SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离

小鼠骨髓间充质干细胞分离培养新方法

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是

骨髓中除造血干细胞外另一重要的干细胞。MSC 具有自我更新、多向分化、免疫调控和支持造血的能

力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果。虽然 MSC临床应用广泛，但许多关键问题如免疫调控的具体机制等并未解决。小鼠是重要的实验动物之一，广泛用于基础实验研究。在体外成功分离培养 MSC，并得到大量纯化的MSC是研究其分化及功能

调控机制的前提。目前分离小鼠骨髓MSC的方法包括全骨髓贴壁法、骨片消化法、流式或磁珠分选法等。然而全骨髓贴壁法获得的细胞往往含有不少造血细胞；骨片消化法需要进行胶原酶消化，步骤多且消化时问不好控制；流式或磁珠法虽然获得细胞较纯，但程序复杂，花费高且获得的细胞

相对少。

骨髓MSC的分离目前常用的方法有全骨髓贴壁法、骨片消化法和流式细胞术或磁珠分选法。全骨髓贴壁法即根据MSC的贴壁性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。然而该方法获得的MSC往往含有较多基质细胞和造血细胞污染。我们的结果也显示，全骨髓贴壁法原代培养的细胞有75％为CD45阳性的细胞，传至第3代， MSC中仍有5％的CD45阳性细胞，即造血细胞。骨片消化法，是先将骨髓冲干净，将股骨和胫骨剪碎，然后进行胶原酶消化。虽然该方法获的 MSC纯度较高，但是程序复杂，且不同鼠龄骨片胶原酶消化时间不同，不容易掌握。随着对MSC表面抗原认识的深入，有研究者利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法对其进行分离纯化旧191；虽然这些方法可以得到纯度较高的细胞，但分离过程对细胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性；而且实验条件要求高，需要骨髓量大，加之耗费较大和技术难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。

本研究采用骨髓加骨片法分离小鼠MSC，即将股骨和胫骨肌肉去干净后，不需冲骨髓，不需消化，直接剪碎，PBS洗后重悬于培养基直接接种。相比全骨髓贴壁法及骨片消化法发现，骨髓加骨片法出现小鼠MSC集落的时间早，数量多。虽然第1代消化细胞仍有少量CD45阳性细胞，但到第3代，MSC 纯度可达95％以上，而且获得的MSC总数要高于全骨髓贴壁法及骨片消化法。与其他方法获得的 MSC相似，3代后骨髓加骨片法获得的MSC高表达 Sca-1，CD44，CD29等，不表达内皮细胞标志CD31 及造血细胞标志CD45。该方法获得的．MSC在成骨和成脂诱导体系中培养能分化为成骨细胞和脂肪细胞。综上所述，骨髓加骨片法充分利用了骨髓及骨片，处理简单、短时间内可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，是一种方便、快捷、高效的MSC分离培养方法。

荧光磁性纳米粒子体外标记骨髓间充质干细胞研究

东Ｓｏ南ｕｔｈ大

ｅａｓ学ｔＵｎ学ｉｖ嚣　医ｃ学ｉ版ｄｉＪＳｏｕｔｈｅａｓｔＵｎｉｖ　ＭｅｄＳｃ　Ｅｄ；　２。ｌ１，Ｆｅｂ；３。（１）：４３。４７　ｆ　）　一‘’。一　一一　・４３・　

荧光磁性纳米粒子体外标记骨髓　

间充质干细胞研究　

吉佳佳，阮静，崔大祥　

（上海交通大学微纳科学技术研究院纳米生物工程研究室，上海２００２４０）　

［摘要］目的：探索高效体外示踪骨髓间充质干细胞体系的方法。方法：采用贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓　

间充质干细胞，用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞ＣＤ２９、ＣＤ９０和ＣＩＭ５表达情况，用诱导剂诱导干细胞　检测骨髓间充质干细胞的分化能力，采用普鲁士蓝染色，用激光共聚焦显微镜、磁共振成像仪观察荧光磁性　纳米粒子标记的干细胞体外成像效果。结果：流式细胞仪检测ＣＤ２９、ＣＤ９０和ＣＤ４５阳性表达率分别为　

