AKTA蛋白纯化层析系统操作规程
AKTA蛋白纯化层析系统操作规程
1、使用前，根据自己所要分离蛋白的性质确定所需的分离柱及缓冲液，
打开计算机及仪器，但不要急于打开软件，等计算机与仪器连接再打开软
件，此过程大约需要3-5分钟。
2、将纯水先抽滤脱气（使用≤0.45μm的滤膜），然后选择流路连到机
器上，先洗泵，然后给机器一个流速和压力。选择的最高压力须小于柱子
所能承受的压力极限。
3、将柱子连接到仪器上，接柱子时，须等进液管中的液体出来，将柱
子的一头与进液管通过接头连接，先不要拧的太紧，等液体从柱子的另一
头流出，再用接头将其与出液管相连拧紧，再将进液管端拧紧，这样防止
柱子中进入气泡，影响分离效果。
4、柱子接上后，换上配好的缓冲液（须抽滤脱气）用缓冲液平衡至仪
器的各条基线都平后，再上样。
5、上样时，必须通过滤膜过滤（0.22μm），具体上样体积视样品浓度
而定，采用不同的上样环上样。
6、仪器使用完毕，切记要用纯水清洗泵和柱子，洗柱直至各条基线都
平为止，防止盐和粒子结晶于泵和柱子使机器报废。若长期不用，再用20%
的乙醇清洗系统和柱子,防止泵和柱子生长微生物（这一步非常重要）。
7、仪器的PH计每隔一段时间（一个月）须校准一次。紫外流动池也
需定期清洗（三个月）。
生物技术中心 仪器管理人：李红兵
2006年10月15日
AKTA操作流程
AKTA 操作流程1 洗泵2 pause 或end 换Buffer 34 降速(节约缓冲液) 上样5 end6 Run789降速卸柱子水洗洗泵 降速0.5 装柱子升速洗柱子缓冲液洗 A Buffer100%AKTA预备与注意事项* AKTA与液相的区别，AKTA不能进气泡Hitrap Q 1ml阴离子柱*柱子的再生方法2M NaCl→水→1M NaOH→水1 检查足够量的A 2L，B Buffer 1L, 2M NaCl 1L（平衡洗脱，要多来几次）、水和20%的乙醇、1M NaOH 50ml2 准备Fraction 的试管、2ml离心管3 透析后离心2000g 10min, 然后过滤好自己的样品(如过夜需继续过滤并准备新的离心管装过滤液)4 白纸、笔（记录收集管号）和记号笔（写离心管），纸巾（换柱子用）5 冰盒2个（1个放样品1个放收集好的离心管含酶液）6 一次性滤器和针若干7 1ml 枪和枪盒（如有时需稀释样品8准备一个废液瓶一个小烧杯（取水洗针等）* 设警报压力卸（装）（别人或自己）的柱子，手动操作一定要* 设警报压力有时设错流速* 设警报压力即便没设错流速，由残存的Buffer可能很稠(如75%的酒精或2M NaOH)，造成超过界限压力* 2ml/min的流速一般的离子柱可以承受，可以实时观察柱子压力* 不运行方法，不会吸样口到LOOP环* 方法成熟以后，可用直接用45%的B buffer当A缓冲液* 电导唯一性，第二次调整时可以用B buffer测一下电导* 从样品环上样，一是不经过泵，二是可以用很小的量如用NaOH洗脱时* 换Buffer洗泵，一般先冲泵可以替换缓冲液，这样一跑柱子就是有效的换过的缓冲液，如不洗泵，可以看电导等参数* NaOH最好不要过检测器。
过LOOP环等要用inject模式冲洗包括注射器，或手动冲洗AKTA方法设定[阴离子柱]储液KPB纯化缓冲液A 1L(一般需配2L) (0.01M=10uM)KPB 由0.1M KPB母液稀释纯化缓冲液B 1L由纯化缓冲液A(10uM) + 0.5M KCl称取1*0.5*74.55=37.28g KCl 定容到1L纯化缓冲液A 抽滤2M NaCl 1L称取2*1*58.44=116.88g NaCl 定容到1L 抽滤1M NaOH 50ml称取0.05*1*40=2g NaCl 定容到50ml 抽滤由纯化缓冲液A(10mM) + 0.2M KCl 500ml1M NH4SO4 50mlSuperdex 200 凝胶柱预备与注意事项**0.22um** 准备0.5M NaOH、water、Ethoh20%、缓冲液、样品90个15ml 离心管*设警报压力delta-column pressure*设柱位置* 流速0.5，用水或缓冲液洗LOOP环* 手动End后，要重设报警压* 增加平衡体积，在第二次进样后，就不用平衡了* 目标分子量越小，出现越晚* 降低流速或是增加洗脱体积，可以提高分辨率* 结束时A1→NaOH,B1→water,Aw→ 20%EthohA1 水洗→A1,B1 