牛结核病检测仪
牛结核病核酸检测仪
一、仪器简介牛结核病是由牛结核分歧杆菌感染后导致，是一种慢性传染病，奶牛最敏感，患病牛出现咳嗽、消瘦及呼吸困难等症状。
该病传染性极强，会传染人及其他动物，受到该杆菌所致结核病的人数超过13%，不仅会造成严重的经济损失，还对人类健康造成了极大威胁。
牛结核病核酸检测仪采用荧光定量PCR 技术对牛结核分歧杆菌进行检测，灵敏度高，特异性强，在发病早期即可作出准确的诊断，是牛结核病理想的检测仪器。
二、检测范围检测样本包括：粪便、血液、乳汁、尿、气管分泌物、胎盘、淋巴结、乳房等组织。
三、仪器特点BioG T16荧光定量PCR仪是我公司吸收了国外先进技术最新推出的实时荧光定量PCR检测系统，该机性能稳定，反应效率高，具有卓越的检测灵敏度，具体特点如下：
1.采用独特的光学设计路径，光信号非常稳定，并能检测到极弱的荧光信号。
与传统检测技术相比，仪器检测灵敏度较高，可以检测到弱阳性样本和早期感染样本，不会漏诊，能够及时发现牛结核病感染病牛，避免养殖损失；
2.采用Taqman探针技术，引物、探针双重特异性保证，特异性高，不会误诊；
3.可生成标准曲线，对病原体进行定量检测，实时评估病情发展和治疗效果，指导进一步用药；
4.高通量设计，一次可检测16个样品，每个样品可检测2种病原体，可同时检测多个项目，最多可同时检测32个项目；
5.人性化软硬件设计，大尺寸（10吋）触摸屏控制，图标式设置，操作极为舒适简便。
6.除牛结核病外，还可广泛用于传染性牛鼻气管炎、牛副流感、牛轮状病毒病、牛冠状病毒病、牛水疱性口炎、牛蓝舌病、牛白血病、牛产肠毒素大肠杆菌病、牛流行热、牛布鲁氏菌病、牛肺疫、牛口蹄疫、牛副结核病等感染性疾病的检测，可广泛应用于动物疫病预防控制部门、养殖场、屠宰场,牛肉制品生产企业等。
结核分枝杆菌实验报告
一、实验目的1. 了解结核分枝杆菌的生物学特性及致病机理；2. 掌握结核分枝杆菌的培养、分离、鉴定及检测方法；3. 增强实验室操作技能，提高对结核病的防控能力。
二、实验原理结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是一种革兰氏阳性细菌，是引起结核病的病原体。
本实验通过培养、分离、鉴定及检测结核分枝杆菌，了解其生物学特性及致病机理。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）结核分枝杆菌菌种；（2）牛肉浸液；（3）鸡蛋；（4）石炭酸复红染液；（5）无菌生理盐水；（6）无菌试管；（7）酒精灯；（8）高压蒸汽灭菌器；（9）显微镜；（10）生物安全柜。
2. 实验仪器：（1）恒温培养箱；（2）电热恒温水浴锅；（3）无菌操作台；（4）超净工作台；（5）显微镜。
四、实验方法与步骤1. 菌种复苏（1）将冷冻保存的结核分枝杆菌菌种复苏于牛肉浸液中，37℃恒温培养24小时；（2）观察菌落生长情况，记录结果。
2. 分离纯化（1）将复苏后的菌液涂布于牛肉浸液琼脂平板上，37℃恒温培养24小时；（2）挑取单菌落进行纯化，重复涂布、培养，直至获得纯化菌落。
3. 鉴定（1）挑取纯化菌落，用无菌生理盐水洗涤，制成菌悬液；（2）将菌悬液滴加于石炭酸复红染液中，37℃恒温染色30分钟；（3）用无菌生理盐水冲洗，观察菌体形态及染色特性；（4）挑取染色阳性菌落，进行生化试验，如氧化酶试验、触酶试验等，以鉴定结核分枝杆菌。
4. 检测（1）挑取纯化菌落，制成菌悬液；（2）将菌悬液滴加于含有药物的琼脂平板上，37℃恒温培养24小时；（3）观察药物对菌落的抑制作用，判断药物对结核分枝杆菌的敏感性。
五、实验结果与分析1. 菌种复苏：复苏后的菌落呈白色，表面光滑，呈干燥状，有明显的溶血现象。
