烟草遗传转化实验(仅供参照)
内容作参考 1 实验八 植物细胞悬浮培养
实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。
实验器材：
超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。
配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。
实验材料：烟草叶片愈伤组织。
实验方法：
1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等放入工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。
2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入150ml三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。
3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。
4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养基时称取重量。
5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。
6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图：
鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。
内容作参考 2
烟草遗传转化实验
实验目的
烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。本实验以烟草为实验材料，了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。
实验要求：
掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。
实验原理
根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒，简称为Ti质粒。野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T－DNA区，含致瘤基因；另一个是毒性区，在T－DNA的切割、转移与整合过程中起作用。用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建，是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，并在T－DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。
p BI121载体是常用的植物表达载体，载体的骨架是pUC18，以CaMV35S启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素（kan）抗性选择标记基因，含有卡那霉素抗性基因作为筛选基因。β－葡萄糖苷酶gus基因作为报告基因，转化的获得的转基因细胞、组织或植株，具有抗卡那霉素的特性，经组织化学染色呈蓝色。
实验器材
摇床、超净工作台、小型离心机、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、酒精灯、棉球、培养皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。
实验材料
植物材料：烟草无菌苗
农杆菌与载体：农杆菌LBA4404 p BI121
YEB培养基：牛肉膏(5 g/L)、蛋白胨(5 g/L)、酵母提取物(1 g/L)、蔗糖(5 g/L)、MgSO4 (0.5
g/L)、pH 7.0
烟草分化培养基：MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA
烟草生根培养基：MS + 0.5mg/L IAA
卡那霉素（Kan）母液：50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。
头孢霉素（cef）母液：300mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。
