VEGF_A对人肝癌细胞体外形成血管生成拟态能力的影响
·论著·
VEGF-A对人肝癌细胞体外形成
血管生成拟态能力的影响
李蕊1，孙保存1，2*，孙丹1，刘铁菊1，赵秀兰1，董学易1
（1天津医科大学病理学教研室，天津300070；2天津医科大学肿瘤医院）
摘要：目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）对人肝癌细胞体外形成血管生成拟态（VM）能力的影响。方法
采用不同浓度的VEGF-A诱导人肝癌PLC细胞，分别用划痕实验、明胶酶谱法分析不同浓度VEGF-A对PLC细胞
迁移性和侵袭性的影响；三维培养观察VEGF-A对PLC细胞形成VM能力的影响；Westernblot法检测VEGF-A处
理后的血管内皮钙黏附素（VE-cadherin）表达。结果VEGF-A呈剂量依赖性增强肝癌PLC细胞的迁移率和侵袭
相关蛋白MMP-9的活性，促进管道样结构形成及VE-cadherin表达（P均＜0．05）。VEGF-A水平与管道数量呈正
相关（r=0．929，P＜0．05）。结论VEGF-A可增强肝癌PLC细胞的迁移和侵袭能力，促进其VM形成，使肿瘤组织
血供丰富，促进肿瘤浸润和转移。
关键词：肝肿瘤；血管内皮生长因子；血管生成拟态；明胶酶类
中图分类号：R735．7文献标志码：A文章编号：1002-266X（2011）45-0001-03
EffectsofVEGF-Aonvasculogenicmimicryinhumanhepatocellularcarcinomacellsinvitro
LIRui1，SUNBao-cun，SUNDan，LIUTie-jü，ZHAOXiu-lan，DONGXue-yi
（1DepartmentofPathology，TianjinMedicalUniversity，Tianjin300070，P．R．China）
Abstract：ObjectiveTostudytheeffectsofvascularendothelialgrowthfactor（VEGF）onvasculogenicmimicry
（VM）ofhumanhepatocellularcarcinomacellsinvitro．MethodsHepatocellularcarcinomacellsPLCwereinducedwith
variousconcentrationsofVEGF-A．ThemigrationandinvasionabilitiesofPLCwhentreatedwithvariousconcentrationsof
VEGF-Aweredetectedbywound-healingandGelatinzymographyassay．TheeffectsofVEGF-Aonvasculogenicmimicryin
PLCcellsweredetectedinthree-dimensionalcultures，andtheexpressionsofvascularendothelialcadherin（VE-cadherin）
weredetectedaftertreatedwithVEGF-AbyWesternblot．ResultsVEGF-Acouldenhancetheabilityofthemigration，
andtheactivitiesofinvasion-relatedproteinMMP-9indose-dependentmanner，andalsopromotetheVMformationandthe
expressionofVE-cadherinofPLCcells（P＜0．05）．ThecorrelationbetweenthelevelofVEGF-Aandthequantitiesofthe
pipelineswerepositivesignificantly（r=0．929，P＜0．05）．ConclusionVEGF-Acanpromotethemigration，invasion
andtheabilityofVMformationinthehepatocellularcarcinomacellsPLC，andthenpromotethebloodsupplyoftumor，and
theinvasionandmetastasisoftumor．
Keywords：hepaticneoplasm；vascularendothelialgrowthfactor；vasculogenicmimicry；gelatinases
肝癌是常见恶性肿瘤，因癌细胞血供丰富，易发
生转移，且治疗困难，故肝癌病死率很高。肿瘤血供
除来自内皮依赖性血管外，血管生成拟态（VM）也
是其来源之一。既往研究表明，血管内皮生长因子
（VEGF）与肝癌的复发、转移及预后密切相关。近
年研究发现，肝癌组织中存在VM［1］。目前，关于
VEGF-A对人肝癌细胞体外形成VM能力的影响少
基金项目：国家自然科学基金项目（30830049）；中瑞国际合作项目（09ZCZDSF04400）；天津市科技计划项目（09JCYBJC12100）。*通讯作者见报道，2009～2011年，我们对此进行了相关研究。
现报告如下。
1材料与方法
1．1材料人肝癌细胞系PLC/PRF/5由本研究室
保存；兔抗人VE-cadherin多克隆抗体、β-actin兔抗
