绿色木霉固态发酵纤维素酶生物量的测定及发酵培养基的初步优化
绿色木霉T4的固体发酵工艺及其制剂稳定性的研究
１ ４ １ 碳源对绿 色木霉 Ｔ４产孢 的影 响 ． ． 以麸 皮 为 基 质 ， 酵 母 膏 １ 、 以 ＫＨ。 Ｏ ‰ 、 Ｐ ３
加额外 营养成分 的 固态发 酵 方式 ， 行 单 因素 和 正交 进
实验研究 ， 探索绿 色木霉 Ｔ４产孢 的最佳 发 酵工 艺 ， 并 对其孢子 的贮存 稳定性 和对高温 的抗逆性 进行 系统分 析， 以期 为绿 色木 霉 Ｔ４菌 株 的 规模 生 产 和 应用 提供
后， 用血 球计数板 计数 ， 重 复 。用 常压 干燥 法测 定 ３个
发酵产物 的含水 量 ｗ ， 算 孢 子 产量 ［ ・（ 计 个 ｇ干培 养
物） ］ 。
１ ４ 固体 发 酵 工 艺 优 化 ．
有较大 的商业化 潜力 。由于不 同的木霉 菌株具 有不 同
的产孢 特性 ， 在此 借鉴 了其它木 霉 的培养条件 ， 采取 添
防有 益茵 ， 多种土传 病原菌 具有抑 制作用 ， 对 其作 用机
制已得到广 泛深 人 的研究 ＿ ， 是 其 大规 模 的生 产 技 １但 ］
术研究较 少 。 目前 生 产 的木 霉 菌 剂 多 为 分 生 孢 子 制 剂， 通常采 用固体 发酵或液 固两相 发酵生 产 ， 孢子 产量
常被作为衡 量发酵优 劣 的重 要指标 ＿ 。固态 发酵 目前 ２ Ｊ 被认 为是 通 过气 生 菌 丝 获 得 大量 真菌 孢 子 的最 好 方
物 防治 ， 在农业 生产 中起着 越 来越 重 要 的作 用 。木 霉 菌 （ ｒｃｏ ｅｍ ｐ ． 是 一类具有 重要 经济意 义 的生 Ｔ ｉｈ ｄ ｒ ａ ｓｐ ）
技术支 持 。
ｌ 实验
１ １ 供 试菌种 ． 生 防菌绿 色木霉 （ ． ｉ ｄ ） ４由华 东理工大 学生 丁 ｖｒ ｅＴ ｉ 物反应器 工程 国家重 点 实验 室 筛选 并 保存 ， 在斜 面上 ２ ℃培养 ７ｄ 用无菌 水洗 出分生孢 子 ， ８ ， 无菌纱 网过 滤除 去菌丝后 ， 稀释至 １ Ｏ个孢子 ・ ×１ ｍＩ ～。 １ ２ 培养 方法 ．
绿色木霉ZY-1固态发酵产纤维素酶
绿色木霉ZY-1固态发酵产纤维素酶于莹;姚日生;齐本坤;朱慧霞【期刊名称】《生物加工过程》【年(卷),期】2009(7)1【摘要】利用筛选的绿色木霉ZY-1(Trichoderma viride ZY-1)固态发酵产纤维素酶,采用稻草和麸皮为底物,考察稻草与麸皮比例随发酵时间对产酶的影响.结果表明:底物中,在m(稻草):m(麸皮)为0:5和1:4时,发酵48 h,pH保持4.5左右,还原糖量急剧上升,胞外蛋白产量最低;仅以稻草作底物时,整个发酵过程中pH约为7,还原糖量最低,胞外蛋白产量较高而滤纸酶活、羧甲基纤维素酶(CMCase)和β-葡萄糖苷酶(β-Gase)酶活均较低;在m(稻草):m(麸皮)为3:2时,发酵96 h,滤纸酶活达最大值5.01 U/g干曲;m(稻草):m(麸皮)为1:4时,发酵96 h,β-Gase酶活达最大值4.6U/g干曲;m(稻草):m(麸皮)为4:1时,发酵72 h,CMCase酶活达最大值6.01 U/g 干曲.因此,底物中存在适量的稻草和麸皮有利于Trichoderma viride ZY-1产纤维素酶.【总页数】5页(P54-58)【作者】于莹;姚日生;齐本坤;朱慧霞【作者单位】合肥工业大学,化学工程学院,合肥,230009;合肥工业大学,化学工程学院,合肥,230009;合肥工业大学,农产品生物化工教育部工程研究中心,合肥,230009;合肥工业大学,化学工程学院,合肥,230009;合肥工业大学,化学工程学院,合肥,230009;合肥工业大学,农产品生物化工教育部工程研究中心,合肥,230009【正文语种】中文【中图分类】Q539.3【相关文献】1.绿色木霉-M1固态发酵产纤维素酶条件研究 [J], 李杰;王景胜;肖连冬;程爽2.绿色木霉固态发酵产纤维素酶条件研究 [J], 陈莉3.绿色木霉JD-1固态发酵玉米芯产纤维素酶条件优化 [J], 武金霞;武建;朱晓;张贺迎4.绿色木霉Sn-9106固态发酵中药残渣产纤维素酶研究 [J], 杜晓兵;郭龙伟;阚国仕;任大明;陈红漫5.绿色木霉的选育及固态发酵产纤维素酶的研究 [J], 梅炼;张爱萍;徐晓立;谢君因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
纤维素酶高产菌的分离筛选与培养基优化