2. 分离纯化：纯化后的菌落呈白色，表面光滑，呈干燥状，有明显的溶血现象。
3. 鉴定：挑取染色阳性菌落，进行生化试验，结果显示氧化酶试验、触酶试验均为阳性，符合结核分枝杆菌的生物学特性。
牛副结核分枝杆菌的分离及鉴定
牛副结核分枝杆菌的分离及鉴定LIU Hong-xiu;CHENG Yu-di;DANG Guang-hui;LI Tian-tian;LI He;CUI Zi-yin;SONG Ning-ning;CHEN Li-ping;LIU Si-guo【摘要】为进一步确定新疆某奶牛场疑似感染副结核病的病原菌,本研究采集了37头疑似患病奶牛的直肠刮取物,应用卵黄琼脂培养基对其进行分枝杆菌的分离培养,经菌落形态观察、抗酸染色以及多重PCR等方法对分离菌进行病原学鉴定,并利用副结核分枝杆菌亚型鉴定引物进行PCR扩增及测序分析.结果显示,分离培养的7株分离菌均为抗酸染色阳性的分枝杆菌;经多重PCR鉴定,其中3株谱型与副结核分枝杆菌k10参考株一致;进一步通过基因分型的PCR扩增及测序分析,确定这3株分离菌均为牛副结核分枝杆菌.本研究为进一步开展该菌病原学和流行病学研究提供了必要的研究资料.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2018(040)012【总页数】4页(P1177-1180)【关键词】副结核分枝杆菌;分离培养;多重PCR;亚型鉴定【作者】LIU Hong-xiu;CHENG Yu-di;DANG Guang-hui;LI Tian-tian;LI He;CUI Zi-yin;SONG Ning-ning;CHEN Li-ping;LIU Si-guo【作者单位】【正文语种】中文【中图分类】S852.61副结核病(Paratuberculosis)又称为副结核性肠炎，是由副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis，MAP)引起的反刍动物的慢性消化道疾病，该病以顽固性腹泻、渐进性消瘦、肠黏膜增厚并形成皱襞为特征。
世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的动物疫病，我国将其列为B类疫病。
根据菌株的培养特性及致病力将MAP分为牛型、羊型和生物中间型3个亚型[1]。
两病检疫操作规程
结核检疫操作规程材料准备：酒精棉、卡尺、1ml注射器、针头、剪毛剪刀等。
操作方法：将牛编号后在颈左侧上1/3处剪毛（或提前一天剪毛），三个月内犊牛也可在肩部进行，用卡尺测量术部中央皱厚度，做好记录。
注射剂量：不论大小牛只，一律皮内注射1万国际单位，皮内注射0.1毫升牛型提纯结核菌素。
注射方法：先以2%碘酊进行局部消毒再以75%酒精消毒局部，然后皮内注入定量的牛型提纯结核菌素，注射局部应出现小泡，如注射有疑问时，应另选15 cm以外的部位或对侧重作。
注射次数和观察反应：皮内注射后72小时判定，仔细观察局部有无热痛、肿胀等炎性反应，并以卡尺测量皮皱厚度，做好详细记录。
对疑似反应牛应即在另一侧以同一批菌素同一剂量，进行第二次注射，再经72小时后观察反应。
结果判定：阳性反应：局部有明显的炎性反应，皮厚差等于或大于4mm以上者，其记录符号为（+）。
疑似反应：炎性反应不明显，皮差在2.1—3.9mm间，其记录为(±). 阴性反应：无炎性反应，皮差在２mm以下，其记录为（—）初次被判定为疑似的牛只：于第一次检疫30天后进行复检，其结果仍为可疑反应时，经30—45天后再复检。
如仍为疑似反应，应判为阳性。
布鲁氏杆菌病检疫操作规程材料准备：酒精棉、针头、试管、保定器等。