利福平(rif): 50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。
内容作参考 3
实验步骤
1. 农杆菌感受态的制备：
1) 接菌于5 ml YEB液体培养基(Rif 50 mg/L)中，28℃，200转/分钟，培养1～2天；
2) 取1mL活化的菌液接种于50mlYEB液体培养基中，同样条件下培养至OD600值为0.4～0.6左右。
3) 将菌液倒入50mL的离心管中，冰浴20分钟。
4) 4℃，5000g离心10分钟，收集菌体。
5) 用0.15M NaCl /0.1M CaCl2中悬浮细胞。
6) 5000 rpm离心5分钟，去上清；
7) 用冰预冷20mM CaCl2重悬沉淀，如不是马上使用，加入甘油分装，液氮速冻后，-70℃保存。
2. 农杆菌感受态细胞的转化：
1) 取200 µl感受态细胞于Eppendorf管；
2) 加入1 µg质粒DNA，混匀，冰浴30分钟；
3) 立即放入液氮中冰冻5分钟；(-70℃放置10min)
4) 取出Eppendorf管，立即放入37 oC水浴5分钟；
5) 加入YEB培养基l ml，28oC，150 rpm摇床培养2～3小时；
6) 离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEB培养基中。
7) 在YEB固体培养基(Kan 50 mg/L, Rif 50 mg/L)涂板；
8) 28 oC下暗培养2～3天；
9) 挑单菌落，提取质粒，酶切，电泳检查。
10) 取转化菌株培养液于1.5 ml的离心管中，加15%的无菌甘油，贮存在-70 oC长期保存。
3. 农杆菌活化
1）挑取携带植物表达载体质粒的农杆菌单菌落，接种在3～5ml含50mg/L rif 和50mg/L Kan的YEB液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养过夜,直至对数生长OD600为0.6-0.8。
2）活化过夜的农杆菌按1：100～1：50的比例接种在相同的20-50ml YEB液体培养基中，继续培养至对数生长期。
内容作参考 4 4. 外植体的侵染及共培养
1）取烟草无菌叶片，切成4～6mm的叶盘到无菌瓶中，加入农杆菌菌液，感染10min，期间轻微振荡，取出外植体用无菌滤纸吸去附着的菌液。
2）将浸染过的外植体接种在分化培养基上，暗培养2d~4d。
5．筛选培养
将共培养的外植体转移到含cef 300mg/l和50mg/L Kan分化培养基上，25℃，光照培养。每隔3-4周继代一次,，待转化后的外植体长出大量丛生芽。
6．生根培养：培养筛选的抗性芽长1～1.5cm时，从基部将芽切下，并转入含有300mg/L Cef和50mg/L Kan的生根培养基上诱导生根，获得具有卡那霉素抗性的转基因植株。
思考题
1. 利福平、卡那霉素、头孢青霉素在培养过程中各起什么作用？
2. 简述农杆菌介导途径进行基因转化的机理及操作步骤。
烟草子房注射法转基因试验
烟草子房注射法转基因试验
烟草子房注射法转基因试验
邹颉1，余婧1，付强1，李世升2*
【摘要】[摘要] 为了快速获得转基因烟草，对烟株子房注射处于对数生长期的含有外源基因的根癌农杆菌菌液。结果表明：通过初步的50 mg/L Kana抗性筛选及PCR检测，烟草子房注射法能成功获取转入的外源基因得到转基因烟草。烟草子房注射法与烟草叶盘转化法等常规转基因方法相比，子房注射法简化了试验过程，缩短了试验周期，提高了试验效率。
【期刊名称】贵州农业科学
【年(卷),期】2013(000)012
【总页数】3
【关键词】[关键词] 转基因；根癌农杆菌；烟草；子房注射
植物基因工程技术已在烟草等作物品种改良及模式植物研究上得到广泛应用。近几十年来，植物转基因技术已经有了长足的发展，这些技术的成功运用对于基础科学的研究和农业生物技术的发展有着极大的促进作用[1-3]。目前的转基因技术主要分为两大类，一类是直接将基因导入到植物体内并整合，如早些年的化学诱导法(PEG法)、电激法，新发展起来的基因枪法(通过将目的基因片段和重金属颗粒包被整合，直接通过基因枪轰击植物分生组织获得转基因植物材料)[4-6]。另一类是以根癌脓杆菌作为介导的遗传转化方法，此方法在目前的应用最为广泛。根癌农杆菌拥有一套独特的Ti质粒系统，与现有的经过改造的双元载体系统相结合能够方便地将目的基因转入到植物基因组中[7-8]。通过农杆菌浸染进行转基因是一个相对复杂而繁琐的工作，在此过程中，愈伤的产生以及愈伤分化成整体植株的过程需要相当精确的操作技巧；此外，不同的植物转
小麦转录因子基因TaWRKY18在烟草和小麦中的遗传转化
小麦转录因子基因TaWRKY18在烟草和小麦中的遗传转化