８４．６９％、９０．２８％和０．７２％；碱性磷酸酶染色和油红０染色结果均表明骨髓间充质干细胞成功分化为成骨　细胞和脂肪细胞；普鲁士蓝染色、激光共聚焦显微镜成像和磁共振成像表明荧光磁性纳米粒子标记的骨髓间　

充质干细胞具有很好的成像效果。结论：荧光磁性纳米粒子作为示踪剂可以在体外标记骨髓间充质干细胞，　为干细胞研究提供新思路。　［关键词］荧光磁性纳米粒子；骨髓间充质干细胞；磁共振成像；示踪剂　

［中图分类号］Ｑ‘３３４　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１６７１—６２６４（２０１１）Ｏ１—００４３’０５　

ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１－６２６４．２０１１．０１．００９　

Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｓｕｐｅｒｍａｇｎｅｔｉｃ　ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｌａｂｅｌｅｄ　ｂｏｎｅ　

ｍａｒｒｏｗ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｖｉｔｒｏ　

ＪＩ　Ｊｉａ。ｊｉａ，ＲＵＡＮ　Ｊｉｎｇ，ＣＵＩ　Ｄａ。ｘｉａｎｇ　

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＢｉｏ—Ｎａｎｏ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＭｉｃｒｏ—Ｎａｎｏ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏ　Ｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２４０，Ｃｈｉｎａ）　

SD大鼠骨髓间充质干细胞与其乳鼠该细胞株的细胞表型鉴定比较

广东医学２０１３年１１月第３４卷第２２期　Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｎｏｖ．２０１３，Ｖｏ１．３４，Ｎｏ．２２　

ＳＤ大鼠骨髓间充质干细胞与其乳鼠该细胞株的　

细胞表型鉴定比较水　

卞铁荣　，陈枫　，邢宏运　，唐利　泸州医学院附属医院　医学实验中心，　血液内科（四川泸州５４６０００）　

【摘要】　目的探讨随着传代次数的增加，原代贴壁培养的ｓＤ大鼠的骨髓间充质干细胞（ＭＳＣｓ）与其乳鼠　Ｍ￥Ｃｓ株细胞表型的差异。方法采用密度梯度离心法和贴壁法分离培养ｓＤ大鼠ＭＳＣｓ，对分离培养的ｓＤ大鼠　的ＭＳＣｓ及其乳鼠ＭＳＣｓ株进行传代，倒置相差显微镜比较两种细胞的形态，借助流式细胞技术及免疫组化技术分　析两种细胞表型因子的表达差异。结果流式细胞技术鉴定ｓＤ大鼠原代培养的第７代ＭＳＣｓ与其乳鼠ＭＳＣｓ株　的ＣＤＴ１、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ４５的阳性表达是一致的，两种细胞对应的阳性率分别为７７％、６８．８％、５２．３％、０．０５％和　９７．７％、９９．７％、８７．６％、０．０５％；免疫组化分析其ＣＤ４４、ＣＤＴ１及阴性对照，两种细胞结果亦吻合，而且ＣＤ４４和　ＣＤ７１与流式细胞检测结果一致，两种细胞均为阳性表达。结论流式细胞术及免疫组化鉴定原代贴壁培养的第　７代ＳＤ大鼠的ＭＳＣｓ与乳鼠ＭＳＣｓ株细胞表型一致，支持原代贴壁培养ＳＤ大鼠的ＭＳＣｓ　３～５代已纯化，可用作转　染等科研实验。也已证明传至第６、７代，培养的半数以上的ＭＳＣｓ仍保持干细胞的特征，且与细胞株细胞的增殖　能力相当。　【关键词】　骨髓间充质干细胞；细胞表型；流式细胞术；免疫组化　骨髓间充质干细胞（ＭＳＣｓ）属于多能干细胞，具有　自我更新及多向分化潜能，可分化为骨、软骨、脂肪、肌　腱、肌肉、神经等多种细胞。因此，ＭＳＣｓ所具有的修　复、替代和再生的能力有望发展为临床医学新疗法，但　ＭＳＣｓ在骨髓中的含量很少，约占骨髓单核细胞的１／１０　万，并随着年龄的增加而减少…。体外贴壁培养法从　骨髓筛选的ＭＳＣｓ活性高，且骨髓中的造血干细胞能　分泌生长因子和簇贴壁物质，促进ＭＳＣｓ贴壁生长　。　有研究　提出在人ＭＳＣｓ传代培养过程中发现，第４～　５代之前的细胞增殖能力比较旺盛，以后其活力逐渐　减弱，提示细胞脱离了体内环境之后，逐渐发生退化，　拟建议取用ＭＳＣｓ作实验研究时，细胞的传代次数不　宜超过４～５代。以目前经验，原代贴壁培养法获得的　ＳＤ大鼠的ＭＳＣｓ只用其３—５代。而文献　报道ＭＳＣｓ　在无诱导剂环境中生长，２５代以前，其细胞形态、生长　特性、表形特点和分化潜能无明显变化。目前研究该　细胞应用的文献　多而广，为了探究清楚ＭＳＣｓ可用　于应用研究的细胞代数，使临床新疗法尽快、尽早、尽　广泛地实施，２０１２年６月至２０１３年１月，本研究对原　代贴壁法培养的ＳＤ大鼠的ＭＳＣｓ与其乳鼠的ＭＳＣｓ株　的细胞表型进行鉴定比较，拟探讨该法培养的细胞５　代以后能否继续用于细胞种子来源。　１材料与方法　１．１　材料３—５周的ＳＤ大鼠（四川泸州医学院动物　中心）１０只，雌雄不拘，体重１５０～２００　ｇ；ＳＤ大鼠乳鼠　的ＭＳＣｓ株（广州吉妮欧生物科技有限公司）；高糖　