操作方法：将牛编号后对应试管编号，保定牛后将采血部位消毒后方可采血，血样采取事项的具体要求采血部位在奶牛尾静脉或颈静脉进行。
采血器要求是必须用消毒过的一次性采血器进行采血,并且每根采血器,只能单独使用于某头牛。
采血量要求是每头牛只的采血量为1.5~2.0毫升。
血样存放要求是每头牛只血样立状放置。
实验室操作：材料准备：记录本、布鲁氏虎红平板凝集抗原等操作方法：登记试管号后，准备一块消毒的玻璃板，画成若干个4平方厘米小格。
取被检血清和抗原（抗原使用时充分摇匀），各一滴（30微升）等量混合后，用牙签或火柴棒搅拌均匀，在四分钟内读出结果（注：室内温度±18℃）同时做阴阳性对照。
上海市奶牛场奶牛结核病和布鲁菌病的净化措施
上海市奶牛场奶牛结核病和布鲁菌病的净化措施刘洋%#吴洁％卢军+张幸怡％杨志强％苏衍菁%"（1光明牧业有限公司上海2004362滑县光明生态示范奶牛养殖有限公司河南安阳4564003上海市动物疫病预防控制中心上海200436%［摘要&奶牛结核病和布鲁菌病（简称"两病"）是人畜共患病，具有易传染、发病率高、死（率低、净化难度大的特%，已严重危害奶业的持续发展和人体健康。
为了更好地组织实施奶牛两病的检测净化工作，本文基于上海市实际情况，从指导思想和工作原则入手，提出目标任务和实施步骤，逐步实现奶牛两病净化目标，对各地组织开展奶牛两病检测净化工作具有指导意义。
关键词：结核病；布鲁菌病；净化；措施；奶牛奶牛结核病和布鲁菌病（以下简称“两病”）是分别由结核杆菌和布鲁菌引发的人畜共患病，被世界动物卫生组织列为二类动物疫病。
奶牛两病在世界各地广泛分布％。
近年来，随着全国牛羊饲养总量、运输调运量和交易量的持续上升，奶牛两病的监测阳性率呈上升趋势。
奶牛两病的存在，对人体健康、奶产业发展、畜牧经济发展以及奶制品出口必然造成极大的影响［2］0因此，如何加强奶牛两病防控工作，防止两病的扩散和传播，是急需研讨和解决的问题近年来，上海市的奶牛两病防控工作在各级部门的不懈努力下，取得了一定成效，奶牛两病监测阳性率已控制在0.1%以内，达到稳定控制标准；但每年仍有两病阳性牛检出，奶牛两病的威胁依然存在。
尤其是近年来上海市每年从外省市购入大量活羊，导致羊布鲁菌病输入性风险不断加大，成为公共卫生安全隐患，并危及奶牛布鲁菌病多年来的防控成果，影响了奶牛两病的净化进程4.根据《上海市中长期动物疫病防治规划（2013—2020年）》主要人畜共患病防治考核要求，上海在2015年应达到奶牛结核病和畜间布鲁菌病净化标准，到2020年全市维持奶牛两病净化标准。
目前，奶牛两病防控净化工作已进入了攻坚阶段。
1两病净化实施方案健全消毒、免疫、无害化处理、人员培训等规章制度。
牛结核病的诊断方法
牛结核病的诊断方法作者：隗金玲来源：《现代畜牧科技》 2016年第9期隗金玲（黑龙江省宾县畜牧兽医局，黑龙江哈尔滨150400）摘要：牛结核的诊断有临床诊断、血清学诊断、细菌学诊断和变态反应诊断等方法，其中最有实际意义的是变态反应诊断。
至于临床和细菌学诊断只对少数有明显症状的牛才有一定的诊断价值，血清学方法目前对结核病的诊断意义不大，很少应用。
本文对几种常用的诊断方法进行简要介绍，以供参考。
关键词：牛；结核病；诊断中图分类号：S858. 23文献标识码：B文章编号：2095-9737(2016)09-0124-011 临床诊断结核病畜多数不呈现明显症状，对于这种隐性的结核病是不易诊断的，在结核病的防治中占有特别重要的位置，所以必须仔细地进行流行病学调查和临床观察。