纤维素酶高产菌的分离筛选与培养基优化李荣杰（安徽丰原集团有限公司，安徽蚌埠233010）摘要：以纤维素粉为惟一碳源，从取自某木材公司木材堆放处的土样中筛选出92株能够分解纤维素的菌株，采用刚果红鉴别培养基进行鉴定，选取透明圈较大的菌株10株进行液体培养，并测定它们的酶活，获得一株酶活高的里氏木霉FYFJ928，其发酵水平为8.3IU/mL 。
进一步研究培养基组分及培养条件对里氏木霉FYFJ928摇瓶发酵产纤维素酶的影响，在培养温度28℃，转速为200r/min 条件下进行培养，其最佳培养基组成：0.5%酵母粉，0.06%硫酸镁，0.5%磷酸二氢钠，2%葡萄糖，2%玉米浆，0.5%硫酸铵和8%纤维素粉，培养6d 后，其发酵水平可达到15.6IU/mL ，比优化前提高了近1倍。
关键词：里氏木霉；筛选；纤维素酶中图分类号：Q939.5文献标识码：A文章顺序编号：1672-5190（2009）06-0009-03Isolation of High Producing Cellulase Strain and Its Culture Medium OptimizationLI Rong-jie（Anhui Fengyuan Co.,Ltd.,Bengbu 233010,China ）Abstract ：The 92strains of cellulose-decomposing microorganisms were isolated from soil with timber plant stacked,ten colonies with distinct red zones were selected from them by congo red agar medium.By measuring the enzyme activity of liquid culture filtrates ，A strain （Trichoderma reesei FYFJ928）was obtained with higher cellulase activity ，and the filter paper enzyme （FPA ）was 8.3IU/mL.T.reesei was cultured in different medium to study the ability of producing cellulase at 28℃with rotate speed at 200r/min.The optimum medium was determined as follows:0.5%yeast extract,0.06%MgSO 4,0.5%NaH 2PO 4,2%glucose,2%corn steep liquor,0.5%（NH 4）2SO 4and 8%cellulose powder,the FPA was 15.8IU/mL under the optimized culture medium after cultured for 6days ．Key words ：Trichoderma reesei ;screening;Cellulase纤维素是自然界中含量最丰富的碳水化合物，是一类可再生的资源和能源。
培养条件对绿色木霉发酵生产纤维素酶的影响
Ｊ ｅ ｇ ｈ ｎ Ｌ Ｎ ａ １Ｇ ｎ ｓ ｅ ｇ， Ｉ Ｘｕ ｎ，Ｃ Ｏ Ａ
，Ｚ ＨＵ ｈ ｎ Ｃ ａ
（ｃｏｌ ｆ ｉｌ ｙａｄＥ ｖｏ ｍ ｎ ｎ ． ｉｎｓ ｎｖｒｔ ｏ ｃ ｎｅａｄＴｃ ｎｌ ， ｈ ｎａｇＪａｇｕ２２０ ，Ｃ ｉａ Ｓｈｏ ｏｏ ｎ ｎｉ ｎ ｅｔＥ ｇ ，Ｊ ｇｕＵ ｉ ｓｙ ｆＳｉ ｃ ｎ ｅｈｏｏ Ｚ ｅｊ ｎ ｉ ｓ １０３ ｈｎ ） ｏＢ ｇ ｒ ａ ｅ ｉ ｅ ｙ ｇ ｉ ｎ
中 图分类 号 ： Ｑ ２ Ｔ９５ 文献标识码 ： Ａ
Ｅｆｅ ｔ ｆ Ｃｕ ｔｖａ ｉ ｎ ｉｉ ｎ ｎ Ｃｅ ｌ ａ ｅ Ｐｒ ｄ ｔｏ ｆ ｃ ｓ ｏ ｌｉ ｔｏｎ Ｃｏ ｄ ｔｏ ｏ ｌ ｕｃ ｓ ｏ ｕｃ ｉ ｎ ｂ ｉ ｈ ｄ ｒ ｒｄｅ ｙ Ｔｒｃ ｏ ｅ ｍａ Ｖｉｉ
Ｋｅ ｒ ｙ ｗｏ ｄｓ：ｃ ｌ ｒ ｏ ｄ ｔ ｎ； Ｔ ｉｈ ｄ ｒ ｉｉ ｅ ｅｌ ｌｓ ｕｔ ｅ ｃ ｎ ｉ ｏ ｕ ｉ ｒｃ ｏ ｅ ｍａ ｖｒｄ ；ｃ ｌｕ ａ ｅ
０ 引 言
纤维素是植物细胞壁的主要成 分 ， 占植 物体 干重 的 ３．％ ～５． ％ ， ３４ ００ 是地 球上 最丰 富 的可 再生 资源 。 纤维素酶 可将这类物质分解转化成 葡 萄 糖 ， 进一 步发酵生成酒精等能源 物质 ， 福人类 。但 由于纤维 素酶 造 活低而成本高等原 因， 以仅有一小 部 分 纤 维素被纤 维素酶分解利用 ， 所 而绝 大部分纤 维 素被废弃 … 。因此 为 了更好地开发利用纤维素资源 ， 多 国 内外 学者 都致力 于纤 维素酶 的研究 。而且 ， 许 纤维 素酶 在轻工 业 ， 如造纸 、 品、 食 饲料 、 环保等领域 的应 用 正 日益 广泛 ， 巨大 。然而迄今 为止 ， 潜力 纤维素 酶活 和产 率均较 低 ，