人多克隆抗体、VEGF-A购自美国；辣根过氧化物酶
标记山羊抗兔IgG抗体购自北京中杉金桥生物公司。
1．2检测方法
1．2．1细胞培养采用含10%胎牛血清的DMEM
培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养人肝癌细胞
株，细胞长至90%融合时，以0．25%胰酶消化传代。
1山东医药2011年第51卷第45期实验分为正常对照组及VEGF-A10、30、60、100μg/
L实验组。
1．2．2细胞迁移检测将PLC细胞接种于12孔
板，90%融合后，用无菌移液管尖对其表面进行划
痕，PBS冲洗细胞后，更换含5%胎牛血清培养基，
分别加入VEGF-A10、30、60、100μg/L。随机取5
个视野，在倒置显微镜（×100）下观察PLC细胞从
划痕处向中央迁移的情况，分别于0、24、48h测量
划痕距离。
1．2．3明胶酶谱检测用不同浓度VEGF-A干预
PLC细胞48h后，收集上清液行明胶酶谱检测。以
含0．1%明胶的10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，至
溴酚蓝进入阳极缓冲液为止，用2．5%的Trition-
X100洗胶4次，每次30min。将胶浸入明胶酶孵育
液中，37℃孵育42h，最后用考马斯亮蓝R250染
色，脱色液脱色至蓝色背景下可见清晰白色条带，对
降解带密度、面积进行测定，以降解条带密度面积的
乘积表示基质金属蛋白酶（MMPs）活性。
1．2．4三维培养将1cm×1cm盖玻片加入24
孔板底壁，基质胶与细胞培养基以1∶1比例混合后，
取15μl加入盖玻片上，37℃、5%CO2温箱放置1h
使其凝固，再加约含1×105个PLC细胞的完全培养
液500μl。实验组分别加入相应浓度的VEGF-A，
将细胞置入37℃、5%CO2培养箱中培养，在倒置显
微镜下观察其形态变化及管道形成情况。于倒置显
微镜（×200）下随机取5个视野，计数管道数量，取
每个视野的均值，行3次独立实验。
1．2．5VE-cadherin检测采用Westernblot法检
测VE-cadherin，将融合90%以上的各组PLC细胞
用细胞裂解液裂解，分别提取其总蛋白，在10%聚
丙烯酰胺凝胶中电泳。将蛋白电转膜至PVDF膜
上，用5%脱脂奶粉封闭过夜后，分别加入VE-cad-
herin、β-actin，37℃孵育2h；TBST漂洗后与山羊抗
兔IgG抗体反应，37℃孵育90min；TBST漂洗，加
入发光液后显影、定影、拍照，用Image-J软件进行
条带灰度分析。
1．3统计学方法采用SPSS17．0统计软件，数据
以珋x±s表示，多组均数比较用单因素方差分析，两
两比较用q检验，相关分析用Pearson相关分析。P
≤0．05为差异有统计学意义。
2结果
2．1VEGF-A对PLC细胞迁移的影响诱导PLC
细胞24h后，VEGF-A10、30、60、100μg/L组划痕
宽度分别为（0．576±0．005）、（0．475±0．012）、
（0．451±0．007）、（0．397±0．002）mm，正常对照组为（0．695±0．011）mm。VEGF-A组细胞迁移距离
明显高于正常对照组（P均＜0．01），且随VEGF-A
浓度升高而逐渐增加，VEGF-A10、30、60、100μg/L
组两两比较P均＜0．05。48h时VEGF-A60、100
μg/L组划痕损伤愈合。
2．2VEGF-A对PLC细胞MMP-2、MMP-9活性的
影响正常对照组及VEGF-A10、30、60、100μg/L
实验组的MMP-2表达及活性增强均不明显，其
MMP-9表达分别为（88．674±9．798）、（118．792±
10．354）、（128．563±11．987）、（139．997±
12．575）、（150．873±14．161）光密度；正常对照组
与VEGF-A组、VEGF-A组间两两比较，P均＜0．05。
2．3VEGF-A对PLC细胞形态变化及管道形成的
影响倒置显微镜下可见，4h时VEGF-A各组PLC
细胞呈圆形或卵圆形，部分细胞相互连接，有形成管
道的趋势；9h时细胞均形成明显的管道样结构。
而正常对照组均无上述改变。正常对照组及VEGF-
A10、30、60、100μg/L实验组PLC细胞管道数量分
别为（0．000±0．000）、（4．800±0．100）、（7．833±
0．153）、（8．100±0．265）、（13．167±0．513）个/视
野，正常对照组与VEGF-A组、VEGF-A组间两两比
较，P均＜0．05。相关分析显示，VEGF-A浓度与管
道数量之间呈显著正相关（r=0．929，P＜0．05）。
2．4VEGF-A对PLC细胞VE-cadherin表达的影响
见图1。
图1VEGF-A对PLC细胞VE-cadherin表达的影响
注：图中1～5分别为正常对照组及VEGF-A10、30、60、100μg/L组。VEGF-A组与正常对照组，VEGF-A10、30、60、100μg/L组两两比较，P均＜0．053讨论
VM是1999年美国学者Maniotis等［2］发现的独
特的肿瘤血供方式，其特点为恶性肿瘤细胞在无内
皮细胞参与下，通过自身塑形及与细胞外基质作用
形成的可为肿瘤生长、侵袭和转移提供血供的特有
微循环管道，血液在此管道中流动。该管道外周是