20%乙醇A V ANT 参数Pump 泵> Flow: 设定系统泵流速> Gradient: 梯度设定> BufferPrep_pH: 使用缓冲液配制功能时，设定pH值> SampleFlow: 设定样品泵流速> PumpWashExplorer: 系统泵清洗，25ml/min，30ml/管> SystemWash: 使用缓冲液配置功能时，清洗系统泵，30ml/min，共洗75mlFlowpath 流路> BufferValveA1: 缓冲选择阀切换> PumpAInlet: A 泵入口三通阀切换> PumpBInlet: B 泵入口三通阀切换> SampleValve: 样品选择阀切换> InjectionValve: 上样阀切换> ColumnPosition: 层析柱位阀切换> FlowDirection: 层析柱流向切换> OutletValve: 收集出口阀切换> InjectionMark: 插入记号Alarm & Mon 报警、检测> WaveLength: 选择监测波长（1-3个）> AutoZeroUV: 紫外吸收校零> Alarm: 设置压力、紫外、电导、pH等报警限> Watch: 监测参数设置，配合方法编辑中的watch功能Frac 收集：> Peak_Frac_Parameters: 计峰收集参数设定> FracCollect_900: 分布收集每管体积> Frac_Stop_900: 停止分别收集> FeedTube: 换管收集> Peak_Fraction: 按峰收集每管体积> Peak_FracStop: 停止计峰收集> OutletFraction: 出口阀每峰分段收集每段体积等设置Others 其它> Block: 调用程序块（只在方法运行时可用）> Next_breakpoint: 跳到下一程序块（只在方法运行时可用）> BufferPrepRecipe: 选择缓冲液配方> Set_Mark: 插入提示语> End_Timer: 设定结束运行时间> Record on/off: 手动运行时开始或结束数据记录疏水柱缓冲液配制**0.22um** 准备0.01 KPB、0.01KPB+ 1M NH4SO4 、样品90个15ml 离心管**0.01KPB+ 1M NH4SO4 溶液中，NH4SO4太多，容易蛋白质溶液在跑的过程中析出赌柱子，NH4SO4太低则疏水吸附力减弱**与离子柱相反先用0.01KPB+ 1M NH4SO4高盐洗 0.01 KPB高效液相色谱色谱柱的清洗程序反相: 乙腈-水(5:95) 10倍体积(非盐流动相可省略) *不低于20min* 梯度到乙腈-水( 95:5) , 冲10倍体积柱无梯度功能系统中间增加5倍柱体积乙腈-水(50:50)冲洗步骤正相: 乙腈-正己烷(1:99) 10倍柱体积流动相10mM KH2PO4.H3PO4 buffer(pH2.9) + acetonitrile ( 2:1 v/v)烟腈反应终浓度20mM反应总体积500ul10ul 上清+ (440超纯水+ 50ul 200mM的母液)490ul烟腈,反应20min 取100ul与100ul乙腈（分析纯）混合上样尼克酰胺标样。
AKTA avant操作步骤
AKTA avant操作步骤1 实验前准备过膜的超纯水过膜的20%乙醇过膜的0.5M NaOH过膜的样品剪好的1.5mL EP管1mL、2mL、5mL注射器2 多肽的纯化2.1开机打开仪器开关；打开电脑，等待几分钟后，仪器界面显示Ready；打开软件，avant1的密码：defaultss，avant2、3、4的密码：default；在System control模块中点击，弹出Connect to System对话框，default前勾选，点OK，仪器和电脑联机2.2内置收集器的准备注：齿轮条码向外放置（System control模块→View→ Fraction collector content）2.3水洗泵和管路将入口管A1和B1浸入超纯水中→System control模块→Manual→弹出Manual instructions → Pump and pressure→ Pump wash→ Inlet A：A1；Inlet B：B1；Buffer Pro/Q inlet：off；Sample inlet：off(此处无需特别去设置) → Insert→ Execute→置换管路中的20%乙醇→水洗平衡10min（没有固定时间，基本上冲到UV_280和cond线平衡了，就可以停止了）后，手动停止；水洗了之后，还要再用B液洗去B管路中的水，因此将入口管B1浸入B液中→System control模块→Manual→弹出Manual instructions → Pump and pressure→ Pump wash→ Inlet B：B1；→ Insert→ Execute→置换管路中的水→平衡到UV_280和cond线平衡，手动停止。
