(2020年7月整理)农杆菌介导的烟草转化.doc
1 农杆菌介导的烟草转基因技术
一、实验目的
了解转基因的基本原理及操作方法。
二、基本原理
根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中含有诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为Ti质粒。野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T-DNA区（transferred DNA region），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在T-DNA的切割、转移与整合过程中起作用。农杆菌可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定地遗传给后代。我们将目的基因插入到经过改在的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
三、材料
1、植物材料：烟草无菌苗
2、农杆菌与载体：EHA105；PBI121
四、方法步骤
1、试剂的配制
（1）LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂8g/L。
（2）液体MS/MT培养基 PH：5.8-6.0
（3）烟草共培养培养基：固体MS培养基
（4）烟草筛选培养基：
MS +（2.0mg/L）6-BA + （0.3mg/L）NAA + （30g/L）蔗糖 + （400mg/L）头孢霉素 +
（50mg/L）卡那霉素 + （7.5g/L）琼脂 PH：5.8-6.0
（5）烟草生根培养基：固体MS培养基
2、农杆菌侵染菌液的制备方法：
（1）超净工作台紫外灯灭菌15min，接种环酒精灯灼烧灭菌备用
（2）铺皿：LB（50mg/L卡那霉素+25mg/L利福平）
（3）划线：用接种环沾取预转化的农杆菌菌液于铺好的培养基划“之”字或者“#”字
（4）封皿，做标记
（5）28℃恒温培养1d-2d 2 （6）用无菌刀刮取适量菌体于50mL液体MS培养基中，28℃，180r/min震荡培养1-2h至均匀悬浮液，紫外分光光度计测量菌液的OD600值，用液体MS调整浓度至OD600值约为0.8-1.0为宜，备用。
3、外植体的制备
准备生长20d健壮的烟草无菌苗，挑选接近植株顶端，完全舒展开且较大的叶片。将叶片平铺在无菌滤纸上，左手拿镊子，右手拿刀。用镊子固定叶片，刀片切去也边缘和叶脉，然后将叶片切成5mm×5mm的正方形，备用。
4、侵染与共培养
取制备好的侵染菌液50mL于三角瓶中，将切好的烟草叶片进入其中，摇晃使菌液与叶片充分接触，侵染10min，期间摇晃三角瓶数次。然后用镊子将叶片夹出，放在无菌滤纸上，吸干其表面的菌液，接种于共培养基上，于25℃培养室暗培养3d。
5、筛选培养和生根培养
从共培养基上取下叶片，预400mg/L的头孢水中浸泡5min，浸泡两次，然后用无菌水清洗三次，无菌滤纸吸干叶片表面的水分，接种于筛选培养基上，25℃光培养，期间每20d继代一次，直至再生出芽。此时将再生芽切下置于生根培养基上诱导生根。
烟草转化及CoIP方法
CoIP protocol From Guo Siyi
烟草转化体系
将含有正确构建质粒的阳性农杆菌克隆在 YEB 液体培养基中培养过夜，到OD600 约 1.5
左右（大约 20h），同时摇菌 P19，它能有效抑制植物对外源导入载体表达的沉默效应，提高表达量。然后收集菌体，5000 rpm 5min 常温离心，将菌体用侵染缓冲液（10 mM MES，100 μM AS-乙酰丁香酮，50 mM MgCl2）重悬，用紫外分光光度仪测定 OD600 值；根据实验要求将含有不同载体组合的菌液混合，同时在每一个组合中也加入 P19，最终使得每种菌液成分的 OD600 在 0.8 左右；然后将混合的菌液在 28 ℃下以 200 rpm 的转速再培养至少 3 h，然后注射合适大小的烟草叶片。尽可能多的注射烟草叶片，并标记下注射的叶片及对应区域；之后用保鲜膜封闭，在暗中培养 2 d，然后再转入光下培养 2-3 d，并取材在荧光显微镜下观察 GFP 的荧光已确定烟草叶片中外源载体的表达情况，视情况取材做后续的实验。
免疫共沉淀（CoIP）
将 VER2，TaGRP2 与不同的标签蛋白融合如 FLAG-VER2，TaGRP2-GFP，将该载体转化农杆菌获得阳性克隆，然后共同用农杆菌侵染的方法转化烟草。至少设定两组样品：即
FLAG-VER2/TaGRP2-GFP 以及 FLAG-VER2/GFP。检测目的蛋白是否表达：用 Bradford 法测定提取蛋白的浓度，然后用 SDS-PAGE 分离蛋白（15-30 μg protein/lane）做 Western Blot 用（WB）标签抗体 FLAG，GFP 检测融合蛋白是否在烟草中表达。并根据 WB 的结果估算实验组（FLAG-VER2/TaGRP2-GFP）与对照组（FLAG-VER2/GFP）的蛋白相对表达量。
Pre-clear：（所有步骤尽量在冰上进行）