中药二仙汤对骨髓干细胞增值和迁移能力的影响

李楠;艾浩

【期刊名称】《中国计划生育学杂志》

【年(卷),期】2017(025)007

【摘要】目的:观察二仙汤对骨髓间充质干细胞增殖能力和迁移能力的影响,为二仙汤协同骨髓间充质干细胞治疗卵巢早衰提供基础实验依据.方法:分别将20只SD雌性大鼠制备含二仙汤的药物血清(含药组)和无药物血清(对照组),取10只大鼠体外分离骨髓间充质干细胞进行培养,通过对照法对细胞形态学观察、MTT法测定、细胞周期及细胞迁移能力进行检测并分析.结果:与对照组相比,含药组细胞增殖能力和迁移能力均明显增强.结论:二仙汤协同骨髓干细胞自体移植治疗卵巢早衰疾病具有可行性.

【总页数】4页(P444-446,454)

【作者】李楠;艾浩

【作者单位】锦州医科大学附属第三医院妇科 121000;锦州医科大学附属第一医院妇科

【正文语种】中文

【相关文献】

1.二仙汤及其组方中药对幼年大鼠肾上腺雌激素受体表达的影响 [J], 陶仕英;牛建昭;王继峰;赵丕文

2.补肾中药二仙汤对乳腺癌化疗相关闭经的影响 [J], 刘晓雁;刘鹏熙;林毅

3.β-淀粉样蛋白对幼鼠骨髓干细胞增殖、迁移和凋亡的影响 [J], 热娜·阿布力孜;威力江·赛买提

4.补肾填精中药血清对去势小鼠骨髓干细胞Wnt/β-catenin成骨分化信号通路的影响 [J], 刘光旺;高娟;郭含军;霍维玲;马超;陈明;干耀恺;郝永强

5.中药经验方对心肌损伤大鼠SDF-1的调节作用及骨髓干细胞向心肌组织归巢分化的影响 [J], 沈利水;金钦阳;王彦君;胡晓锋;马元;屈百鸣

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大鼠骨髓间充质干细胞培养的首次换液模式

倪萍;陈自谦;彭德新;白伟

【摘要】BACKGROUND: The culture period, quantity and purity are crucial

for stem cell transplantation, and it is essential to build anoptimal modality

of cell culture in vitro.OBJECTIVE: To study the influence of different

modalities of the first medium exchange on the culture time and

biologicalcharacteristics of rat bone marrow-derived mesenchymal stem

cells.METHODS: On condition of modality of the first medium exchange,

six experimental groups were performed as follows: group Awas half

exchanged after 24 hours, group B was all exchanged after 24 hours,

group C was half exchanged after 48 hours, groupD was all exchanged

after 48 hours, group E was half exchanged after 72 hours, group F was all

exchanged after 72 hours. Then,all groups were all exchanged every 48

hours and were subcultured consecutively. The period and purity of each

淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

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淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）

作者：蒋绍艳，宋丹妮，史玉朋，常宏