注意，凝胶柱只需要一种缓冲液，B管路就不需要管，不需要水洗，不需要缓冲液洗，只洗A管路。
2.4 手动上样将2mL上样环与loop E和loop F相连；采用注射器与鲁尔接口相连，大于2mL超纯水（体积至少大于上样环两倍体积）清洗上样环（注：水中不可有气泡）；将排除气泡的样品用注射器注入上样环中（注：注射器不可拔出，不可有气泡）；2.5 层析柱的准备与连接（这步习惯称为五个参数！）System control模块→Manual→ Manual instructions→Alarms→ Alarm pre-pressure：5.0 MPa→ Insert→Alarms→ Alarm delta-pressure：1.8 MPa→ Insert→Pump and pressure → system flow：1mL/min→ Insert→Flow path→ Column position→ Position：position 3.→ Insert→Flow path→ Inlet A→ Position：A→ Insert→ Execute连接柱子：待管路中气泡排出→A口与柱子上端连接→水从柱子下端流出后，与排气泡后的B口相连）2.6 编辑方法Method Editor模块→File→ New Method→弹出New Method界面→Predefined Method→Gel Filtration（凝胶层析）→OKMethod settings → Column type: Superdex Peptide 10/300GL→ Column position: Position 3→Flow rate：1mL/min→ UV：220 nm（蛋白吸收峰是280nm，多肽不一样？）Equilibration（层析柱）→ Flow rate: 1mL/min → Equilibrate until：the total volume is 2 CVSample Application（上样）→ Flow rate: 1mL/min →Inject sample from loop→ Fill loop using: Manual load→ Loop type: Capillary loop→ Empty loop with: 4 mL→Fractionate→ in waste (do not collect)（第一次纯化的话，最好都收集）Column Wash（去除结合的非特异性肽）→ Wash until the total volume is 2 CV→Fractionate→ in waste (do not collect) Elution（目标物）→ Flow rate：1mL/min →Gradient elution→Linear→Target B 100%→length：2 CV （洗脱两倍柱体积可能有点少。
AKTAexplorer100 操作入门
AKTAexplorer层析系统操作入门为使用户在较短时间内尽快了解AKTA系列层析系统的功能和基本操作，特编写此操作入门。
若需进一步了解详细内容，可参阅相应的组件、系统和软件说明书。
一系统组件及系统功能介绍1 系统组件(1) 泵 Pump系统泵：(system pump)双泵（A、B泵），缓冲液及大体积样品输送。
上样泵：(sample pump)样品输送。
(2) 阀 Valve三通阀：(SV-903)两个。
分别位于两个系统泵前，用于缓冲液输送管道(A1/A2, B1/B2)切换。
七通阀：(INV-907)两个。
1. 上样阀(sample valve)，用于上样环切换 (load/inject) 和系统泵清洗时废液管 (waste) 切换；2. 流向切换阀(flow direction valve)，用于层析柱流向切换(downflow/upflow)。
八通阀：(一个IV-908位于泵前，低压阀门；四个PV-908，位于泵后，高压阀门)共五个。