烟草转化及CoIP方法 2
CoIP protocol From Guo Siyi
烟草转化体系
将含有正确构建质粒的阳性农杆菌克隆在 YEB 液体培养基中培养过夜，到OD600 约 1.5
左右（大约 20h），同时摇菌 P19，它能有效抑制植物对外源导入载体表达的沉默效应，提高表达量。然后收集菌体，5000 rpm 5min 常温离心，将菌体用侵染缓冲液（10 mM MES，100 μM AS-乙酰丁香酮，50 mM MgCl2）重悬，用紫外分光光度仪测定 OD600 值；根据实验要求将含有不同载体组合的菌液混合，同时在每一个组合中也加入 P19，最终使得每种菌液成分的 OD600 在 0.8 左右；然后将混合的菌液在 28 ℃下以 200 rpm 的转速再培养至少 3 h，然后注射合适大小的烟草叶片。尽可能多的注射烟草叶片，并标记下注射的叶片及对应区域；之后用保鲜膜封闭，在暗中培养 2 d，然后再转入光下培养 2-3 d，并取材在荧光显微镜下观察 GFP 的荧光已确定烟草叶片中外源载体的表达情况，视情况取材做后续的实验。
免疫共沉淀（CoIP）
将 VER2，TaGRP2 与不同的标签蛋白融合如 FLAG-VER2，TaGRP2-GFP，将该载体转化农杆菌获得阳性克隆，然后共同用农杆菌侵染的方法转化烟草。至少设定两组样品：即
FLAG-VER2/TaGRP2-GFP 以及 FLAG-VER2/GFP。检测目的蛋白是否表达：用 Bradford 法测定提取蛋白的浓度，然后用 SDS-PAGE 分离蛋白（15-30 μg protein/lane）做 Western Blot 用（WB）标签抗体 FLAG，GFP 检测融合蛋白是否在烟草中表达。并根据 WB 的结果估算实验组（FLAG-VER2/TaGRP2-GFP）与对照组（FLAG-VER2/GFP）的蛋白相对表达量。
Pre-clear：（所有步骤尽量在冰上进行）
利用烟草高效转化功能基因体系的建立
第２５卷第１期 ２００８年２月 新疆大学学报（自然科学版） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖ０Ｉ．２５．Ｎｏ．１ Ｆｅｂ．，２００８
利用烟草高效转化功能基因体系的建立’
邱立明，王艳，王瑜，代春英，马纪
（新疆生物资源基因工程重点实验室，新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐，８３００４６）
摘要：对农杆菌介导的烟草遗传转化条件进行探索，以２０ ｍｇ／Ｌ的潮霉素作为转化苗的筛选压．稀释至ＯＤ。。。 为０．２～Ｏ．３的农杆菌对外植体浸染１５ ｍｉｎ。于添加３００ ｍｇ／Ｌ头孢霉素的生根培养基中诱导生根，可稳定获得较 高的阳性转化率．经ＰＣＲ和ＰＣＲ—Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测，阳性转基因植株达８４．８ 以上．通过本研究建立了一种稳定高 效的功能基因烟草遗传转化体系． 关键词：烟草；农杆菌；筛选压；浸染时问；生根培养基 中图分类号：Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００．２８３９（２００８）０１—００２３．０５
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏｂａｃｃｏ ｇｅｎｅｔｉｃ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅｓ
ＱＩＵ Ｌｉ—ｍｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｙａｎ，ＷＡＮＧ Ｙｕ，ＤＡＩ Ｃｈｕｎ—ｙｉｎｇ，ＭＡ Ｊｉ
（Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｔｔｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｊｍｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｕｒｕｍｑｉ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ ８３００４６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｏｂａｃｃｏ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｅｘｐｌｏｒｅｄ．２Ｏ ｍｇ／Ｌ ｏｆ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｔＯ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ，ａｎｄ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｉｍｍｅｒｇｅｄ ｉｎｔｏ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｉｔｈ ＯＤ６ｏ０ ０．