响应面法优化康宁木霉产纤维素酶固态发酵培养基
摘
要 ： 用响应 面 法试验设 计 ， 康 宁木 霉 （ ｒｃ ｏ ｅｍａｋ ｎｇ ｉ 固态发 酵 玉米 皮 生产 纤 维素 采 对 Ｔ ｉ ｄ ｒ ｏ ｉｉ） ｈ
酶 的 条 件 进 行 了优 化 ， 建 立 了 纤 维 素 酶 随 麸 皮 添 加 量 、 料 初 始 水 分 质 量 分 数 和 Ｐ 值 变化 的 二 并 物 Ｈ
ＣＨＥＮ ａ ～ ｉｇ 一， Ｓ Ｘｉｏ ｐｎ ＵＮ ｕ ｂ ｏ ～， Ｆ — ａ
ＣＨＥＮ ａ — Ｕ ～， Ｘｉｏ Ｘ
Ｚ ＡＮＧ ｉｎ ｈ ａ～， Ｈ Ｊａ — ｕ
Ｚ ＡＮＧ ｏ ｇ ｊ ｎ ． Ｍ ＡＯ ｈ ｎ — ｕ ， Ｈ Ｈ ｎ —ｉ ａ Ｚ ｏ ｇ ｇ ｉ １ ２
ｄ Ｌ磷 酸二 氢钾 ，． ／ Ｌ硫 酸镁 ，． ／ Ｌ乳 糖 ； 始 水分 质 量分 数 ５ ． ； Ｈ ５ ５ ０ １ｇ ｄ ０ ２ｇ ｄ 初 ８ ６ ｐ ． 。在 此条 件 下发酵 １ ０ｈ 滤纸 酶活 达到 ｌ ． Ｕ／ ， 未优化 前提 高 了 ２ ９倍 。 ２ ， １３Ｉ ｇ 较 ． 关 键词 ：康 宁木霉 ； 固态发 酵 ； 纤维 素酶 ； 响应 面法 ； 培养 基优 化 中图分类 号 ： １ ． ５ Ｓ ８ ６ ３ 文 献标识 码 ：Ａ
纤维素霉的固态培养及酶活力的测定(学生实验指导)
专业实验：纤维素酶的固态发酵及酶活力的测定一、实验目的：1.学习固态发酵生产纤维素酶的方法；2.掌握纤维素酶测定的方法；3.了解不同条件对纤维素酶活力的影响。
二、实验原理纤维素是地球上含量最丰富的有机化合物。
据不完全统计，全球每年通过光合作用产生的纤维素最高达1. 7 亿t。
其中大部分尚未被合理利用。
目前，我国约有一半以上的农作物秸秆在田间地头被白白烧掉。
可见，利用纤维素酶水解农作物秸秆等废弃物，使其转化为酒精、粮食和化学制品，具有巨大的经济价值和现实意义。
纤维素酶能将天然纤维素降解，生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖，然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下，另一方面，纤维素酶多是采用纯的纤维素粉、无机盐等配制而成的培养基进行液态发酵，对培养基要求高，酶系不全且易造成环境污染等问题，在实际进行大规模生产纤维素酶中还有较多困难。
利用廉价的原料，采用固态发酵技术，可望有助于进一步降低纤维素酶的生产成本。
三、实验材料和仪器1、材料：麸皮（麸皮粉碎，过1 mm筛）；滤纸；产纤维素霉菌种；酒精（95％）；浓硫酸；蛋白胨；羧甲基纤维素钠；NH4NO3；酵母膏；刚果红；3，5-二硝基水杨酸，乙酸等。
（1）菌种保藏培养基，PDA琼脂。
（2）种子培养基，麸皮2％，(NH4)2SO40.2％，蛋白胨0.1％，KH2PO 0.1％，CaCO30.1%，自然pH，50 mL三角瓶装培养基5 mL，121℃灭菌，30 m in。
（3）发酵培养基:纤维素材料90％，麸皮10％，(NH4)2SO42.5％，蛋白胨0.5％，水250 mL，250 mL三角瓶装干料10g，121℃灭菌20 min。
（4）0.1M乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH=4.8）溶液A：量取冰醋酸6mL，定容至1000ml，制成0.1M醋酸溶液。
溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000mL，制成0.1M醋酸钠溶液。
使用时以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。
纤维素酶产生菌及其发酵条件优化