一层由厚薄不一的PAS阳性物质构成的基底膜，并
与宿主血管相通，从而使肿瘤细胞获得血供及营养，
以满足其生长；由于构成管壁的肿瘤细胞直接与血
液接触，使脱落的肿瘤细胞易经过血循环流到其他
部位发生转移，故存在VM的肿瘤患者病情进展迅
速，转移早，预后差。目前，在黑色素瘤、乳腺癌［3］、
肝癌等肿瘤的体内外实验中均发现VM现象。
2山东医药2011年第51卷第45期
肝癌患者血液中VEGF-C、VEGF-D和受体VEGFR-3的表达及意义
肝癌患者血液中VEGF-C、VEGF-D和受体VEGFR-3的表达及意义
廖文胜;胡虞乾;何阳阳;李西融;唐澄海;杜延召;李江发
【摘 要】目的 探讨肝细胞性肝癌患者血液中血管内皮生长因子-C(VEGF-C)、血管内皮生长因子-D(VEGF-D)和血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)的表达及意义.方法 以2012年8月～2014年8月经南溪山医院病理科确诊为肝细胞性肝癌的40例患者为肝癌组,以同期10例非肝癌患者为非肝癌组.应用酶联免疫吸附测定法检测患者外周静脉血VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3的表达,统计分析VEGF-C、VEGF-D和受体VEGFR-3的表达与肝癌发生的关系.结果 VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3在肝癌组术前血液中的表达显著高于肝癌组术后和非肝癌组(P＜0.05),并且VEGFR-3的表达与VEGF-C、VEGF-D的表达呈显著正相关(r=0.982、0.975,均P＜0.01).结论 VEGF-C、VEGF-D和受体VEGFR-3在肝细胞性肝癌患者血液中的表达明显增高,其可能与肝癌的发生发展有关.%Objective To explore the
expression and significance of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C),vascular endothelial growth factor-D (VEGF-D) and vascular endothelial
growth factor receptor-3 (VEGFR-3) in the blood of patients with
hepatocellular carcinoma.Methods Forty HCC patients diagnosed at the
Department of Pathology of Nanxishan Hospital from August 2012 to
沙利度胺对人肝癌细胞株SMMC-7721体内外肿瘤血管的影响
医学创新２００９年２月 第６卷第６期Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ．２００９，Ｖｏ１．６ Ｎｏ．６
沙利度胺对人肝癌细胞株ＳＭＭＣ一７７２１
体内外肿瘤血管的影响
孙萍张良明 孙等军董亮亮 ・３・
・论 著・
【摘要】 目的观察沙利度胺对人肝癌细胞株ＳＭＭＣ一７７２１体内外肿瘤血管的影响。方法体外实验：将不
同浓度的沙利度胺作用于人肝癌细胞株ＳＭＭＣ一７７２１，采用ＥＬＩＳＡ方法测定细胞株ＶＥＧＦ分泌量变化。体内实验：
首先建立肝癌细胞株ＳＭＭＣ一７７２１的荷瘤小鼠模型，应用免疫组化测定瘤体组织中微血管密度，ＥＬＩＳＡ法测定小鼠
外周血ＶＥＧＦ表达。结果体外实验中随着沙利度胺药物浓度增加，ＶＥＧＦ含量逐渐下降：沙利度胺浓度从０ ｇ／ｍｌ 升至４Ｏ０ ｔ￣ｇ／ｍｌ，ＶＥＧＦ值由（８３．２１±８．３２）ｐｇ／ｍｌ降至（３３．５９±１０．９８）ｐｇ／ｍｌ；体内实验：成功建立了肝癌细胞株
ＳＭＭＣ～７７２１的荷瘤小鼠模型，沙利度胺组小鼠外周血ＶＥＧＦ含量为（３２．１７ ４－１２．１１）ｐｇ／ｍｌ，对照组为（６９．３５± １７．５６）ｐｇ／ｍｌ，在沙利度胺瘤体中微血管密度值为１３．１７±３．１５，对照组为１８．３４±２．２５，均有显著性差异（Ｐ＜０．０１）。
结论沙利度胺能抑制ＳＭＭＣ一７７２１细胞株及荷瘤鼠肿瘤血管的形成。
【关键词】沙利度胺；人肝癌细胞株ＳＭＭＣ一７７２１；ＶＥＧＦ；ＭＶＤ
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ ｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｇｌｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ ＳＭＭＣ－７７２１ ＳＵＮ ，ＺＨＡＮＧ Ｌｉａｎｇ—
ｍｉｎｇ，ＳＵＮＤｅｎｇ－ｊｕｎ，ＤＯＮＧ Ｌｉａｎｇ—ｌｉａｎｇ．Ｙａｎｔａｉｙｕｈｕａｎｇｄｉｎｇ ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｙａｎｔａｉ ２６４０００，Ｃｈｉｎａ 【Ａｂａｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｅｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ ｏｎ ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｍａ Ｃｅｌｌ ＳＭＭＣ一