２～０．３ ｆｏｒ １５ ｍｉｎ，ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｒｏｏｔｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｔａｉｎｓ ３００ ｍｇ／Ｌ ｏｆ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｏｏｔｓ．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ８４．８ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ ａｎ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｔｏｂａｃｃｏ；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ；ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｒｅｓｓｕｒｅ；ｉｍｍｅｒｇｅｄ ｔｉｍｅ；：ｒｏｏｔｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ
烟草瞬时转化实验步骤
烟草叶片瞬时转化实验
试验方法
一、实验材料及药品
pCAMBIA 1381Z-Luc载体、Gv3101农杆菌菌株及其感受态、MES、MgCl2、乙酰丁香通、5-6周本氏烟草等
二、载体构建及农杆菌转化
烟草瞬时转化实验选用融合Luc信号的pCAMBIA 1381Z-Luc载体，载体构建过程是将拟南芥及菊花的FT启动子分别采用双切双连的常规载体构建方式将启动子构建到pCAMBIA 1381Z-Luc载体上，同时将目的基因构建到pMDC43或pMDC32或pORE载体上作为超表达载体进行后续的瞬时转化实验。
通过农杆菌转化的方式，将上述构建好的质粒转化到农杆菌菌株GV3101的感受态细胞中。
三、材料的准备
1、烟草植株5-6周幼嫩未开花植株
2、携带质粒的农杆菌（GV3101或An105均可）
3、YEB培养液（一瓶+K+R、一瓶只+R——pCAMBIA 1381Z-Luc载体为卡纳氯霉素抗性、Gv3101只有r抗性）
4、处理液： 10mL配方如下 母液配方（10ml配方）：
0.5M MES 200ul 0.976g
1M MgCl2 100ul 2.03g
100mM乙酰丁香酮 10ul 0.196g（使用DMSO溶解）
灭菌水加至10ml （若长时间保存，需避光！）
四、操作步骤
1、农杆菌转化
2、转化正确的农杆菌进行过夜培养，同时培养P19菌株（最好先进行划线）
3、确定不同农杆菌所加菌液的量：
计算公式：V=n×Vfinal×0.5/OD600 VP19= n×Vfinal×0.3/OD600
OD600最好在1以上 n=注射叶片数 Vfinal=悬浮后的终体积多为2ml或3ml
农杆菌介导的共转化体系的研究进展
1 共转化的研究现状
1.1 电激法介导的共转化
两个不同的外源基因（其中一个为标记基因）分别构建在两个不同的Ti质粒上。混合后通过电激法转化原生质体，共转化率为20%-25%，连锁基因的共转化率更高，为50%-100%。通过电激法已成功地将多基因转入双子叶植物的原生质体，并且共转化率可以与单基因的转化相媲美，但单子叶的电激法共转化相对较难。
1.2 PEG(聚乙二醇)介导的共转化 Leszek A.Lyznik通过PEG介导法成功地将位于不同质粒上的gus基因和nptⅡ基因同时转入玉米的原生质体，得到了大量的共转化的愈伤组织，共转化率为50%。由于转化率明显受到分离原生质体的方法以及培养条件的影响，其共转化率并不十分稳定。
1.3
基因枪介导的共转化 将带有不同外源基因的Ti质粒混合在一起，包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。这种方法转化的基因数量多，而且效率也高。Hadi Mz用基因枪将12个质粒同时转化到大豆的胚发生悬浮培养组织中。多数转基因大豆都带有所有的质粒，并且经常是共整合在基因组的同一位点或相同的位点，因此每种质粒被吸收和整合的概率相同。不同的研究小组得到的共转化率分别为40%-60%、47%-50%、33%-60%。连锁基因的共转化率 为100%。通过基因枪得到的转基因苗常常出现多拷贝现象，每个基因可多达10-15个拷贝；转基因植株多数是按孟德尔规律遗传，但有时会出现非孟德尔遗 传现象：有时不能将外源基因传给后代，或者传代率很低。可能是外源基因插入后引起染色体结构不稳定，或者插入到一个对胚珠受精以及发育必需的基因内，从而
使遗传异常化。
1.4 农杆菌介导的共转化 农杆菌Ti质粒转化系统与其他基因转化体系相比，具有许多突出的优点：①该转化体系是模仿或称之为利用天然的转化载体系统，成功率高，效果好；②农杆菌Ti质粒转化系统的机理研究得最清楚，方法最成熟，应用也最广泛；③农杆菌Ti质粒转化系统转化的外源基因以单拷贝为多数，遗传稳定性好，并且多数符合孟德尔遗传规律，因此转基因植株能较好地为育种提供了中间选育材料；④农杆菌Ti质粒转化系统操作比较容易，需要的仪器设备简单，易于推广。农杆菌介导的共转化又可以细分为几种方法，以两个基因的共转化为例，可分为：