1. 缓冲液选择阀(buffer valve A1)，通过A1管可选择八个不同缓冲液；2. 样品选择阀(sample valve)，可选择7个上样样品；3. 柱位阀(column position)，两个，同时切换可选择七个柱位；4. 出口阀(outlet valve)，选择收集出口。
(3) 收集器 Fraction分段收集。
(4) 其它组件梯度混合器(mixer)、柱前过滤器(on line filter)、紫外检测仪(UV-900) 、pH 电导仪 (pH/C-900 内含温度计)等。
2 系统功能系统功能由上述各组件相互配合，协同工作。
(1) 缓冲液pH及梯度配制(a)梯度制备 (Gradient)A、B泵分别放置A、B液，由A、B泵的流速变化产生梯度。
(b)自动缓冲液pH及梯度制备 (BufferPrep)根据所用缓冲液配方，分别将A1、A2、B1、B2放入相应的溶液，由A泵及其三通阀调配缓冲pH，由B泵及其三通阀调配梯度。
AKTA purifier 全自动层析仪操作规程
ÄKTApurifier全自动层析仪操作规程1.开机打开主机和电脑电源，待仪器自检完毕（CU950上面的3个指示灯完全点亮不闪烁），双击桌面上UNICORN图标，进入操作界面。
2. 准备流动相和样品所有的工作溶液和样品必须经过0.45µm的滤膜过滤，样品也可高速离心后取上清备用。
当缓冲液中含有有机溶剂（如乙腈、甲醇），需在使用前用低频超声脱气10min。
3.清洗管道及装柱3.1 首先将A1管道放入平衡液或banding buffering中，将B1管道放入高盐溶液中或elutionbuffering中，在system control窗口点击manual→pump→pump wash basic，选中A1,B1管道为ON， execute。
泵清洗程序会自动运行结束。
3.2 选择manual→pump→flow rate，输入流速1ml/ml，insert；选择manual→Alarm&mon→alarm pressure，设置high alarm（输入填料的耐受压力，可在填料说明书中查到），insert，execute。
将进样阀的1号位管道接入柱子的柱头，稍微拧紧后将柱下端的堵头卸掉，直接拧入紫外流动池或连接管道。
4.手动运行4.1 平衡柱子平衡好了（观察电导COND，pH的数值正确曲线走稳了）。
此时将紫外调零，选择manual→Alarm&mon→autozero，exectue，就准备上样了。
4.2 上样4.2.1 用样品环上，将样品吸进注射器，推掉气泡，从进样阀的3号位推入（进样量不得低于样品环的体积的2倍），不要取下注射器。
选择manual→flowpath→injectionValve→inject，execute。
4.2.2 用样品泵上样（AKTAexplorer系统），将样品置于Sample Valve 1号位（可以选8个不同的位置），点击manual→pump→Direct Load_960输入进样流速和体积，execute。
蛋白质层析纯化系统安全操作保养规程
蛋白质层析纯化系统安全操作保养规程1. 前言蛋白质层析纯化系统安全操作保养规程旨在规范蛋白质层析纯化系统的操作和保养，确保系统正常运行，保障实验安全。
本规程适用于蛋白质层析纯化实验室的操作人员和管理人员。
2. 蛋白质层析纯化系统的安全操作2.1 系统操作前的准备工作1.确认实验目的和实验计划，了解样品来源、性质、含量、组成等信息；2.确认实验条件和实验仪器的使用方法；3.打开实验室门窗，保持良好通风；4.戴上实验手套和实验眼镜。
2.2 系统操作中的注意事项1.样品注入前，应该检查仪器本身的完好情况，检查样品是否净化充分；2.样品注入时，应该确保注入量不超过所使用的柱的容量，防止样品溢出；3.开始运行仪器时，应该确保仪器连接正常、操作正确；4.实验中应该时刻关注仪器的运转状态，以便于及时处理异常情况；5.实验结束后，应该关闭仪器、清洗仪器、排空管子，彻底清理实验室。
2.3 系统操作中的安全措施1.对操作人员进行培训，了解仪器的所有安全措施；2.安装防护设备，警示标志等，以确保实验室的安全；3.在操作仪器时应该穿戴戴实验手套和实验眼镜等防护装备，避免有害物质的接触；4.在紧急情况下，应该立即停止工作，并采取相应的应对措施。