1 引言
小麦作为世界上重要的粮食作物,其进行基因工程改良一直倍受关注。自1993年Chan TM[1]利用农杆菌转化水稻获得转基因植株以来,农杆菌介导的转化方法在禾本科作物上的研究迅速展开,玉米和水稻已经建立相对完善的转化体系[2,3] , 直到1997 年,Cheng M等[4]才报道了利用农杆菌介导法获得gus(β-2葡萄糖苷酸酶)基因的转基因植株。随后,农杆菌介导小麦遗传转化在许多实验室取得了成功。Xia GM等[5] 1999年获得农杆菌介导的nptⅡ基因的小麦当代转化植株。本试验是在小麦成熟胚组织培养研究的基础上,以小麦成熟胚愈伤组织为受体,对农杆菌介导的小麦遗传转化的主要因子,如外植体预培养时间、共培养时间、抗生素( Kan)筛选压、头抱霉素浓度、接种菌液浓度和侵染时间等进行优化,以提高小麦遗传转化效率,为小麦的基因工程遗传改良育种奠定基础。
烟草易于进行组织培养和基因转化,易得到再生的转化植株,是典型的基因工程模式植物。而本生烟草更具有生长速度快、生命周期短的优点[6]。
植物遗传转化(genetic transformation) 是指利用重组DNA 技术、细胞组织培养技术或种质系统转化等技术,将外源基因导入植物细胞或组织,获得转基因植物的技术[7]。
植物基因工程研究起于本世纪八十年代中期。自其诞生至今，如何将这项技术应用于小麦、水稻、玉米等农作物的遗传改良研究便始终是人们努力的重要目标之一。要实现这一目标，首先要建立一套高效、可靠、重复性好的基因转化体系。而在植物基因转化系统研究方面，禾谷类相对于其他单、双子叶植物而言，具有起步晚、困难大的特点，而小麦相对于其他禾谷类如水稻、玉米等又进一步表现出其滞后性和困难性。通常产生转基因植物的方法有两类，一类是借助于原生质体的直接转化法如PEG发法、电激法、脂质体法等，另一类是农杆菌介导的植物细胞、组织、器官直至完整支柱的基因转化方法。在原生质体化方面，由于用于游离原生质体的小麦胚型悬浮系的建立及由原生质体再生植株的艰难性，直到1988年才由小麦原生质体再生植株成功[8]，进而在1993年获得了小麦转基因植株[9,10]。迄今这方面的研究也很少，已建立的转化体系又普遍存在实验周期长、转化频率低和重复性差的缺点，限制了其进一步应用。农杆菌方面，Woolson等早在1988年即利用农杆菌的方法证明了小麦细胞的可转化性[11]，然而由于小麦不是弄杆菌的天然宿主，同时也由于当时人们对转化条件的认识尚不足，虽然其后甚至也获得了一些抗性愈伤组织，但是直到1997年才利用农杆菌转化法获得了小麦转基因植株[12]。
烟草瞬时转化实验步骤
烟草叶片瞬时转化实验
试验方法
一、实验材料及药品
pCAMBIA 1381Z-Luc载体、Gv3101农杆菌菌株及其感受态、MES、MgCl2、乙酰丁香通、5-6周本氏烟草等
二、载体构建及农杆菌转化
烟草瞬时转化实验选用融合Luc信号的pCAMBIA 1381Z-Luc载体，载体构建过程是将拟南芥及菊花的FT启动子分别采用双切双连的常规载体构建方式将启动子构建到pCAMBIA 1381Z-Luc载体上，同时将目的基因构建到pMDC43或pMDC32或pORE载体上作为超表达载体进行后续的瞬时转化实验。
通过农杆菌转化的方式，将上述构建好的质粒转化到农杆菌菌株GV3101的感受态细胞中。
三、材料的准备
1、烟草植株5-6周幼嫩未开花植株
2、携带质粒的农杆菌（GV3101或An105均可）
3、YEB培养液（一瓶+K+R、一瓶只+R——pCAMBIA 1381Z-Luc载体为卡纳氯霉素抗性、Gv3101只有r抗性）
4、处理液： 10mL配方如下 母液配方（10ml配方）：
0.5M MES 200ul 0.976g
1M MgCl2 100ul 2.03g
100mM乙酰丁香酮 10ul 0.196g（使用DMSO溶解）
灭菌水加至10ml （若长时间保存，需避光！）
四、操作步骤
1、农杆菌转化
2、转化正确的农杆菌进行过夜培养，同时培养P19菌株（最好先进行划线）
3、确定不同农杆菌所加菌液的量：
计算公式：V=n×Vfinal×0.5/OD600 VP19= n×Vfinal×0.3/OD600
OD600最好在1以上 n=注射叶片数 Vfinal=悬浮后的终体积多为2ml或3ml
农杆菌介导的烟草转化
准备菌液LB 300ml(加抗生素Kan,Rif)
1L MS, 分装300ml (SIM,无抗生素20个平板)，500ml(SIM,有抗生素，倒培养瓶)，200ml（液体，做悬浮液）
Kan,Rif / Basta,Rif
1. 根癌农杆菌的活化