EGCG对人肝癌细胞株HepG2裸鼠移植瘤COX-2、VEGF和bFGF表达的调控
第３４卷第３期 ２０１３年５月 中山大学学报（医学科学版） ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＳＵＮ ＹＡＴ－ＳＥＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＭＥＤＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ） Ｖｏ１．３４ Ｎｏ．３ Ｍａｙ．２０１３
ＥＧＣＧ对人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２裸鼠移植瘤ＣＯＸ一２、
ＶＥＧＦ和ｂＦＧＦ表达的调控
周薇ｈ，戴奇刚 ，邓鑫 ，荣孪君 ，王英桂 （广东药学院１．附属第二医院病理科，广东广州５１０３００；２．附属第一医院放疗科，广东广州５１００８０；３．广西中医学院附属瑞 康医院科教科，广西南宁５３００１１）
摘 要：【目的】探讨表没食子儿茶素没食子酸脂ＥＧＣＧ对人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２裸鼠移植瘤生长和肿瘤血管生成的抑 制作用及ＥＧＣＧ对移植瘤环氧合酶一２（ｃｏｘ一２）、血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）和碱性成纤维生长因子（ｂＦＧＦ）表达的调控。【方 法】将肝癌细胞ＨｅｐＧ２种植至裸鼠背部皮下，１０ ｄ后开始用不同浓度ＥＧＣＧ治疗，３８ ｄ后处死。观测裸鼠移植瘤的体积和质 量。并采用间接免疫流式细胞术和Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ法检测移植瘤ＣＯＸ一２、ＶＥＧＦ和ｂＦＧＦ的表达，用免疫组化法检测微血管密度 （ＭＶＤ）。【结果】①生理盐水组切除的移植瘤平均体积和质量分别是（１１７４．６±７９３．５）ｍｍ 和（０．５７２±０．１３８）ｇ，ＥＧＣＧ ５０ ｍｇ／ 组分别为（６４９．３±１００．８）ｍｍｓ和（０．３４０±０．０６６）ｇ，两组比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。ＥＧＣＧ ５０ ｍｇ／ｋｇ组抑瘤率为 ４０．５６％。②生理盐水对照组和ＥＧＣＧ ５０ｍｇ／ｋｇ组的ＭＶＤ值分别为２３．２４￣１．７６和１４．２７￣１．２５，两组差异有统计学意义（Ｐ＜ ０．０１）：间接免疫荧光流式细胞术和Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ检测结果提示ＥＧＣＧ呈浓度依赖性地抑制人肝癌细胞ＨｅｐＧ２移植瘤中 ＣＯＸ一２、ＶＥＧＦ和ｂＦＧＦ的表达。【结论】ＥＧＣＧ具有抑制人肝癌裸鼠移植瘤生长的作用；同时能抑制肝癌移植瘤内新生血管 内皮细胞的生长，其机制可能与抑制ＣＯＸ一２的表达以及由此引起的ＶＥＧＦ和ｂＦＧＦ蛋白表达降低有关。 关键词：ＨｅｐＧ２细胞；裸鼠移植瘤；新生血管生成；ＣＯＸ一２；ＶＥＧＦ；ｂＦＧＦ 中图分类号：Ｒ７３—３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２．３５５４（２０１３）０３—０３６４—０７
加用重组人血管内皮抑素的TACE治疗对肝癌组织VEGF和MVD的影响
・７４４・ ２０１２年８月第１７卷第８期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ａｕｇ ２０１ － ｉ， （Ｊ１． ７， ｏ．
加用重组人血管内皮抑素的ＴＡＣＥ治疗对肝癌组织
ＶＥＧＦ和ＭＶＤ的影响
４１０００５ 长沙 湖南省人民医院介入科 向 华，孙 林
【摘要】 目的探讨经导管肝动脉化疗栓塞（ＴＡＣＥ）中加用抗血管生成约物治疗肝细胞癌（ＨＣＣ）后肝癌一￣＇Ｈ—ｚｚＨ中ＩｆｉＬ管 内皮生长凶子（ＶＥＧＦ）和微血管密度（ＭＶＤ）的变化情况。方法 经确诊的ＨＣＣ患者８５例按照数字表法随机分为ＴＡＣＥ组 （对照组）和ＴＡＣＥ中加用重组人血管内皮抑素组（治疗组）；对照组和治疗组均给予常规化疗栓塞药物，治疗组加用重组人ｍ 管内皮抑素注射液（恩度）３０ｍｇ栓塞；ＴＡＣＥ术当天和第２８天分别穿刺取肿瘤组织，对其进行ＶＥＧＦ和ＭＶＤ的测定。结果 对照组治疗前、后的ＭＶＤ分别为６１．７６±２０．１２和６２．６４±２２．８３（Ｐ＞０．０５），ＶＥＧＦ分别为１２５．９４±７５．４１和１９０．０７±８６－９６ （Ｐ＜０．０１）；治疗组治疗前、后的ＭＶＤ分别为６２．００±２４．１８和５１．４８±１５．７９（Ｐ＜０．０１），ＶＥＧＦ分别为１２７．１０±７７．８１和 ８８．４７±７５．８９（Ｐ＜０．０１）。治疗组和对照组的１年生存率分别为６２．５％（２５／４０）和６１．９％（２６／４２）。结论ＴＡＣＥ能够减少 ＨＣＣ组织内已生成的 管数量，影响ＶＥＧＦ分泌，促进病灶内新生 管生成；ＴＡＣＥ术中栓塞加川恩度能够有效降低ｔｔＣＣ组 织中ＭＶＤ和ＶＥＧＦ表达，增加ＴＡＣＥ抗肿瘤血管生成的效果。 【关键词】 肝细胞癌；重组人血管内皮抑素／恩度； ｆｉｌ１．管内皮生长因子；微 管密度； 经导管肝动脉化疔栓塞 中图分类号：Ｒ７３５．７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９—０４６０（２０１２）０８—０７４４—０５
Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒ ａｒｔｅｒｉａｌ ｃｈｅｍｏｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｌｕｓ ｒｈ－ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ＶＥＧＦ ａｎｄ ＭＶＤ ｉｎ ｈｅｐａｔｏ。
夏枯草硫酸多糖对肝癌血管生成的作用及机制研究
夏枯草硫酸多糖对肝癌血管生成的作用及机制研究
王雅楠;曹蕊;朱聪;吴雄志
【摘 要】目的：观察夏枯草硫酸多糖（PVSP）对肝癌细胞中血管生成因子bFGF，VEGF和IL-8蛋白分泌及肝癌血管生成的影响。方法：ELISA法观察PVSP和香菇多糖（LNT，不含硫酸基，阴性对照）对bFGF、VEGF和IL-8在肝癌细胞中的分泌情况影响；免疫组化法观察PVSP和LNT以及PBS空白对照对肝癌组织微血管密度的影响。结果：同PBS空白对照相比，200μg/mL的PVSP抑制bFGF的分泌（P<0.01），而LNT对bFGF表达无影响。各剂量组的PVSP和LNT对VEGF、IL-8的分泌均无影响。200 mg/kg PVSP能够减少肿瘤组织块中的微血管密度（P=0.03），而LNT 10 mg/kg对肿瘤组织中微血管密度无影响。结论：PVSP对bFGF分泌的抑制作用是其抑制肝癌血管生成的一个可能原因。%Objective:A
study was conducted to investigate the effect of Prunella vulgaris sulfated
polysaccharide (PVSP) on the expression of angiogenic growth factors
(bFGF, VEGF, and IL-8) and angiogenesis in hepatocellular carcinoma.
Methods:ELISA as-say was used to observe the effects of PVSP and the
negative control drug Lentinan (LNT, non-sulfate radical drug) on
secretions of the angiogenic growth factors, namely, bFGF, VEGF, and IL-8,
VEGF及其抑制剂在肿瘤治疗中的研究进展
VEGF及其抑制剂在肿瘤治疗中的研究进展
作者： 薛婷婷 唐艳飞 刘云章
来源：《医学食疗与健康》2019年第09期
[摘要]内皮血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）是一种二聚体糖蛋白，能够刺激内皮细胞的增殖、生存与迁移，在多种肿瘤细胞中均有较高水平的表达。其不仅是肿瘤血管生成过程中最重要的促血管生成因子之一，在肿瘤免疫中也发挥了重要的作用。目前，已有不同类型的VEGF抑制剂被投入临床，用于肿瘤的治疗。本文针对VEGF家族成员、VEGF在肿瘤发生发展中的活性及VEGF相关抑制剂的研究进展进行综述。
[关键词]肿瘤;VEGF;血管生成;肿瘤免疫;抑制剂
[中图分类号]R979.1 [文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2019）15-0280-03
血管生成指已有血管通过出芽或套叠的方式形成新血管的过程，在胚胎发育、伤口愈合等生理过程或糖尿病性视网膜病、肿瘤等病理过程中都发挥着重要的作用。血管生成过程复杂，有许多调控因子参与。其中，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）家族及其受体（VEGFRs），是促进血管细胞分化和血管形成最重要的组织因子。本文主要介绍了VEGF及其受体家族成员、VEGF在肿瘤中的生物活性以及VEGF抑制剂在肿瘤治疗方面的研究进展。
1.VEGF家族成员及其受体
VEGF最初在牛垂体分泌物中被发现，直至1989年，Abraham等人将其分离纯化，并命名为血管生成因子。目前该蛋白家族共发现VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE（病毒编码）以及胎盘生长因子（placentalgrowthfactor，P1GF）几种常见异构体，两种不VEGFl45、VEGFl83常见异构体，以及两种抑制性异构体VEGFl65b、VEGF-Ax，但其抑制机制依然存在争议。VEGFA是一种45KD的同型二聚体糖蛋白，是该家族成员中最具特异性、功能性最强的血管生成因子，即我们通常所说的VEGF。VEGF受体家族有VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3三个成员。同其他受体类似，VEGFR通过结合不同的VEGF，激活自身磷酸化，进而激活下游通路来发挥作用。VEGF主要与VEGFR2结合，参与血管生成的调控，是参与活化促进血管内皮细胞有丝分裂和通透性最主要的信号传导通路。Vegfr2的小鼠胚胎会在8.5-9.5天死亡，并表现出严重的内皮细胞和造血前体细胞发育缺陷，证明该受体在血管发育中至关重要。此外，VEGF还能够与VEGFRl结合。VEGFRl显示弱的配体依赖性自身磷酸化，在某些情况下，它作为诱饵受体起作用，可通过结合VEGF阻止VEGF与VEGFR2结合，抑制血管生成。VEGFRl缺陷小鼠表现出过度生长和血管解体，表明其负调节胚胎发育期间的血管生成。 2.VEGF在肿瘤中的生物活性
熊胆粉对肝癌移植瘤裸鼠血管生成和细胞周期的影响
・６７２・ 世界中西医结合杂志２ｏ１３年第８卷第７期Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１３，Ｖｏ１．８，Ｎｏ．７
熊胆粉对肝癌移植瘤裸鼠血管生成和
细胞周期的影响
赵锦燕 刘丽雅 万芸林薇 曹治云 彭军 洪振丰 ・实验研究－
【摘要】 目的探讨熊胆粉对肝癌移植瘤裸鼠血管生成和细胞周期的影响。方法用人肝癌 ＨｅｐＧ２细胞建立裸鼠移植瘤模型，待皮下移植瘤形成后，将裸鼠随机分为熊胆粉组和对照组，每天分 别给予熊胆粉和生理盐水灌胃，日１次，连续２１ ｄ。３周后剥取肿瘤。逆转录一聚合酶链反应（ＲＴ— ＰＣＲ）检测ｐ２１、细胞周期蛋白依赖激酶２（ＣＤＫ２）、细胞周期蛋白（ＣｙｃｌｉｎＥ）、血管内皮生长因子 （ＶＥＧＦ）、血管内皮生长因子受体（ＶＥＧＦＲ２）ｍＲＮＡ的表达；免疫组化检测ｐ２１、ＣＤＫ２、ＣｙｃｌｉｎＥ、ＶＥＧＦ、 ＶＥＧＦＲ２蛋白表达，并通过ＣＤ３ １表达检测微血管密度（ＭＶＤ）。结果ＭＶＤ结果显示熊胆粉显著抑制 体内微血管的形成，与对照组比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）；ＲＴ—ＰＣＲ和免疫组化结果表明，熊胆 粉显著促进ｐ２１的表达，抑制ＣＤＫ２、ＣｙｃｌｉｎＥ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２的表达，与对照组比较差异有统计学意义 （Ｐ＜０．０１）。结论熊胆粉诱导细胞周期阻滞和抑制血管生成可能是其治疗肝癌的作用机制之一。 【关键词】熊胆粉；肝癌；血管生成；细胞周期 【中图分类号】Ｒ２８５．５；Ｒ７３５．７【文献标识码】Ａ【文章编号】１６７３—６６１３（２０１３）０７—０６７２—０４
Ｉｍｐａｃｔｓ ｏｆ Ｘｉｏｎｇｄａｎｆｅｎ ｏｎ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｕｄｅ Ｍｉｃｅ
ｗｉｔｈ Ｈｅｐａｔｏｍａ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ
ＺＨＡＯ Ｊｉｎ—ｙａｎ，ＬＩＵ Ｌｉ—ｙａ，ＷＡＮ Ｙｕｎ，ＬＩＮ Ｗｅｉ，ＣＡＯ Ｚｈｉ—ｙｕｎ，ＰＥＮＧ Ｊｕｎ，ＨＯＮＧ Ｚｈｅｎ—ｆｅｎｇ （Ｆｕｊｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｆｕｚｈｏｕ Ｆｕｊｉａｎ ３５０１２２） 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔｓ ｏｆ ｘｉｏｎｇｄａｎｆｅｎ ｏｎ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｏｍａ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ．Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｗａｓ ｆｏｒｍｅｄ，ｔｈｅ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍ— ｉｚｅｄ ｉｎｔｏ ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ａ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ．Ｘｉｏｎｇｄａｎｆｅｎ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｓａｌｉｎｅ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｇａｓｔｒｉｃ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｅｖｅｒｙ ｄａｙ，ｏｎｃｅ ａ ｄａｙ，ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ ｆｏｒ ２１ ｄａｙｓ．Ｉｎ ３ ｗｅｅｋｓ，ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｗａｓ ｓｅｐａｒａｔｅｄ． ＲＴ—ＰＣＲ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｐ２１，ＣＤＫ２，ＣｙｃｌｉｎＥ，ＶＥＧＦ ａｎｄ ＶＥＧＦＲ２ ｍＲＮＡ．