纤维素酶产生菌及其发酵条件优化刘丹;王红英;吴星;钱斯日古楞【摘要】通过刚果红染色产脱色圈初筛出能分解纤维素的菌株,再利用DNS法分别测定纤维素酶的酶活,得到分解纤维素能力最强的一株真菌Lv-1.该菌株菌丝为黄绿色,孢子为深绿色,有多分支的无隔菌丝,长孢子囊孢子,用DNS法测定其酶活为62.42 U/mL,后对其进行了产酶条件优化.经单因素试验和正交试验得到该菌的最佳产酶条件为:在以10 g/L羧甲基纤维素钠为碳源,4 g/L蛋白质,2 g/L硫酸铵为氮源,1 g/L硫酸二氢钾为无机盐的最适产酶培养基中,初始pH为6.0,培养温度37℃,装液量100 mL/250 mL,发酵36 h.在此发酵条件下,其产酶活力可达96.898U/mL,试验结果显示,该菌株在产纤维素酶能力上具有显著优势,且菌株Lv-1产酶活力较优化前高出34.478 U/mL,提高了55.24％.【期刊名称】《工业微生物》【年(卷),期】2015(045)004【总页数】7页(P19-25)【关键词】纤维素酶;筛选;正交试验;酶活【作者】刘丹;王红英;吴星;钱斯日古楞【作者单位】大连工业大学生物工程学院,辽宁大连116034;大连工业大学生物工程学院,辽宁大连116034;大连工业大学生物工程学院,辽宁大连116034;大连工业大学生物工程学院,辽宁大连116034【正文语种】中文纤维素是细胞壁成分，是自然界分布最广、最丰富、最廉价的多糖类物质，也是数量最多的可再生资源[1-2]。
在自然界很多微生物利用其产的纤维素酶降解和利用纤维素, 如厌氧真菌、放线菌、细菌等。
纤维素酶可将纤维素降解为可溶性小分子糖或单糖，因此对生物能源、造纸、纺织、洗涤纺织工业、食品加工、中草药中有效成分的提取及植物遗传工程中都得到广泛应用，有巨大应用价值 [3-6]。
动物饲料中添加饲用微生物能改变饲养的禽畜肠道的微生物菌群数量及肠道发酵模式, 促进纤维的降解，提高饲料利用率[7-9]，对纤维素利用的前提是首先分离到能够产生纤维素酶的菌种。
里氏木霉产纤维素酶的条件优化及酶学性质研究
霉 发 酵 产 酶 的 最 佳 培 养基 为 ： 麦麸 １ ． ８ ％、 硝酸钠 １ ． ３ ％、 碳酸钙 ０ － ３ ％、 氯化钠 ０ ． ２ ％、 磷酸 二氢钾 ０ － ３ ％； 里氏木霉 所产 纤 维素酶的最适反应 条件为 ： ｐ Ｈ ４ ． ０ 、 ５ ０ ℃， 金 属 离子 Ｆ ｅ 、 Ｃ ｏ ２ Ｍ ｎ “、 Ｃ ａ 对酶 活有促进作 用 ， 而Ｆ ｅ “、 Ａ ｇ 对酶有 抑制 作 用。 经培养基优化后 ， 发 酵 液 上 清 中 的 最终 酶 活 为 １ １ ６ ． ６ ４ Ｕ ／ ｍ Ｌ ， 是优化前 的 ３ ． ５倍 。
钟桂芳 ， 翟莉莉 ， 樊攀 ， 杨 雪鹏
（ 郑州 轻 工 业 学 院食 品与 生 物 工 程 学 院 ． 郑 州河 南 ４ ５ ０ ０ ０ ２ ）
摘
要： 本 文 对 里 氏 木 霉 产 纤 维 素 酶 发 酵 培 养 条 件 及 对 其 所 产 纤 维 素 酶 的 酶 学性 质 进 行 初 步 研 究 。 ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｃｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ Ｃｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ Ｃｅ ｌ ｌ ｕ ｌ ｏ ｓ ｅ Ｐｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｂ ｙ
Ｔ ｒ ｉ ｃ ｈ ｏ ｄ ｅ ｒ ｍａ ｒ ｅ ｅ ｓ ｅ ｉ ａ ｎ ｄ Ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｏ ｎ ｔ ｈ ｅ Ｅｎ ｚ ｙ ｍａ ｔ ｉ ｃ Ｐｒ ｏ ｐ ｅ ｒ ｔ ｉ ｅ ｓ
食 品 与 发 酵 科 技
Ｆ ｏ ｏ ｄ ａ ｎ ｄ Ｆ ｅ ｒ ｍ ｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ
玉米种皮固态发酵绿色木霉生产纤维素酶的研究
５ ０
纤 维 素 科 学 与 技 术
第 ｌ 卷 ５
１ ． 纤 维素酶 活 力定 义 （ ＭＣ Ｄ ） ．１ ５ Ｃ Ａ． ＮＳ 在 ５ ±０１ 、ｐ ． ±００ ０ ．℃ Ｈ ４８ ０ ．５的 ００ ｌ 柠 檬酸 缓冲 液体 系下 ， 以 １ ５ Ｃ － ． ｍｏ Ｌ ５ ／ ． ％ ＭＣＮａ ２
高产 纤维素酶菌株 ， 其最适培养条件 为： 玉米种皮 与麦麸质量 比 ３： ， ７ 硫酸铵 １ ％， ． ４
Ｋ２ Ｏ ０２ （ 量 分 数 ） ＨＰ ． ％ 质 ，加 水 量 为 １：ｌ ～ １ （ 量 比 ） ＿ ． 质 ２ ４ ，发 酵 温 度 ３ ＂ ０Ｃ，发酵
时间 ４天 ，产 酶活 力高达 ３ ６ ｇ（ 曲） ８５ Ｕ／ 干 。 关键 词：玉米种皮 ；纤维素酶 ；固态发酵 中图分类号：Ｔ ２ ０９ Ｔ ９ ５ Ｓ １ ． Ｑ ２ ； 文献标识码 ：Ａ
文 章 编 号 ： １０ －４ ５２ ０ ）４０ ４ －６ ０ ４８ ０ （０ ７０ －０ ９０