挑取单菌落，接种于含抗生素的LB 液体培养基（Rif 50g/ml和Kan 50-100g/ml）中，28℃-30℃ 200rpm 振荡培养过夜。
2. 农杆菌介导叶盘法转化植物
① 农杆菌菌体处理
挑取农杆菌菌株接种于LB培养基中（含rif 50g/ml和kan50g/ml），200rpm，28℃培养 24h，菌液OD600至 1.0 左右，离心 10min（3000rpm），沉淀菌体。再用 10ml左右的MS液体培养基悬浮，稀释菌体的OD600值为 0.3-0.5。
② 叶盘法转化转化植物程序
选取理想状态的外植体，在超净台上剪成小方块或者打成叶圆片（大小不限），在制备好的农杆菌菌液中浸染 3-5min，置于无菌吸水纸 吸干，平铺于SIM（MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA）培养基（无抗生素）上黑暗共培养 2 天，2天后将外植体转移至含筛选因子的芽诱导培养基如SIM（MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+Basta
5mg/L+500g/ml的carb素或500Cef）上进行筛选。待有芽生成（3~4周）后，继续培养到苗高2~3厘米时，转入生根培养基RIM（MS+ kan50g/ml+500g/ml的羧卞青霉素或500Cef）上，进行根诱导生长。
Cb: 羧卞青霉素; Cef: 头孢霉素
烟草NtD14基因的遗传转化及其功能
烟草NtD14基因的遗传转化及其功能
徐琳;张泽;吕贤哲;李肇通;黄惜
【摘 要】D14是独脚金内酯信号传导关键基因.为了研究烟草D14基因(NtD14)的功能,笔者利用同源克隆的方法克隆NtD14基因,然后构建pCAMBIA1302-NtD14植物过表达载体,通过农杆菌介导的叶盘转化法将其转化烟草.结果表明,过表达NtD14基因烟草的株高低于野生型,叶片变短变小,但叶片长宽比无显著差异,转化株分枝数减少.ELISA分析发现,所有过表达NtD14转基因株系生长素含量低于野生型,说明NtD14基因转化烟草株高和叶片变小可能与生长素含量减低有关.此外,转基因株系的丙二醛(MDA)含量和过氧化氢酶(CAT)活性均显著高于野生型.转基因株系的过氧化物酶(POD)活性显著低于野生型,CAT和POD的含量成反比,但超氧化物歧化酶(SOD)的含量无显著性差异,说明过表达NtD14基因影响烟草体内的氧化还原反应.
【期刊名称】《热带生物学报》
【年(卷),期】2018(009)004
【总页数】8页(P401-408)
【关键词】独角金内酯;NtD14;烟草;遗传转化
【作 者】徐琳;张泽;吕贤哲;李肇通;黄惜
【作者单位】海南大学热带农林学院,海口570228;海南大学热带农林学院,海口570228;海南大学热带农林学院,海口570228;海南大学热带农林学院,海口570228;海南大学热带农林学院,海口570228 【正文语种】中 文
【中图分类】S682.31;S718.81
独角金内酯(Strigolactone)是一类以异戊二烯为基本单位的倍半萜烯化合物，是一种新发现的植物激素[1-2]。独角金内酯最先被发现在植物根的分泌物中，能作为信号物质诱导寄生植物独脚金的种子萌发。后来发现独角金内酯具有抑制侧芽分化的功能，对植物分枝数量、分枝角度、株高、根的发育和根毛的形成、叶片形态、茎粗等株型指标具有重要的调控作用[3-6]。独角金内酯是类胡萝卜素(carotenoid)合成途径的衍生物，目前大约有15种独角金内酯的结构已被解析[7]。许多种植物在缺磷胁迫下都会上调独角金内酯的合成，一方面通过木质部运输影响侧芽生长，另一方面通过根际分泌刺激丛枝菌根真菌菌丝的分支，对土壤养分缺失做出应答[8]。独脚金内酯通过一系列以类胡萝卜素作为前体的酶促反应合成。许多独脚金内酯生物合成相关基因已被克隆鉴定，如水稻的D27(Dwarf27)，D10(Dwarf10)，和HTD1 (high tillering dwarf)基因；拟南芥的MAX3(more axillary growth)，
烟草转化方案
利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法
[精华提要]通常，我们可以利用烟草的瞬时表达系统来观察感兴趣蛋白的亚细胞定位（通过与绿色荧光蛋白构成融合蛋白）。同时，还可以检测蛋白的表达量。这一个过程是通过农杆菌作为一个工具将目的基因整合到到烟草的细胞内的。
材料与试剂
1. 携带表达载体的农杆菌菌株（通常表达载体由35S启动子驱动）
2. 2-4周的烟草植株
3. LB培养基 4. 乙酰丁香酮
5. 2-(N-吗啉代) 乙磺酸
6. 抗生素
7. 注射器