ＩＨＣ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｐ２１，ＣＤＫ２，ＣｙｃｌｉｎＥ，ＶＥＧＦ ａｎｄ ＶＥＧＦＲ２ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｈｅ ｍｉ— ｃｒｏｖｅｓｓｅｌ ｄｅｎｓｉｔｙ（ＭＶＤ）ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｖｉａ ＣＤ３ １ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＭＶＤ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｘｉｏｎｇｄａｎｆｅｎ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｏｄｙ，ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｓ ｃｏｎ— ｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．ＲＴ—ＰＣＲ ａｎｄ ＩＨＣ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｘｉｏｎｇｄａｎｆｅｎ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｓｉｇ— ｎｉｆｉｅａｎｔｌｙ ｐ２ｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ＣＤＫ２，ＣｙｃｌｉｎＥ，ＶＥＧＦ ａｎｄ ＶＥＧＦＲ２，ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｘｉｏｎｇｄａｎｆｅｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｂｌｏｃｋａｇｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｐｏｓｓｉｂｌｙ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｍａ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｘｉｏｎｇｄａｎｆｅｎ；Ｈｅｐａｔｏｍａ；Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ；Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ
低氧应激对人肝癌细胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9表达的影响
第４２卷第１期 ２０ｌ２年１月 温州医学院学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｗｅｎｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ＶＯ１．４２ ＮＯ．１ Ｊａｎ．２０１２
低氧应激对人肝癌细胞ＡＦＰ、ＶＥＧＦ、ＴＩＭＰ一１、
ＭＭＰ一９表达的影响
吴之浩
（义乌市中心医院普外一科，浙江金华３２２０００） 蠹
［摘要］目的：探讨低氧应激对人肝癌细胞（ＨｅｐＧ一２细胞）甲胎蛋白（ＡＦＰ）、血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）、
金属蛋白酶组织抑制剂（ＴＩＭＰ）一１、基质金属蛋白酶（ＭＭＰ）一９表达的影响。方法：低氧（５％０ 、５％ＣＯ。、 ９０％Ｎ ）和常氧培养ＨｅｐＧ一２细胞。逆转录一多聚酶链式反应技术测定ＨｅｐＧ一２细胞ＡＦＰ、ＶＥＧＦ、ＴＩＭＰ—ｌ、ＭＭＰ一
９ ｍＲＮＡ的表达。酶联免疫吸附法测定ＨｅｐＧ一２细胞培养上清ＶＥＧＦ、ＴＩＭＰ—ｌ、ＭＭＰ一９蛋白含量，放射免疫测定
法测定ＨｅｐＧ一２细胞培养上清ＡＦＰ蛋白含量。结果：低氧组ＡＦＰ、ＶＥＧＦ、ＭＭＰ一９ ｍＲＮＡ和蛋白表达量显著高于
常氧组；ＴＩＭＰ—ｌ ｍＲＮＡ和蛋白表达量显著低于常氧组（尸＜０．Ｏ１）。结论：低氧应激上调人ＨｅｐＧ一２细胞ＡＦＰ、
ＶＥＧＦ、ＭＭＰ一９基因表达，下调ＴＩＭＰ一１基因表达。
［关键词］ 低氧应激；甲胎蛋白；血管内皮生长因子；金属蛋白酶组织抑制剂一ｌ；基质金属蛋白酶一９
［中图分类号］Ｒ３６４．４；Ｒ７３５．７［文献标志码］Ａ［文章编号］ １０００－２１３８（２０１２）０１－００４１—０３
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｙｐｏｘｉａ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ＡＦＰ，ＶＥＧＦ，ＴＩＭＰ－Ｉ ａｎｄ ＭＭＰ－９ ｉｎ ＨｅｐＧ－２ ｃｅｌｌ∥∥
Ｚｈｉｈａｏ．Ｔｈｅ Ｆ１，ｓｔ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ．Ｙ１ｗｕ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ。Ｊｉｎｈｕａ．３２２０００
血管内皮生长因子在消化系肿瘤中的研究进展
・１０８４・
第２２卷第１０期医学研究生学报Ｖ０１．２２Ｎｏ．１０