体表淋巴结剧烈肿大时，则可能为全身性结核；乳房淋巴结肿大或乳房后两个乳腺区发生境界不明的无痛无热的硬结，表面凹凸不平或乳头萎缩，可能感染乳房结核；胸部叩诊呈现实音或半实音，并有杂音、摩擦音，以及直肠检查发现体壁腹膜有密发的珍珠样结节时，可能是感染浆膜结核；阴道流出混浊的黏液，其中混有白色或黄色浮游物甚至血丝，常配不孕，发情不正常，流产以及输卵管变硬时，可能是感染生殖器官的结核；如果发生消化障碍，习惯性腹痛，慢性腹泻与便秘交替或粪便稀薄，混有黏液、脓汁或血汁，以及直肠检查触知肠系膜淋巴结肿大时，可能是感染肠结核。
2 细菌学诊断对确定开放性结核病特别重要。
对可疑为开放性肺结核进行细菌学诊断时，可用棉拭子采取气管黏液或用病牛喷出的干痰块涂片作抗酸性染色进行细菌检查，必要时制成乳剂进行动物接种试验。
病畜常吞咽从肺内咳出的痰汁，细菌即可经过胃肠随着粪便而排出体外。
因此通过粪便也可以检出开放性结核病畜。
①硫酸法：在痰液内加2倍量的6%的硫酸溶液后远心沉淀20min，用3%的苛性钠溶液1～2滴将沉淀物中和。
②安替佛尼法：病料内加2倍量的安替佛尼液，放置温箱1—2h后远心沉淀，用3%醋酸溶液中和沉淀物或用蒸馏水洗涤几次即可，处理后的痰液可作动物接种。
牛结核病的症状表现与治疗措施
牛结核病的症状表现与治疗措施
牛结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病。
牛结核病主要通过直接接触感染、空气传播和飞沫传播等途径传播给人类。
牛结核病的症状表现主要包括以下几个方面：
1. 呼吸系统症状：牛结核病感染后，可出现咳嗽、喘息、气促等呼吸困难症状。
2. 消化系统症状：患有牛结核病的牛可出现消化不良、食欲减退、腹泻等症状。
3. 体重下降：牛结核病会导致牛的食欲减退，消化功能受损，从而导致体重下降。
4. 外观改变：患有牛结核病的牛可能体态消瘦、毛色暗淡、精神不振。
在治疗牛结核病时，需要采取以下措施：
1. 隔离：对于确诊患有牛结核病的牛，应尽可能与其他牛分开，避免传播给其他牲畜。
2. 检疫：对于与患有牛结核病的牛接触过的其他牲畜，应及时进行检疫，排除感染
的可能。
3. 接种：对于尚未感染的牛，可以考虑接种结核疫苗，提高其抵抗力，减少感染的
风险。
4. 药物治疗：对于确诊的牛结核病患者，可以使用抗结核药物进行治疗。
常用的抗
结核药物包括异烟肼、利福平等。
5. 杀牛：对于无法通过药物治疗恢复健康的牛，或者为了防止疾病传播，需要考虑
将其宰杀。
6. 监测和预防：对于疫区的牛群，应定期进行结核病病情监测，及时发现和隔离疑
似感染者，避免疾病的扩散。
牛结核病的症状表现包括呼吸系统症状、消化系统症状、体重下降和外观改变等，治
疗措施主要包括隔离、检疫、接种、药物治疗、杀牛和监测预防等。
牛结核病的防控工作
需要全面加强，以减少其对人类和牲畜健康的危害。
结核杆菌TBPCR荧光扩增检测说明书
结核杆菌TBPCR荧光扩增检测说明书【正文】结核分枝杆菌（TB）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒说明书 Operation Introduction for Mycobacterium tuberculosis(TB) PCR Fluorescence Diagnostic Kit 前言本试剂盒采用一对PCR引物和一个荧光双标记的探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，从而将PCR技术和荧光检测技术结合起来，实现了对TB 核酸的自动化检测。
检测灵敏度为10个TB菌/毫升。
试剂盒在PCR循环结束后无需开盖。
试剂盒中采用了dUTP-UNG酶防污染系统。
本品可用于可疑结核病患者经处理的痰液标本结核分枝杆菌核酸的定性检测，可用于结核病的辅助诊断。