农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究
农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究
植物遗传转化技术是一项广泛应用于作物改良和生物制药领域的重要技术手段。其中农杆菌介导的植物遗传转化技术是目前最为常用和成熟的一种转化方法。本文将对农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进行介绍和探讨。
一、农杆菌介导的植物遗传转化技术原理
农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种土壤杆菌，是一种天然的植物病原菌。它通过菌体上存在的Ti质粒（tumor-inducing plasmid）和T-DNA（transfer
DNA）片段，将外源DNA片段导入植物细胞并整合到植物基因组中，导致细胞核内出现转化的植物细胞。因此，农杆菌介导的植物遗传转化技术也被称为农杆菌转化。
农杆菌介导的植物遗传转化技术包括以下几个步骤：农杆菌感染植物细胞、T-DNA整合进入植物细胞、T-DNA片段内的外源DNA导入植物细胞基因组、以及转化细胞的筛选和检测等。其中，农杆菌感染植物细胞是整个转化过程的关键步骤，需要通过构建合适的载体和适当的农杆菌菌株，使其能够有效地感染到目标植物细胞。
二、农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进展
农杆菌介导的植物遗传转化技术已经被广泛应用于许多作物品种的改良和基因功能研究中。例如，利用农杆菌转化技术可将外源基因导入烟草、玉米、水稻、小麦、大豆等许多重要的作物中，实现对它们特性的改良。
在农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究和应用中，也出现了许多问题。其中，影响转化效率的因素包括转化载体、农杆菌菌株、植物品种、转化条件等。此外，还存在着难以破解的难题，例如植物细胞壁难以透过、转化后细胞的不稳定性、外源基因的稳定性等。 为了提高转化效率和成功率，许多研究者着眼于改进农杆菌转化系统，包括构建新的载体、筛选适合的农杆菌菌株、研究植物细胞壁和农杆菌感染机制等。一些新型转化技术，例如粒子轰击法、激光微加工技术和等离子膜处理技术等，也被尝试用于植物遗传转化中，但它们还需要进一步的研究和优化。
农杆菌介导的Thaumatin基因转化烟草的研究
江西农业学报２０１３，２５（７）：５０—５２ Ａｅｔａ Ａｇｒｉｃｕｈｕｒａｅ Ｊｉａｎｇｘｉ
农杆菌介导的Ｔｈａｕｍａｔｉｎ基因转化烟草的研究
崔波 ，蒋素华 ，田云芳 ，武振江 ，袁秀云 ，马杰
（１．郑州师范学院生物工程研究所，河南郑州４５００４４；２．河南农业大学生命科学学院，河南郑州４５０００２）
摘要：以暗培养３ ｄ的烟草叶片为受体，以Ｔｈａｕｍａｔｉｎ为目的基因，应用根癌农杆茵介导法对烟草进行遗传转化，同
时以烟草叶片为材料，对影响转化的几个因素进行优化研究，结果表明：侵染２０ ｒａｉｎ、美罗培南浓度为２５ ｍｇ／Ｌ时有利于提 高转化率；经浓度为２．０ ｍｇ／Ｌ的Ｐ 筛选获得的抗性植株经ＰＣＲ、ＧＵＳ组织化学染色和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析鉴定，初步证明
外源基因Ｔｈａｕｍａｔｉｎ已整合到烟草的基因组中。 关键词：Ｔｈａｕｍａｔｉｎ基因；烟草；根癌农杆菌；遗传转化 中图分类号：Ｑ７８５ 文献标志码：Ａ文章编号：１００１—８５８１（２０１３）０７—００５０—０３
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈａｕｍａｔｉｎ Ｇｅｎｅ ｉｎｔｏ Ｔｏｂａｃｃｏ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｍｅｄｉａｔｉｏｎ
ＣＵＩ Ｂｏ ，ＪＩＡＮＧ Ｓｕ—ｈｕａ ，ＴＩＡＮ Ｙｕｎ—ｆａｎｇ ，ＷＵ Ｚｈｅｎ—ｊｉａｎｇ２，ＹＵＡＮ Ｘｉｕ—ｙｕｎ。，ＭＡ Ｊｉｅ （１．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５００４４，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｅｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏｂａｃｃｏ ｌｅａｖｅｓ ｕｎｄｅｒ ｄａｒｋ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ ３ ｄａｙｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ａｎｄ ｔｈｅ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅ Ｔｈａｕｍａｔｉｎ ｗａｓ ｔｒａｎｓ— ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｏｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｗａｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｓｅｖｅｒａｌ ｆａｃｔｏｒｓ， ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ ２０ ｒａｉｎ ａｎｄ Ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ ｏｆ ２５ ｍｓ／Ｌ ｗｅｒｅ ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｐ ｏｆ ２．０ ｍｇ／Ｌ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｌａｎｔ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｌａｎｔ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ， ＧＵＳ ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ Ｔｈａｕｍａｔｉｎ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｔｈａｕｍａｔｉｎ ｇｅｎｅ；Ｔｏｂａｃｃｏ；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ；Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
烟草 BY -2细胞培养集应用实验报告
烟草 BY -2细胞培养集应用实验报告
烟草 BY -2细胞培养集应用实验报告：
实验步骤
1. BY-2 细胞培养
烟草BY -2 细胞悬浮培养在摇床上，避光，温度260 C，转速130r
pm，每7天将 1m l 细胞转入20m l新鲜的液体培养基中继续培养。BY -2 愈伤组织生长在固体培养基上，每3-4周继代一次。转基因的悬浮细胞和愈伤组织生长在含相应抗生素的培养基中。
2. 用干转化的农杆菌GV3101的准备
(1)接种农杆菌单菌落到2 ml新鲜的YEB液体培养基中，28“培养过;
(2)取200ul培养物加到l0ml新的培养基中继续培养3-4小时:
(3) '5000 rpm,离心5 min集菌，用BY-2液体培养基重悬菌体，OD为0.5左右，待用。
3. 农杆蔺介导的烟草BY-2悬浮细胞的外源基因转化
(1)取生长到第3或4天的BY-2细胞4 ml，加入上述备用的农杆菌液100ul，共培养 3天;
(2) 500 g离心2 min，收获细胞并用BY-2液体培养基(Amp 500
mg/L)洗3次 :
(3)将细胞稀释后铺于BY-2固体培养基的平板(Kan 100 mg/L, Amp
500mg /L )上，26℃黑暗培养。
(4)四周后，取出生长良好的愈伤小块，打散后放入液体培养基悬浮培养。
4. 农杆菌介导的烟草BY-2愈伤组织的外源基因转化
(1)取培养2-3周的烟草愈伤组织小块浸入农杆菌液中20 min，取出用无菌滤纸吸干，置BY-2 培养基平板(无抗生素)上培养2天;
(2)取出愈伤小块，用无菌水洗4次，然后用含抗生素(Amp 500
mg/L)的无菌水浸泡30-60m in;
(3)取出愈伤小块，用无菌滤纸吸干，置于培养BY-2的平板(Amp500mg/L，Kan100mg/)上。
(4)培养四周后，挑出生长的愈伤小块，转移到新的抗性平板(Kan
100 mg/L)上继续生长;
农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究
农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究
孙蔓莉;孟玉玲;张强;黄桂艳;单卫星
【摘 要】通过探究根癌农杆菌(Agrobacterium tume aciens)介导的烟草瞬时表达体系的影响因素,确定烟草瞬时表达的最佳条件,为目的基因的功能研究提供技术支持.利用马铃薯晚疫病抗性基因RB和致病疫霉菌效应基因Avrblb1作为报告基因,采用农杆菌介导的注射渗透法,摸索农杆菌菌悬液OD600值和菌系(遗传背景)、烟草品种及其生长时期等因素,确定烟草高效的基因瞬时表达条件.研究结果表明:介导烟草基因瞬时表达的根癌农杆菌菌悬液适宜OD600值为0.3～0.8;在菌悬液OD600值为0.1及以上时,AGL1、GV3101和C58C1介导的报告基因瞬时表达效率相似,均引发较强的叶片坏死反应;在农杆菌菌悬液0D600值小于0.1时,AGL1介导的瞬时表达效率最高.测试的烟草品种都具备较高的瞬时表达效率,苗龄6～8周的烟草适合分析.通过测试农杆菌菌悬液OD600值和菌系(遗传背景)、烟草品种及其生长时期等因素,确定本氏烟和普通烟均可实现基因高效瞬时表达的条件.