工具
1. 50ml离心管
2. 光谱仪 3. 紫外灯
4. 荧光显微镜
步骤：
1. 挑取单克隆于5mlLB液体培养中，28-30°C震荡培养。通常，LB中加入100ug/ml庆大霉素（农杆菌株GV3101携带抗性），50ug/ml大观霉素（载体携带）。
2. 将1ml过夜培养的农杆菌转接到25mlLB液体培养基中（加有与1相同的抗生素，另外加入高压灭菌的乙酰丁香酮）。
3. 检测过夜培养的菌液OD600的值。
4. 5000g，15分钟集菌，用重悬液重悬菌体，最终OD600为0.4。
5. 室温放置2-3h后注射烟草。
6. 将侵染液装入5ml注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内（勿使用子叶）。注射后，烟草叶片会出现湿润的现象。
7. 注射后2-5天，在便携式长波长紫外灯下检测GFP荧光信号（只适用于荧光很强的叶片）。
8. 通过荧光显微镜或者激光共聚交荧光显微镜检测GFP信号。同时，可以提取蛋白，检测蛋白的含量。
配方
1. 加有相应抗生素的LB液体培养基（一种抗生素是菌株携带，一种为载体携带）。
烟草遗传转化体系的建立
本 科 生 毕 业 设 计（论文）
（ 2015届 ）
农业与食品科学学院
题 目： 烟草遗传转化体系的建立
学 号：
姓 名：
专业班级：
2015 年 5 月 18 日
本科生毕业设计（论文）诚信承诺书
我谨在此承诺：本人所写的毕业设计（论文）《烟草遗传转化体系的建立》均系本人独立完成，没有抄袭行为，凡涉及其他作者的观点和材料，均作了引用注释，如出现抄袭及侵犯他人知识产权的情况，后果由本人承担。
承诺人（签名）：
年 月 日
目录
本 科 生 毕 业 设 计（论文）.............................................................................................. 封1
本科生毕业设计（论文）诚信承诺书 ...................................................................................... 封2
1 前言........................................................................................................................................... 1
1.1 农杆菌介导法 .................................................................................................................. 1
烟草NtLS基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化
2011-08，32（4） 中国烟草科学 Chinese Tobacco Science 31 烟草NtLS基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化 王卫锋，太帅帅，王 鲁，刘贯山，李凤霞，高晓明，孙玉合* （农业部烟草类作物质量控制重点开放实验室，中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101） 摘 要：腋芽的形成涉及多个调控基因，其中关键基因编码的蛋白属于植物特有的GRAS蛋白家族，它的突变或功能缺失将影响腋生分生组织的形成。笔者利用RACE技术克隆了烟草NtLS基因（GenBank登录号EU935581），NtLS与调控植物腋生分生组织形成的基因LS/LAS/MOC1序列高度相似。本研究从该基因上选取干扰片段，构建了含有反向重复序列的RNAi干扰表达载体，并通过农杆菌侵染的方法转染烟草W38，以期为NtLS基因的功能研究奠定基础。 