玉米种皮 固态发酵绿色木霉生产纤维素酶 的研 究
段 峰
（ 济南 高新 开发 区京鲁生物技术研究开发 中心 ，山东 济南 ２ ０ １ ） ５ ０ ３ 摘 要 ：通过 以玉米种皮为基质对绿色木 霉 Ｊ８０ ９ ．６的 固态发酵研 究，选育得到一株
２ 结果 与讨论
２１ 菌种 筛选 与驯 化 ． 将 沙土 管保藏 的菌株 斜面 传代 ２次进 行 活化 ，摇瓶 培养 ２ 布 Ｃ － 平 板 ，培 养 ４ｈ涂 ＭＣＮａ ４ ，筛选 透 明 圈大 的菌落 为出 发菌株 【 。 ８ ｈ ２ ＿ 引
将 ４ 出发菌 株 以玉 米种 皮为 主要碳源 进行 发酵 实验 ， ２株 生长 良好 的进行 再驯化 。 ０株 得 经过 固态 培养 一平 板筛选 一 固态 培养 驯化 数 次 ，最 终得 编号 Ｌ ３７的产酶菌 株 一株 。 ０． ２２ 影 响 固体 发酵 的 多种 因素 的优 化 选择 ． ２２１ 固态发 酵培 养基 的组 成 ．． 麦麸 含有 多种 微生物 生长 的必需 因子 ， 发酵 不可缺 的营养 基质 ，它不但 含有 丰 富的纤 是 维 素和 半 纤维素 ，而 且是优 良的产酶 诱导 物 。玉 米种 皮也 叫玉米 纤维 ，是 玉米 淀粉 厂 的副产 品 ， 含有 的纤 维素和 半纤 维素 略少 于麦麸 ， 因其 吸水 性和保 水性 （ 它 但 因含 有其 它 的多聚物 ） ， 及 在 高压蒸 汽灭菌 后 的独特 形态 ，使其 可 以达 到充 分疏 松 固态基质 的作 用 。 以玉 米种 皮是 所 固态 发酵 的 良好支 持介 质 。经过对 玉米 种皮 和麦 麸 的配 比发酵 实验 ，得 出结果如 图 １ 所示 ， 最 佳产 酶配 比为 （ 玉米种 皮）： （ 麸） ３： 。 麦 － ７
纤维素酶的发酵的工艺介绍
纤维素酶的生产工艺主要有两种，即固体发酵和液体发酵，其工艺如下：
影响产酶量和活力的因素：
影响纤维素酶产量和活力的因素很多，除菌种外，还有培养温度、pH、水分、基质、培养时间等。
这些因素不是孤立的，而是相互联系的。
以绿色木霉（T.ViriclePers.expr）为菌种，研究了影响产纤维素酶的五大因素对产酶量和活力的作用，认为基质粗纤维含量为40%、初始pH7.5、加水4倍、在26-31℃条件下培养45h可获得最大产酶量26mg/g和CMC酶活力
20mg/g·h。
其诱变筛选的里氏木霉91-3的产酶条件，结果表明该菌种以7：3的秸秆粉和麦麸，另添加4%硫酸铵、0.4%磷酸二氢钾、0.1%硫酸镁为最佳培养基，28-32℃为适宜培养温度，30℃为最佳温度，4%为最佳接种量，96h到达发酵高峰。
以康氏木霉W-925为出发菌，经诱变后得到的Wu-932纤维素酶高产菌的最佳发酵条件。
结果表明，以1：2的麦麸和稻草粉为培养基，5%的接种量，稻草粉碎平均长度3-5mm，初始pH4-5，温度在28-35℃，发酵时间72h为最佳发酵条件。
污染菌的控制：
饲用纤维素酶普遍存在一种俗称的“白毛菌”污染。
污染后轻者酶活性下降，重者发酵失败。
为此，研究控制发酵污染意义很大。
“白毛菌”的菌落特征、来源、生长和生理特征及控制方法，找到了一种与康氏木霉Wu-932呈共生关系，而与“白毛菌”呈竞争性抑制关系的热带假丝酵母菌J-931。
利用此菌进行混合发酵，可有效地控制“白毛菌”的污染。
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第２４卷第３期 ２００５年５月
食品与生物技术学报
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏ１．２４ ＮＯ．３
Ｍａｙ ２００５
文章编号：１６７３—１６８９（２００５）０３・０１０１‘０５ 绿色木霉固态发酵纤维素酶生物量的测定 及发酵培养基的初步优化
姜绪林， 孙瑶， 杨毅， 杜大庆， 张星元 （江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡２１４０３６）
摘要：为了测定绿色木霉固态发酵纤维素酶的生物量，采用紫外分光检测固态发酵过程中麦角 固醇的量．确定了其最佳提取工艺：在７５℃恒温水浴中反应０．５ ｈ，用乙醚萃取，乙醇定容，紫外 ２８２ ｎｍ检测．在此基础上对绿色木霉固态发酵的培养基进行了初步的优化，并得到了最佳的培养 基组合：碳源为蔗糖，无机氮源为（ＮＨ ） ＳＯ ，水料质量比为２．２，ｐＨ为５．５．用该培养基，ＣＭＣ酶 活和滤纸酶活分别比优化前提高了２１．０ 和４４．１％． 关键词：绿色木霉；纤维素酶；固态发酵；麦角固醇 中图分类号：Ｑ ８１５ 文献标识码：Ａ