试剂盒组成※ 贮存条件及有效期本试剂盒贮存于-20℃的条件下有效期为一年（请于有效期内使用）。
自备试剂 4％ NaOH、灭菌生理盐水样本采集、存放及运输1．采集：以清晨第一口痰为宜。
先用清水漱口，嘱患者用力咳出深部的痰于无菌样本保存管，密封，即可送检。
2．存放：待测样本在2-8℃保存不应超过24小时；-20℃保存不超过三个月；-70℃以下长期保存。
应避免反复冻融。
3．运输：采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。
适用仪器 1．BIO-RAD iCycler荧光PCR检测仪、PE Gene Amp 7700荧光PCR检测仪 2．Roche LightCycler荧光PCR检测仪 3．其它荧光PCR检测仪，如PE-5700、PE-7000、基因公司Rotor-Gene、MJ公司Opticon Monitor、大和Line-Gene荧光定量PCR检测仪等使用方法1．样本处理（样本处理区）1.1. 首先对痰液样本进行目测，若样本中唾液占绝大部分，则需重新采集样本。
1.2. 目测合格后，在样本中加入2～3倍体积4%的NaOH溶液，置于摇床上，在150rpm、37℃条件下处理30min或常温下1Hr，使其充分液化（无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全；若液化不完全，可适当再加入少量4%的NaOH溶液直至液化完全）。
牛副结核病的发病过程及诊断方法
饲料博览2020年第3期疾病防控Disease Control and Prevention收稿日期：2019-12-23作者简介：王荣芳（1971-），男，内蒙古通辽人，助理兽医师，主要从事畜禽防疫、监管工作。
*通讯作者：教授，E-mail:***************1牛副结核病概述牛副结核病是由副结核分枝杆菌引起的一种慢性消耗性肠炎，对牛养殖业危害较大。
本病在我国也一直存在，而且在规模化养殖逐步替代传统散养模式的过程中其对养牛业的潜在威胁逐渐凸显。
因此，了解副结核病的发病过程并及时诊断对控制该病的发生至关重要。
牛副结核菌感染的临床表现包括腹泻、消瘦以及产奶量减少等。
这些临床症状通常会在初次感染后两到五年出现，发病牛肠壁会明显增厚，抑制营养吸收，随着病程的发展最终消瘦脱水致死。
多数牛副结核菌感染发生在犊牛期，被粪便污染的水、牛奶等均为感染途径，同时也可能垂直传播。
牛对副结核菌感染的敏感性具有年龄依赖性，犊牛在前3个月最易感，在4~12月龄易感性逐渐减弱，这时感染副结核菌需要更高的感染剂量和时间。
2牛副结核病发病过程2.1副结核菌入侵肠道病原菌最早可经扁桃体黏膜侵入宿主，而扁桃体隐窝可能是副结核菌的感染部位，细菌经扁桃体进入后可随血液扩散到肠系膜淋巴结和回肠，但多数研究表明其入侵部位主要在回肠。
副结核菌侵入肠道后，小肠淋巴结中M 细胞携带其穿过上皮细胞，并将细菌释放于黏膜下层，位于黏膜下层的细菌可被巨噬细胞吞噬。
有报道称，将副结核菌接种于回肠后，5h 内感染部位巨噬细胞中即可检测到副结核菌的存在，而一旦副结核菌成功在巨噬细胞内寄生，感染将进入下一阶段。
2.2副结核菌入侵巨噬细胞巨噬细胞吞噬副结核菌后，首先将试图消灭副结核菌。
由Th-1型淋巴细胞产生的多种细胞因子，如干扰素-γ等可以活化巨噬细胞，并对吞噬的副结核菌产生杀灭作用，部分免疫力强的牛可以成功消灭侵入的副结核菌，不会发展为副结核病。
但许多受感染牛不能清除副结核菌则会导致其在宿主巨噬细胞内持续生存并继续扩增。
结核病实验室检测新诊断技术
HAIN和目前常规药敏方法比较