关键词：烟草；NtLS；RNA干扰 中图分类号：TS413 文章编号：1007-5119（2011）04-0031-05 DOI：10.3969/j.issn.1007-5119.2011.04.008 Construction of RNAi Vector of NtLS Gene and its Transformation in Tobacco WANG Weifeng, TAI Shuaishuai, WANG Lu, LIU Guanshan, LI Fengxia, GAO Xiaoming, SUN Yuhe* (Key Laboratory of Tobacco Quality Control, Ministry of Agriculture, Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China) Abstract: Axillary bud formation involves many regulatory genes, one of key factors belongs to the plant specific protein family GRAS. Mutation or function missing of these genes would affect the axillary formation. The tobacco NtLS gene (EU935581) was cloned by RACE technology in our lab. The sequences of NtLS are highly similar to those of LS/LAS/MOC1, which regulate the formation of axillary meristems. The interference fragments were chosen from NtLS and the RNAi expression vectors were constructed and transformed into Nicotiana tabacum W38 by agrobacterium-mediated leaf disc transformation methods, to form basis for further study of NtLS function. Keywords: tobacco; NtLS; RNAi 烟叶生产中，打顶之后烟株上的腋芽会迅速发生。腋芽的生长会消耗大量养分，如不及时去除，将导致烟叶产量减少，品质下降[1]。目前去除腋芽主要靠人工抹杈和使用抑芽剂。人工抹杈不但费工费时，而且抹杈造成的伤口利于一些病原菌的入侵，容易造成病害传播[2]。而抑芽剂多为有机合成，存在着影响烟叶品质、毒性残留以及环境污染等问题，而且使用成本较高。从腋芽形成的分子机理入手，利用分子育种手段可能是解决烟草腋芽问题的一条有效途径。 腋芽的形成由胚后发育形成的腋生分生组织决定，在腋生分生组织形成过程中涉及多个调控基因，如LS[3]、LAS[4]、MOC1[5]等，这类基因编码的蛋白属于植物特有的GRAS蛋白家族，它们的突变或功能缺失将影响腋生分生组织的形成。本研究利用RACE技术克隆了烟草NtLS基因（GenBank登录号EU935581），该基因的全长cDNA序列为1 847 bp，编码区为1 224 bp，编码407个氨基酸，基因序列不含有内含子[6]。NtLS与调控植物腋生分生组织形成的基因LS/LAS/MOC1序列高度相似。为了明确NtLS的功能，经过序列比对分析，我们从该基因上选取干扰片段，构建了含有反向重复序列的RNAi干扰表达载体pART27-FR，并通过农杆菌侵染的方法转化烟草品种W38，获得了转化烟草幼苗，为从分子手段研究烟草腋芽形成与控制奠定了基础。 基金项目：国家烟草专卖局重点资助项目（110200701021） 作者简介：王卫锋，男，硕士，研究方向为烟草分子育种。E-mail：sdwangweifeng@。*通信作者，E-mail：yhsun@ 收稿日期：2010-06-2132 中国烟草科学 2011年第32卷 1 材料与方法 1.1 材料 用于载体构建的基本质粒pKANNIBAL和pART27由Peter M. Water-house实验室惠赠。烟草品种W38及根癌农杆菌菌株EHA105为本实验室保存。大肠杆菌感受态菌株（DH5α）、植物基因组DNA提取试剂盒购自天根生化有限公司，Taq酶、限制性内切酶、质粒小提试剂盒、DNA片段纯化试剂盒以及琼脂糖凝胶回收试剂盒购自大连宝生物生物工程有限公司，T4 DNA连接酶购自NEB公司，小牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）购自MBI公司，其他试剂为国产分析纯产品。 1.2 方法 1.2.1 干扰片断的选择及引物设计 选取NtLS基因上的非保守区段708~1 041 bp间长334 bp的序列作为干扰片段。根据干扰片段的碱基顺序以及pKANNIBAL上intron两端的限制性内切酶位点，分别设计正、反向插入片段的扩增引物。