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ Ｂｉｏｍａｓｓ Ａｓｓａｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｏｌｉｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｄｉｕｍ
ＪＩＡＮＧ ＸＵ—ｌｉｎ，ＳＵＮ Ｙａｏ，ＹＡＮＧ （Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ Ｃｈｉｎａ）
Ｙｉ，ＤＵ Ｄａ—ｑｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｘｉｎｇ・ｙｕａｎ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４０３６，
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｔｈｅ ｄａｔａ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｍａｓｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｌｉｄ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｂｉｏｍａｓｓ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｆｉｒｓｔｌｙ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｗａｌ１）ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ：ｒｅａｃｔｉｎｇ ａｔ ７５。Ｃ ｆｏｒ ０．５ ｈ，ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｌｉｑｕｉｄ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｔｈｅｒ，ｓｏｌｖｅｄ ｗｉｔｈ １０ ｍＬ ｅｔｈａｎｏｌ，ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｔ ２８２ ｎｍ ｂｙ ＵＶ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ．Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｂｉｏｍａｓｓ ａｓｓａｙ，ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｏｌｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ：ｓｕｇａｒ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ，ａｎｄ（Ｎ Ｈ４）ｚ ＳＯ４ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ，ｔｈｅ ｍａｓｓ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｔｏ ｓｏｌｉｄ ｍａｔｅｒｉａｌ ｗａｓ ２．２，ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ＰＨ ｗａｓ ５．５． Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣＭＣ—Ｎａ ａｎｄ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ ａｓ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ２ １．Ｏ ９／５ ａｎｄ ４４．１％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ；ｃｅｌｌｕｌａｓｅ；ｓｏｌｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ
无论是液态发酵还是固态发酵，绿色木霉都已 经应用于纤维素酶的工业化生产中，它是一种高产 纤维素酶的菌株，所分泌的纤维素酶广泛应用于食 品酿造，动物饲料，纺织工业，造纸工业等领域Ⅲ．
现代微生物工程是利用微生物活细胞来实现 发酵过程中产品的合成，从这个意义上说，微生物 活细胞就是现代工业发酵生产线上不可缺少的“生 物机器”．因此，通过监控发酵过程中的生物量的变