【摘要】目的：探讨淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。方法：采用差速贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，流式细胞仪鉴定表面标志。取第3代细胞加入106 mol/L淫羊藿苷培养基，对照组仅加入等量普通培养基进行培养。通过镜下观察细胞形态，流式细胞仪测定细胞表面标志，碱性磷酸酶试剂盒测定诱导细胞碱性磷酸酶活性，组织化学染色观察钙化结节形成能力。结果：体外培养的细胞表达CD29、CD44、CD105、CD166。淫羊藿苷诱导组细胞碱性磷酸酶呈阳性反应并有钙化结节形成，而对照组未见钙化结节形成。结论：淫羊藿苷能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，可视为一种良好的骨诱导活性因子。

【关键词】淫羊藿苷;骨髓间充质干细胞;成骨分化

[ABSTRACT] Objective: To study the effects of icariin on

osteogenic differentiation of rat BMSCs.Methods: Rat BMSCs

were isolated and cultured in vitro. At the third passage, rat DOC格式论文，方便您的复制修改删减

BMSCs were treated with 106mol/L icariin medium. BMSCs in the

control group were treated with an equal volume of medium. Cells

were identified by flow cytometry.Alkaline phosphatase were

提取大鼠骨髓的方法

提取大鼠骨髓的方法包括以下步骤：

1. 选取适当的实验动物，如SPF级、体重100~150g的SD大鼠。

2. 将大鼠断颈处死，然后将其置于体积分数为75%的乙醇中浸泡5分钟进行消毒。

3. 将工作台进行紫外消毒，并用通风机通风3分钟，以保持无菌环境。

4. 用75%酒精擦拭操作台和双手，确保无菌操作。

5. 准备好所需的工具，如大剪刀、止血钳、眼科剪刀、眼科镊子以及干净的培养皿。

6. 将大鼠仰卧放置在超净台内的干净培养皿上。

7. 使用眼科镊子沿腹股沟处提拉大鼠皮肤，并用眼科剪刀剪开腹股沟皮肤，暴露出腿部肌肉。

8. 从关节处将大鼠大腿剪下，并除去骨表面附着的软组织。

9. 如果剪刀不易将骨表面肌肉组织剔除干净，可以使用无菌纱布擦拭，以便更方便地剔除肌肉组织，提高所分离细胞的纯度。

10. 用无菌PBS浸泡清洗骨骼。

11. 用眼科剪剪断两端骨骺，显露骨髓腔。

12. 将骨骼放置在10ml含体积分数为10%胎牛血清的新鲜DMEM完全培养液的无菌培养皿中。 13. 使用注射器吸取完全培养液冲洗骨髓腔，重复冲洗3次，然后反方向冲洗3次，直至骨髓腔冲洗液变清亮。

14. 吹打细胞悬液，以便分散细胞。

15. 将骨髓悬液收集至15ml离心管中，在1000r/min室温下离心5分钟。

完成以上步骤后，即可提取到大鼠的骨髓细胞。请注意，实验应在无菌条件下进行，以避免污染样本。

鹿茸血清调控miR-141影响地塞米松对骨髓间充质干细胞的促增殖作用

《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research

2991 ·研究原著·

孟晨阳，男，1991年生，内蒙古自治区呼和浩特市人，蒙古族，2018 年内蒙古医科大学毕业，硕士，主要从事激素诱导的骨相关疾病发病机制研究。并列第一作者：薛飞，男，1983年生，内蒙古自治区包头市人，汉族，2016年内蒙古医科大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事激素诱导的骨相关疾病发病机制研究。通讯作者：冯卫，博士，教授，内蒙古医科大学第二附属医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010030 并列通讯作者：郝廷，博士，内蒙古医科大学第二附属医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010030 文献标识码:A 投稿日期：2019-11-12 送审日期：2019-11-16 采用日期：2020-01-02 在线日期：2020-03-10