２００９年１０月ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃａｌＰｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅｓＯｃｔ．２００９
・综述・
血管内皮生长因子在消化系肿瘤中的研究进展
徐伟综述，刘政，季国忠审校
（南京医科大学第二附属医院消化医学中心，江苏南京２１００１１）
摘要：在人类恶性肿瘤中，消化系肿瘤占相当大的比例，并呈不断增加的趋势。新生血管形成很大程度上决定了肿瘤细胞能否转移并导致宿主死亡。血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）是目前发现的活性最强的血管生成因子，可促进内皮细胞增生、迁移及分化，对于实体瘤中新生血管的生成及肿瘤的发展、转移、预后的判断具有十分重要的意义，因而在消化系肿瘤中的研究日渐受到重视。现就ＶＥＧＦ与消化系肿瘤的关系做一综述。关键词：血管内皮生｝乏因子；消化系肿瘤；治疗中图分类号：Ｒ７３５文献标识码：Ａ文章编号：１００８－引９９（２００９）１０—１０８４－０４
ＵｐｄａｔｅｏｆＶＥＧＦｉｎｄｉｇｅｓｔｉｖｅｓｙｓｔｅｍｔｕｍｏｒｓ
ＸＵＷｅｉｒｅｖｉｅｗｉｎｇ，ＬＩＵＺｈｅｎｇ，ＪＩＧｕｏ－ｚｈｏｎｇｃｈｅｃｋｉｎｇ（ＤｅｐａｎｒｎｅｍｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，ｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅ瑙ｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ
２１００１１，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃａｎｃｅｒｓｏｆｔｈｅｄｉｇｅｓｔｉｖｅｓｙｓｔｅｍａｃｃｏｕｎｔｆｏｒａｌａｒｇｅｐｏｒｔｉｏｎｏｆｍａｌｉｇｎａｎｔｔｕｍｏｒｓｉｎｈｕｍａｎｓ，ａｎｄｔｈｅｔｒｅｎｄｉＳｏｎｔｈｅｒｉｓｅ．ＴｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎｉＳｔｈｅｄｏｍｉｎａｎｔｆａｃｔｏｒｉｎｔｈｅｍｅｔａｓｔａｓｉｓｏｆ
ｔｕｍｏｒｓ．ＴｈｅｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｆＶＥＧＦ）ｉｓｗｅｌｌｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄａｓｔｈｅｍｏｓｔｐｏｔｅｎｔｉｎｄｕｃｅｒｏｆ
肝癌组织中VEGF—C、VEGF—D受体VEGFR—3的表达及其相关性分析
肝癌组织中VEGF—C、VEGF—D受体VEGFR—3的表达及其相关性分析
目的 探讨肝癌组织中血管内皮生长因子-C（VEGF-C）、血管内皮生长因子-D（VEGF-D）和血管内皮生长因子受体-3（VEGFR-3）的表达及其在肝癌进展中的作用。 方法 收集2012年8月～2014年8月在广西壮族自治区南溪山医院（以下简称“我院”）住院行手术治疗的40例肝癌患者的癌组织及其无癌癌旁肝脏组织，同时选择我院同期收治的10例血管瘤患者的肝脏组织。采用免疫组织化学方法检测肝脏组织中VEGF-C、VEGF-D和受体VEGFR-3的表达，分析VEGF-C、VEGF-D和受體VEGFR-3表达在肝癌组织中的相关性。 结果 VEGF-C和VEGF-D主要表达于肝癌细胞浆内，它们在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织及正常肝脏组织（P 0.05），具有可比性。
1.2 实验试剂
兔抗人VEGF-C、VEGFR-3多克隆抗体、鼠抗人VEGF-D单克隆抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司；PV-9000二步法免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 实验方法
材料首先经过4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后按照4 μm规格连续切片，之后常规HE染色、免疫组化。SP兔二步法进行免疫组化；VEGF-C抗体进行稀释，其倍数是1∶200；VEGF-D抗体进行稀释，其倍数是1∶400；VEGFR-3抗体进行稀释，其倍数是1∶300；LYVE-1抗体进行稀释，其倍数是1∶100。
1.4 结果判读方法
由我院病理科经验丰富，且不知道受检者任何临床和病理资料的2名专业医师独立对VEGF-C、VEGFR-D和VEGFR-3的免疫组化切片进行判读、评估。首先在低倍镜下（100倍）分别选取瘤周（肿瘤浸润边缘区）和瘤内脉管最丰富的区域，即“热点”；然后在高倍显微镜下（200倍）随机计数5个视野，以其均值作为该病例的LVD计数。原发性肝细胞性肝癌组织选择阳性脉管最丰富区，在200倍视野下计数淋巴管数目，每例计数5个视野，并求其均值。VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3的判断：采用染色指数计数法，参照1996年全国免疫组织化学技术与诊断标准化专题研讨会意见：细胞质或核内见淡黄色细颗粒明显高于背景色为阳性细胞。