3. 蛋白质层析纯化系统的保养规程3.1 仪器保养1.每次使用结束后清洗仪器；2.定期检查仪器的功能和状态；3.定期清理计算机缓存，防止系统死机；4.定期更换废弃的试剂，避免影响仪器正常使用。
3.2 实验室保养1.定期清洗实验台面，确保实验环境干净卫生；2.定期检修水源，确保水质符合实验要求；3.定期更换老化的仪器配件，确保仪器的完好性。
4. 总结蛋白质层析纯化系统是非常重要的生物实验仪器，操作人员应该重视仪器的安全以及保养工作。
本规程的实施，不仅能够保证实验数据的准确性，更能够保障操作人员的安全。
在实验室工作中，我们应该时刻牢记实验安全第一，并严格按照规程开展实验工作。
AKTA操作流程
离子强度的改变，有机溶剂的存在，温度和pH（尤其在等电点， 没有表面净电荷时）都能影响蛋白质结构和溶解度
盐浓度逐步的降低，样品组分根据疏水性的依次洗脱
层析柱料平衡及上样
分步洗脱及清洗
反相层析
反相色谱(reverse phase chromatography ，RPC)
所提供的标准混合器大小为 1.4 ml 也可选择 0.6 ml 和 5 ml 混合器 对于更高流速或难以混合的缓冲液需要更大的混合器
A B管混合 混合池
混合池滤膜的换置
样品环或 Superloop ™的各种上样技术 也可以使用选配的样品泵或系统泵直接把 样品上样到层析柱上
进样管（4）
柱位阀（柱阀口上A下B）
调整积分处理窗口
可对峰命名
实验前后注意事项
实验前准备：系统管道水清洗
实验前准备：缓冲液清洗
实验前准备：pH校准
实验前准备：收集器准备
放置对应盘架，齿轮条码对外
实验前准备：水清洗、缓冲液润洗上样管道
实验前准备：接层析柱并设定相应参数
实验后维护：管道去离子水泵洗
试验后准备：20%乙醇泵洗并保存
电导检测器，pH计
电导检测器用于监测缓冲液和样品的电导率，在线检测真 实的梯度 电导检测器整合温度传感器，可以校正由温度 引起的电导率的变化
在安装有pH电极的阀上直接注射校正液，可以轻松地进行 pH 计校正 限流器连接在 pH 阀上，在管路中产生反压，防止在紫外 流动池中形成气泡
单出口控制阀 V9-Os 可以连接收集器并具有一个额外出口， 可用于流穿组分的收集 多出口收集阀V9-O 能够连接多个收集器，而且有 10 个出 口可以进行大体积组分的收集
AKTApurifier操作入门
欢迎阅读AKTApurifier层析系统操作入门为使用户在较短时间内尽快了解AKTA系列层析系统的功能和基本操作，特编写此操作入门。
若需进一步了解详细内容，可参阅相应的组件、系统和软件说明书。
一系统组件及系统功能介绍1系统组件(1)泵Pump(2)阀(3)(4)pH电导仪2(1)(a)梯度制备(Gradient)A、B泵分别放置A、B液，由A、B泵的流速变化产生梯度。
(b)自动缓冲液pH及梯度制备(BufferPrep)根据所用缓冲液配方，分别将A1、A2、B1、B2放入相应的溶液，由A泵及其三通阀调配缓冲pH，由B泵及其三通阀调配梯度。
(2)上样上样阀上样：将样品经进样阀3号口注入储存在样品环(Sampleloop)内，再由阀门切换将样品带入层析柱；系统泵上样：由三通阀选择进样管道，由系统泵将样品泵入层析柱。
(4)收集收集器收集：设置收集体积(Fracsize)，可自动按条件收集。
出口阀收集：按需要选择不同出口管收集。
二开机程序1开启电脑；2打开AKTApurifier电源；3启动UNICORN软件，输入用户名(Username)和密码(Password)，默认用户三；四系统控制(SystemContral)1手动操作(Manual)1.1手动操作命令简介(1)Pump泵Flow:设定系统泵流速Gradient:梯度设定BufferPrep_pH:使用缓冲液配制功能时，设定pH值SampleFlow:设定样品泵流速PumpWashpurfier:系统泵清洗(2)Flowpath流路PumpAInlet:A泵入口三通阀切换PumpBInlet:B泵入口三通阀切换InjectionValve:上样阀切换OutletValve:收集出口阀切换InjectionMark:插入记号(3)Alarm&Mon报警、检测WaveLength:选择监测波长（1-3个）(4)FracBufferPrepRecipe:选择缓冲液配方Set_Mark:插入提示语End_Timer:设定结束运行时间Recordon/off:手动运行时开始或结束数据记录1.2手动操作示例(1)梯度洗脱设定流速、梯度、柱位、收集方法后即可运行。