【期刊名称】《西北农业学报》
【年(卷),期】2015(024)001
【总页数】5页(P161-165)
【关键词】烟草;基因瞬时表达;注射渗透法
【作 者】孙蔓莉;孟玉玲;张强;黄桂艳;单卫星
【作者单位】西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100
【正文语种】中 文
【中图分类】S432.2
在植物组织中可通过2种方法表达异源基因：稳定表达和瞬时表达[1]。瞬时表达较前者具有简单、快速、周期短、准确等优点，表达效率稳定，转化率高，并且不产生可遗传的子代，生物安全性高[2]。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的瞬时表达体系是分析基因功能的快速有效的方法，可应用于转基因互补[3-6] 、启动子功能分析[7-8] 和蛋白表达[9-10] 等方面。
农杆菌的转化流程
农杆菌的转化流程
方案一
1. 农杆菌的培养及感受态的制备① 农杆菌菌株划YM平板，26-28℃培养48 h；② 挑取单菌落接种到40 ml 无抗生素的YM液体培养基中，250 r/min，
26—28℃悬浮培养12-16 h； ③ 将菌液转入灭过菌的50 ml离心管中，4℃,8000
r/min，离心8 min；④ 弃上清，加入用100 mM NaCl (4℃预冷)重悬收集的农杆菌；⑤4℃，8000 r/min, 离心8 min；
⑥ 弃上清，加入原始菌液1/50体积（800l/管（此时的感受态农杆菌可以直接用于转化)并分装成100l）的20 mM CaCl2重悬菌体；⑦ 置液氮中10 s，放入-20℃冰箱中保存备用。
2。农杆菌的转化（冻融法）
将感受态农杆菌置于冰上，加入1g质粒DNA(体积不宜超过10 l），充分混匀，冰上放置30 min;② 置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中，待其融化；③ 加1 ml 无抗生素的YM 液体培养基于28℃，230 r/min 培养2-4
h；（或直接用1 mll，留500 l于管中④ 3000 r/min 离心2 min收集菌体，将上清吸去500 培养菌直接涂布含抗生素的YM平板）；⑤ 重悬菌体并涂布到含有适当抗生素的YM平板上吹干, 28℃培养48 h；⑥ 挑取单菌落接种到筛选液体YM培养基中，28℃，250 r/min 培养48 h，将菌液用于保存或转化；注:EHA105抗利福平霉素，LBA4404抗硫酸链霉素。在转化前后的所有培养基中均可加入相应的这两种抗生素,以防止杂菌污染。以上挑菌及抗生素加入工作均在超净台上进行。
3．转基因烟草体系的建立⑴ 烟草无菌苗的培养：① 70%乙醇消毒烟草种子30 s后，用无菌水清洗两次，更换NaClO处理25-30 min，无菌水清洗四次；②
将灭菌后的种子移至1/2 MS固体培养基（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、1.0 mg/L维生素、2.0 mg/L 苷氨酸、3％ 蔗糖、0.6—0.7％ 琼脂(KOH 调至pH 5。7-5。8），于25-26℃，14 h光照/10 h黑暗条件下萌发；③ 14天后,将萌发出的烟草幼苗转移至含有相同1/2 MS培养基的组织培养盒中，同样条件下继续培养4—6周，小苗长出后可用于叶盘转化。⑵ 农杆菌介导的烟草叶盘转化和愈伤组织的筛选 于无菌条件下将无菌苗的成熟叶片除去叶边缘和主要叶脉，切成0。5 cm的小方块，浸泡在MS液体培养基悬浮的用于转化的农杆菌菌液中；② 10 min后取出叶片于灭菌的滤纸上吸去菌液,以叶片上表面接触培养基，8—9片/培养皿，排列于倒有共培养基（MS（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4)、1.0 1℃光照培养箱中，14mg/L维生素、2.0 mg/L甘氨酸、3％ 蔗糖、0.6—0.7％琼脂、pH 5。7-5。8）的平皿中，置于24 h光照/10 h黑暗条件下共培养48 h；③ 1℃恒温摇床上振荡漂洗45—60当看到叶片与培养基接触边缘长出白色农杆菌时，将叶片转移至不加激素的MS液体培养基中,约28 min，夹出叶片放于灭菌的滤纸上除去多余的液体培养基；④ 将叶片上表面朝向培养基，8片/皿排列于生芽筛选培养基（MS(大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、500 mg/L Carbincine、300 mg/L