收稿日期：２００４・０９・０９；修回日期：２００４・１２・１１． 作者简介：姜绪林（１９８１・），男，江苏南京人，发酵工程硕士研究生
维普资讯 http://www.cqvip.com １Ｏ２ 食品 与 生 物技 术 学 报 第２４卷 化，来控制优化培养条件，对于提高产物的产率有 很重要的意义．绿色木霉属于丝状真菌，在固态发 酵过程中菌丝体与培养基紧密地结合在一起，给测 定生物量带来了不便．真菌细胞壁上含有一种甾醇 类物质——麦角固醇，通过测定麦角固醇的量也可 以间接地反映生物量的多少［２］．为此，作者采用紫 外分光检测固态发酵过程中麦角固醇的量，以此来 描述基质中菌丝体量的变化，并在此基础上对纤维 素酶固态发酵的培养基组分进行了初步的优化． １材料与方法 １．１ 菌种 绿色木霉，作者所在实验室保藏． １．２主要试剂 羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ—Ｎａ），３，５一二硝基水杨 酸（ＤＮＳ）：中国医药集团上海化学试剂公司产品； 麦角固醇：Ｓｉｇｍａ公司产品． １．３培养基 斜面培养基：马铃薯培养基．培养菌丝体时，不 加琼脂． 酶曲培养基：固体物料（新鲜稻草粉：豆粕粉 （ｍ：ｍ）一９：１）１０ ｇ，营养液（蔗糖２２．８ ｇ， （ＮＨ ）２ＳＯ １０ ｇ，Ｋ２ ＨＰＯ４ ５．０ ｇ，ＭｇＳＯ ２．５ ｇ，溶 于１ ０００ ｍＬ水中，自然ｐＨ值）２２ ｍＬ． １．４原理和方法 １．４．１ 茵丝体的制备 ２５０ ｍＬ三角瓶中加入４０ ｍＬ马铃薯液体培养基，接入新鲜的成熟（培养约４ ｄ后）绿色木霉孢子１环，３Ｏ℃下，１６０ ｒ／ｒａｉｎ恒温 培养３６ ｈ后，离心洗涤，６Ｏ℃烘干２４ ｈ，粉碎待用． １．４．２ 酶曲的制备 ２５０ ｍＬ三角瓶中加入酶曲 培养基，接入２ ｍＬ孢子悬液（孢子浓度控制在 １Ｏ ～１Ｏ 个／ｍＬ）．恒温恒湿培养箱中（３０。Ｃ，湿度 ７Ｏ ）培养５ ｄ后测定酶活及菌丝体含量． １．４．３ 麦角固醇提取原理 提取过程如下面的反 应式所示： Ｃ２。Ｈ ３ ＯＨ（细胞壁）＋ＮａＯＨ—Ｃ２。Ｈ 。ＯＮａ ＋Ｈ２Ｏ Ｃ２Ｈ５０Ｈ＋Ｃ２９Ｈ ４３ＯＮａ Ｃ２９Ｈ４３ＯＨ（反应 液）＋Ｃ２ Ｈ５ ０Ｎａ １．４．４ 麦角固醇的提取及测定 精确称取０．１ ｇ 菌丝或酶曲，放入２５ ｍＬ具塞比色管中，加入１Ｏ ｍＬ醇碱混合液（Ｖ（无水 醇）：Ｖ（Ｎ。ｏＨ溶液）一３：５），于 ８５～９０。Ｃ恒温水浴中反应１．５ ｈ．流水冷却，离心． 取上清液沸水浴中将乙醇蒸尽，然后加入１Ｏ ｍＬ无 水乙醚，充分振荡，静止萃取２ ｈ．吸取上层乙醚层， 将乙醚蒸尽后（管壁上残留白色粉末状物质），用无 水乙醇溶解并定容至１Ｏ ｍＬＬ ． 紫外分光光度计检测：波长２８２ ｎｍ处比色 Ｊ， 测定ＯＤ值． １．４．５纤维素酶活测定 主要以ＣＭＣ—Ｎａ和滤纸 为作用底物，测定ＣＭＣ酶活和滤纸酶活，测定方法 见文献［５］。 ＣＭＣ酶活定义为：以ＣＭＣ—Ｎａ为底物，在 ５Ｏ℃，ｐＨ ４．８条件下，每秒钟产生１微摩尔的葡萄 糖所需的酶量为一个酶活力单位．滤纸酶活定义 为：以滤纸为底物，在５Ｏ。Ｃ，ｐＨ值４．８条件下，每 分钟产生１微摩尔的葡萄糖所需的酶量为一个酶 活力单位．
２结果与讨论 ２．１紫外分光光度计测定麦角固醇含量标准曲线 的绘制 精确称取麦角固醇标准样品５ ｍｇ，用乙醇溶解 定容到５Ｏ ｍＬ，质量浓度为０．１ ｍｇ／ｍＬ，然后分别 吸取１，２，３，４，５ ｍＬ，再用乙醇分别定容到１Ｏ ｍＬ， 这时，最终质量浓度分别为０．０１，０．０２，０．０３，０．０４， ０．０５ ｍｇ／ｍＬ，在波长２８２ ｎｍ处，分别测定其ＯＤ 值．以麦角固醇的质量浓度为横坐标，ＯＤ值为纵坐 标绘制标准曲线． ２．２麦角固醇提取条件的研究 ２．２．１ 反应温度对麦角固醇提取的影响 称取０． １ ｇ的菌丝或酶曲，分别在５Ｏ，６Ｏ，７Ｏ，８Ｏ和９Ｏ℃的 水浴中恒温提取麦角固醇．温度对麦角固醇提取的 影响如表１所示． 表１ 温度对麦角固醇提取的影响 Ｔａｂ．１ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｇｏｓ－ ｔｅｒｏｌ
反应温度／ ℃ 麦角固醇提取量／ ｍｇ
５Ｏ ６Ｏ ７Ｏ ８Ｏ ９０ ０．１２Ｏ ０．１３３ ０．Ｉ３９ Ｏ．１３３ ０．０６２ 由表１可以看出，温度超过约７５口Ｃ后，麦角固 醇的提取量迅速下降，这是由于，在这个温度范围 内反应液里的乙醇挥发很快，影响了其与麦角固醇 的置换，从而不能有效地提取麦角固醇．温度为
