.R.china)Abstract:RNAi (RN A interfer ence )is a m echanism w hich is the after transcription Gene Silence tr ig gered by double strand RNA.RNAi has a contribution that can inter fere w ith advanced activities of the cell via reg ulation and turn off gene ex pression.This mechanism is found ubiquito us in eukaryote and plays a role of resisting inbreak of virus and restraining the activ ity of tr ansposon.T he research o f RNAi has achieved a g reat number of r esults,that may pr ovide a new strategy for gene therapy of cancer.Key words:RNAi;g ene silence;siRNAs 73第3期 陈爱葵,等:RNAi 的研究及应用。
RNAi的发现过程
RNAi：A Phasing-Out Technology?
• 显著的脱靶效应和不可预测的 抑制效率
• 其他技术的的出现
RNAi, TALEN, 和CRISPR三者之间的比较
参考文献：Boettcher M , Mcmanus M . Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR[J]. Molecular Cell, 2015, 58(4):575-585.
Dicer的作用发现
2001年，Ketting等人通过测试
胚胎提取物Dicer的活性，并利用免疫 沉淀、缺失突变体分离、基因转移、 Seam细胞分析、RNAi检验等方法解 释了Dicer在秀丽隐杆线虫RNA干扰 和小RNA合成中的作用。
Dicer可能参与两个不同的过程，这两个过程都需 要将dsRNA加工成小RNA，其中一条途径(ds-RNA 诱导)通过RISC复合物和RNAi导致RNA降解。第二 种途径(依赖于let-7)通过内源性的、短暂的小RNA 及其mRNA靶点之间的相互作用导致翻译的抑制。
“后人改良”：当他们将T4和T7 RNA聚合酶体外转录
制备的单链RNA电泳纯化后再注射于线虫，结果发现只有微弱 的基因抑制作用。而将纯化后的dsRNA 一正义链和反义链的 混合物注入线虫，发现dsRNA能够高效特 异的阻断相应基因 的表达，而且抑制基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量 级。该小组将这一现象称为“RNA interference-RNA干扰” 。首次揭开了Guo和Kemphues的谜底。
pSUPER载体是否可以介导基因表达 的稳定抑制？
MCF-7 细 胞 与 含 有 puromycin 抗 性 的 载 体 pSUPER 或 pSUPER-p53 共 转 染 ， 结 果 表 明 ， pSUPER 介 导 的 基 因 敲 除 持 续 时 间 较 长 ， 它 的 转录产物对细胞没有毒性。
RNAi
RNAi的研究进展RNA干扰(RNA interference ,RNAi) 现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。
将与靶基因的转录产物mRNA 存在同源互补序列的双链RNA(double strand RNA ,dsRNA) 导入细胞后,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,这一过程属于转录后基因沉默机制( posttranscriptional gene siliencing , PTGS) 范畴。
RNAi 广泛存在于生物界,从低等原核生物,到植物,真菌,无脊椎动物,甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象,只是机制也更为复杂。
一．RNAi的发现早在1990 年进行转基因植物有关研究时偶然发现,将全长或部分基因导入植物细胞后某些内源性基因不能表达,但这些基因的转录并无任何影响,并将这种现象称为基因转录后沉默(posttranscriptional gene silencing ,PTGS) . 1996 年在脉孢菌属(Neurospora) 中发现了相似现象,只不过将这种现象命名为基因表达的阻抑作用(quelling) . 首次发现dsRNA 能够导致基因沉默的线索来源于线虫Caenorhabditis elegans的研究。
1995年康乃尔大学的研究人员Guo 和Kemphues 尝试用反义RNA 去阻断par－1 基因的表达以探讨该基因的功能,结果反义RNA 的确能够阻断par21基因的表达,但是奇怪的是,注入正义链RNA 作为对照,也同样阻断了基因的表达。
这个奇怪的现象直到3年后才被解开——华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire 和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello 首次将双链dsRNA ——正义链和反义链的混合物注入线虫,结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。
实际上每个细胞只要很少几个分子的双链RNA 已经足够完全阻断同源基因的表达。