比较项目 时间
生物安全级别要求 人员培训
操作简易程度 仪器设备
HAIN 1-2天 较低 2-3天 简单 性价比较高
常规药敏方法 2-3个月
二级实验室 2-3个月 复杂 --
对环境洁净度要求
较高，易出现 假阳性
较高
四、GENECHIP基因芯片耐多药 检测技术
适用范围： 1、TB复合群鉴定。 2、TB菌种鉴定。 3、利福平和异烟肼耐药检测 。 原理：多重PCR扩增和反向杂交来识别。
，
耐药检测基因芯片
基因芯片是基于特定基因位点突变与耐药性的相关性，通 过PCR扩增和核酸杂交技术，检测荧光信号的有无，判断 特定位点的突变情况和细菌耐药性的检测方法。
结核分枝杆菌耐药检测基因芯片基于rpoB/katG/inhA的基 因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌耐药性 （利福平、异烟肼）。
发光二极管荧光显微镜（LED）
镜下视野
发光二极管荧光显微镜（LED）
不需要加热玻片，步骤简单 视野比普通的显微镜大大2-4倍 • 对数目少的不必使用镜油 • 节省人力时间，时间为普通的1/4每天可检查至少60个涂
片 • 可帮助早期诊断肺结核 – 即使菌浓度较低 • 杆菌也有很高的灵敏度，与ZN相比阳性发现率平均增加
适用范围：痰涂片镜检 十一五国家重大科技专项：泰兴、江阴 厂家：湖南天骑公司 原理：集菌法
流程图
痰标本消化灭活 基片的夹层杯
离心 细菌附着在基片
在夹层杯中
直接染色 取出基片
于载玻片上
镜检 自动阅片计算机报告系统。
所需仪器设备：普通的抗酸染色液、彭氏杯 （专利）、涂片机、KP21型快速干片机、抗 酸杆菌自动阅片计算机报告系统。
结核杆菌的研究进展-PPT课件
结核疫苗研究进展
第二种策略是对已接种卡介苗的儿童进行强化免疫，进而加强免疫应答并将免疫保护力延续至成人阶段。这一策略目前公认的最佳方案是应用亚单位疫苗加强免疫。亚单位疫苗组成明确，结构简单，可应用于有免疫缺陷的人群，倍受人们关注。亚单位疫苗主要是由有限数量的抗原构成，所引起的保护性免疫应答也高度集中。但其在体内滞留时间短，免疫应答的持续时间也较短，必须与佐剂联用才有效，使其应用受到限制，几种主要的候选疫苗均采用了将单抗原与多聚蛋白融合的方法，这样不仅增强了单抗原的免疫力，也易于进行规模化生产。所以佐剂的发展对强化免疫策略的实现功不可没。
结核杆菌诊断技术研究进展
4、噬茵体报告技术 该技术原理为，萤光素酶指示的分枝杆菌噬菌体与在含抗结核药物培养基中短暂培养的待检菌混合后，能感染活的耐药菌，使之表达萤光素酶基因，再加入萤光素底物，活菌会产生荧光，而敏感菌无荧光产生。此办法直观性高、用时短，但如要被广泛应用于结核杆菌的快速检测还需要进一步的探索．必须使用标准化的细菌、标准化的萤光素酶系统，以及标准化的培养基和发光检测仪，并能与用常规方法所测最低抑菌浓度值相符。
结核疫苗研究进展
第三种策略是将重组BCG 和亚单位疫苗或两种以上的疫苗结合到一起，从而解决结核疫苗免疫效果低下这一难题，虽然这个方法要求至少需要几年的时间进行第三期临床试验，这就需要做一个时间计划表来设法减少疫苗期试验，做一个成功的疫苗接种计划。
结核疫苗研究进展
从疫苗结构完整性来看一般可分为：重组BCG、亚单位疫苗、DNA 疫苗基因和缺失疫苗等。
结核杆菌诊断技术研究进展
3、MB／BacT系统 MB／BacT系统是由德国Heipha—Biotest公司生产的一种液体培养基系统，该系统对标本中结核分枝杆菌复合群(MTBC)初代分离率高于全自动分枝杆菌检测系统(BACTE)TB460，可以通过肉眼观察到细菌生长，且无放射性污染.但不能用于分支杆菌的菌型鉴定。