维普资讯 http://www.cqvip.com 第３期 姜绪林等：绿色木霉固态发酵纤维素酶生物量的测定及发酵培养基的初步优化 １０３ ７５℃，麦角固醇的提取情况最好． ２．２．２ 反应时间对麦角固醇提取的影响 称取 ０．１ ｇ的菌丝或酶曲，分别在０．５，１．０，１．５，２．０， ２．５ ｈ时停止提取反应，反应时间对麦角固醇提取 的影响见表２． 表２反应时间对麦角固醇提取的影响 Ｔａｂ．２ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｉｍｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
反应时间／ ｈ 麦角固醇提取量／
ｍｇ Ｏ．５ １．０ １．５ ２．０ ２．５ Ｏ．１１２ Ｏ．１０９ ０．１１５ Ｏ．１１３ Ｏ．１１３
由表２可以看出，在０．５ ｈ后，提出的麦角固醇 变化很小，说明此时麦角固醇基本已经完全提取出 来．通过这个实验，大大缩短了原定的提取时间． ２．２．３反应液体积对麦角固醇提取的影响 称取 若干份０．１ ｇ固体曲置于具塞比色管中，再分别加 入４，８，１２，１６，２Ｏ ｍＬ醇碱溶液，抽提麦角固醇并 比色测定其浓度，反应液体积对麦角固醇提取的影 响见表３．可以看出，当醇碱溶液的体积为１２ ｍＬ 时，最有利于麦角固醇的提取． 表３反应液体积对麦角固醇提取的影响 Ｔａｂ．３ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｌｉｑｕｉｄ ｖｏｌｕｍｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃ— ｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ
反应液体积／ ｍＬ 麦角固醇提取量／ ｍｇ
４ ８ １２ １６ ２０
０．０７８ ０．０９４ Ｏ．１Ｏ８ ０．０９８ Ｏ．０９３ ２．２．４反应液中醇碱比对麦角固醇的提取的影响 分别向装有０．１ ｇ固体曲的比色管中加入２，４， ６，８，１０ ｍＬ无水乙醇，然后补加质量分数为２Ｏ 的 ＮａＯＨ溶液至１２ ｍＬ，提取麦角固醇并进行比色测 定，醇碱比对麦角固醇提取的影响见表４．当碱的量 太少时，影响了细胞壁中麦角固醇的皂化，而当醇 太少时，又会影响醇对皂化后的麦角固醇的置换． 由表４可以看出，当醇碱体积比为１：１时，最有利 于麦角固醇的提取． 表４反应液醇碱比对麦角固醇提取的影响 Ｔａｂ．４ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ ｔｏ ＮａＯＨ Ｏｉｌ ｔｈｅ ｅｘ’ ｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ 反应液醇碱 体积比 麦角固醇提取量／ ｍｇ ０．２ ０．５ １．０ ２．０ ５．０ Ｏ．０９１ Ｏ．１２１ Ｏ．１３５ Ｏ．１１７ Ｏ．０９９ ２．２．５反应液中ＮａＯＨ溶液的浓度对麦角固醇的 提取的影响 向装有０．１ ｇ固体曲的比色管中加入 等体积比的醇碱溶液１２ ｍＬ，其中ＮａＯＨ的质量分 数分别为１Ｏ ，２Ｏ ，３Ｏ ，４Ｏ 和５Ｏ ．提取后比 色测定并进行比色测定，结果见表５． 表５反应液中ＮａＯＨ浓度对麦角固醇提取的影响 Ｔａｂ．５ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＮａＯＨ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘ－ ｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ 反应液中ＮａＯＨ的 质量分数／ 麦角固醇 提取量／ｍｇ １Ｏ ２０ ３０ ４０ ５Ｏ Ｏ．１２６ Ｏ．１２４ Ｏ．Ｏ６８ ０．０４７ ０．０１９ 由于ＮａＯＨ溶液的质量分数越高，其溶液的粘 度越大，这不利于麦角固醇从细胞壁中提取出来， 而当其质量分数约为１５ 时，麦角固醇的提取情况 最好． ２．３菌丝体与麦角固醇含量之间的关系 称取不同质量的绿色木霉的菌丝体置于比色 管中，按上述的提取条件提取细胞壁中的麦角固 醇，比色测定麦角固醇的含量，以菌丝体质量为横 坐标，麦角固醇含量为纵坐标绘制曲线．曲线如图１ 所示． 由图１我们得到，麦角固醇含量Ｙ与菌丝体质 量ｚ之间的关系：Ｙ＝０．００６＝，其相关系数达到 ０．９９８３，由此，就可以根据麦角固醇的含量确定固 体曲中菌丝体的含量． ２．４基于生物量测定的纤维索酶固态发酵工艺的 初步优化 ２．４．１ 绿色木霉固态发酵生物量的变化 向酶曲 培养基中接种绿色木霉单孢子悬液，拌匀后静置培