AK蛋白纯化系统操作
A K蛋白纯化系统操作 Modified by JACK on the afternoon of December 26, 2020AKTA蛋白纯化系统操作AKTA蛋白纯化系统是当前蛋白纯化工作经常用到的一组设备，自动化程度很高。
AKTA系统依据不同的配置，可以分为AKTA EXPLORER、AKTA PILOT、AKTA PURIFIER等多种型号的设备。
以下以AKTA EXPLORER为例简单介绍AKTA蛋白纯化系统的一般操作。
1、认识AKTA。
AKTA explorer 是为方法开拓及研究应用而设计的全自动液相色谱系统。
该色谱系统的分离装置有三个主要组件，在底部平台的左侧整齐堆起（Fig 1）。
它们是：FIG 1、AKTA EXPLORER主机Pump-900 为双通道高效梯度泵系列。
在AKTAexplorer 100，流速范围ml/min，压力高达10 Mpa（泵名为P-901）。
在AKTA explore10，流速范围ml/min，压力高达25 Mpa（泵名为P-903）。
Monitor UV-900，同时监控190－700 nm 范围内高达3 个波长的多波长紫外-可见（UV-Vis）监测器。
（针对部分AKTA PURIFIER机型，尚有UPC-900监测器可供选择，光源为汞灯光源，一次可以监控一个波长，安装滤光片后，可以在选择的波长范围内进行切换。
）Monitor pH/C-900，在线电导和pH 监测的组合监测器。
Fig 2、AKTA EXPLORER硬件模式图AKTA EXPLORER系统的主要组成部件可以用模式图表示（Fig 2）。
组成部件，如混合器、柱及不同的阀安装在右边部分。
打开装阀的门可全部看到。
柱被挂在装阀的门的外侧。
分离装置由UNICORN 软件控制。
软件安装于一独立的电脑主机之中，在电脑与色谱系统之间的通信由数据采集装置CU950进行控制。
2、一般操作开机按位于底部平台前左侧的ON/OFF 按钮，打开色谱系统，然后打开电脑电源。
AKTA purify 10使用流程
Ni柱纯化His标签蛋白（5ml柱）1.打开AKTA电源，系统自检，打开电脑电源，启动Unicorn软件。
用户名选择default，密码输入default。
2.弹出4个窗口，Unicorn Main Menu窗口出现在屏幕上。
另外三个模块：Method Editor 用于建立新方法；System Control用于运行程序；Evaluation求值结果。
3.进入system control界面，Manual下拉框中选择pump，选择PumpWashBasic命令，同时选择A、B泵，保证两个泵头均在液面（纯水）下，Execute执行，对泵头和管路进行清洗。
4.Manual下拉框中选择pump，设置流速3ml/min。
5.Pause暂停，将层析柱接入系统，上端不要拧紧，将下端接入柱位阀的对应位置，将下端拧紧后再将上端拧紧。
6.Continue调整一个较小流速如0.8ml/min清洗层析柱，End。
（注：FlowRate最大与柱体积相等。
）7.将两泵头从纯水中拿出，1A管泵头放入buffer A中，1B管泵头放入buffer B中。
8.Manual下拉框中选择pump，选择PumpWashBasic命令，Pump B on先洗B泵。
B泵自动关掉后，再选择Pump B off，Pump A on，清洗A泵，使管路中充满buffer A。
9.清洗完A、B泵后，调整流速Flow 3ml/min，用buffer A 平衡。
10.平衡至3倍柱体积后（电导、pH数值和变化趋势稳定），Manual下拉pump中，选择Alams&Mon，选择AutozeroUV校零。
11.Pause暂停，上样，将A泵头放入样品溶液中。
（样品最好放在圆底离心管中。
）12.Continue（或者End重新开始）。
待样品注入完毕，将A泵头拿出在水中清洗一下后再放入buffer A中。
13.当UV曲线降至20-30时，在manual中选择pump →Gradient 10% B。
蛋白质纯化层析设备操作流程
蛋白质纯化层析设备操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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