Meng Chenyang, Master, Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China Xue Fei, Master, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China Meng Chenyang and Xue Fei contributed equally to this work. Corresponding author: Feng Wei, MD, Professor, Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China 鹿茸血清调控miR-141影响地塞米松对骨髓间充质干细胞的

骨桥蛋白在体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化中的作用

吴沁民;王东;孙海钰;张磊

【期刊名称】《中国医药导报》

【年(卷),期】2009(000)036

【摘要】目的:观察骨桥蛋白是否能诱导体外培养的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化,探讨其在骨折愈合过程中的作用机制,为其以后在骨折愈合方面的研究提供确切的理论依据.方法:以冲洗法获取Wistar大鼠骨髓,用贴壁法分离提纯BMSCs,传至第3代后分组,体外培养的BMSCs分为实验组和对照组.实验组添加含0.2 nmol/L骨桥蛋白的DMEM条件培养基;对照组为不含骨桥蛋白的DMEM培养基,于不同时间点收集细胞.通过光镜观察培养的细胞形态,以细胞计数法测定生长曲线,应用流式细胞仪分析细胞周期,并行碱性磷酸酶(ALP)染色和活性测定及骨钙素(OCN)含量测定.结果:实验组细胞具有成骨细胞的形态学特征;实验组细胞生长曲线右移,细胞G0/G1,期比例平均增加13.17%(P<0.01),S期比例减少74.93%(P<0.01);实验组ALP染色呈阳性,且ALP活性、OCN含量均较对照组明显提高.结论:骨桥蛋白对BMSCs有促进成骨分化的作用.

【总页数】3页(P14-16)

【作者】吴沁民;王东;孙海钰;张磊

【作者单位】山西医科大学第二医院,山西太原,030001;山西医科大学第二医院,山西太原,030001;山西医科大学第二医院,山西太原,030001;山西医科大学第二医院,山西太原,030001 【正文语种】中文

【中图分类】R329.2+8

【相关文献】

1.依达拉奉体外诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞的电生理研究 [J],

曾荣;胡资兵;郭伟韬;林颢;孙欣;魏劲松;吴少科

2.SD大鼠骨髓基质干细胞体外诱导成骨分化实验研究 [J], 曾铁功;赵晋英;黄泽智

3.体外诱导骨髓与脐血间充质干细胞向成骨细胞分化及其成骨活性的比较 [J], 邵帅;周晨红;徐丽丽

大鼠骨髓间充质干细胞的分离方法和培养

摘要】目的：探索在体外培养和纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的方法。方法：采用改良全骨髓贴壁方法，分离和纯化3～4周的大鼠BMSCs，镜下连续观察细胞的形态变化。流式细胞仪鉴定其表面抗原CD11b、CD45和CD90的表达情况。结果：原代培养的细胞呈圆形和梭形等，24小时后大部分细胞均贴壁。8～10天可达80%～90%融合，纯化后传代周期为6～8天。流式细胞术鉴定表明CD11b和CD45阴性，CD90阳性。结论：改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞，是一种比较理想的分离培养方法。

【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养大鼠

【中图分类号】R730.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）13-0026-02

Rat bone marrow mesenchymal stem cells‘s separation methods and to

cultivate Zou Jin. Hunan Vocational College of Science and Technology, Hu’nan

Province, Changsha 410014, China; Li Ya. Hu’nan University of Chinese Medicine,

Hunan Province, Changsha 410004, China; Yin Jin. The Centers for Disease Control and

Prevention of Hu’nan, Hu’nan Province, Changsha 410007, China

【Abstract】Objective To explore the in vitro culture and purification of SD rat