正向片段引物F1：ata ctc gag CGA TCC ACA TCG TTG ATT TTG（引入XhoI酶切位点），F2：ata ggt acc ATC CTT AAC TTT TCG CGG TCT T（引入KpnI酶切位点），预期扩增片段为352 bp；反向片段引物R1：ata tct aga CGA TCC ACA TCG TTG ATT TTG（引入XbaI酶切位点），R2：ata aag ctt ATC CTT AAC TTT TCG CGG TCT T（引入HindIII酶切位点），预期扩增片段为352 bp。 1.2.2 正、反向片段扩增及中间载体构建 以烟草W38基因组DNA为模板，分别利用正、反向片段引物进行扩增。PCR反应程序为：94 ℃变性30 s，57℃复性30 s，72℃延伸45 s，30个循环后72℃延伸7 min。PCR产物经纯化后，分别利用XhoI/KpnI、XbaI/HindIII两对限制性内切酶和T4连接酶，将正、反向片段插入pKANNIBAL上的多克隆位点[7]，构建中间载体pKANNIBAL-FR，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞（DH5α），在含有Kan (50 mg/L)的LB培养基上进行筛选，挑取单菌落经扩大培养后提取质粒，进行XhoI/XbaI双酶切鉴定。 1.2.3 RNA干扰表达载体的构建 用NotI分别酶切中间载体pKANNIBAL-FR和表达载体pART27，电泳回收RNAi表达序列和酶切后的pART27。T4连接酶连接RNAi表达序列与CIAP处理酶切后的pART27，连接后的转化、筛选、及酶切鉴定同1.2.2，并送大连宝生物生物工程有限公司进行测序，测序上游引物为：CTA TCC TTC GCA AGA CCC T，测序下游引物为：TAG GCG TCT CGC ATA TCT C，将构建正确的RNAi干扰表达载体命名为pART27-FR。 1.2.4 农杆菌介导转化及转化体筛选 采用冻融法将pART27-FR导入农杆菌EHA105，叶盘法[8]转化烟草W38。转化体筛选的MS培养基中含有Kan (100 mg/L)和Carb (300 mg/L)。 1.2.5 转化烟草幼苗的PCR检测 以转化烟草幼苗的基因组总DNA为模板，根据RNAi表达序列上35S启动子、正（反）向特异片段以及终止子的序列，分别设计针对转化烟草幼苗的正（反）向插入片段的检测引物。正向插入片段检测引物PF-1：CCA CTA TCC TTC GCA AGA CC，PF-2：CGG TCT TTC AAG AGC CTG TG，扩增片段大小为388 bp。反向插入片段检测引物RT-1：TTA CAG TTG GGA AAT TGG GTT CG，RT-2：CAT AGG CGT CTC GCA TAT CTC，扩增片段大小为411 bp。扩增片段回收、纯化后，进行测序。 2 结 果 2.1 正、反向片段的PCR扩增 以W38基因组DNA 为模板，分别用携带有酶切位点的正、反向引物进行PCR扩增，电泳检测扩增产物，扩增片段大小与预期一致。将目的条带回收进行酶切反应。 2.2 中间载体pKANNIBAL-FR的酶切鉴定 纯化后的正反向片段分别利用XhoI/KpnI、XbaI/HindIII两对限制性内切酶和T4连接酶，对应插入在pKANNIBAL多克隆位点上，经XhoI/XbaI双酶切鉴定，酶切片段大小与预期大小一致，说明 第4期 王卫锋等：烟草NtLS基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化 33 已成功构建了中间载体pKANNIBAL-FR，形成在丙酮酸磷酸双激酶(pyruvate orthophosphate dikinase, PPDK)内含子序列两边分别含有正、反向NtLS基因特异片段的RNAi表达盒（图1）。 CaMV35S启动子 forward fragment PPDK内含子 reverse fragment OCS终止子 NotI XhoI KpnI HindⅢ XbaI NotI 图1 NtLs–RNAi表达盒示意图 Fig. 1 Expression box of NtLS-RNAi 注：forward fragment：正向插入的NtLs基因的352 bp片段；reverse fragment：反向插入的NtLs 基因的352 bp片段 2.3 RNA干扰表达载体pART27-FR的测序鉴定 将构建的干扰表达载体送大连宝生物生物工程有限公司进行测序，测序结果表明已成功构建了RNAi干扰表达载体pART27-FR（图2）。 2.4 转化烟草幼苗的PCR检测 以转化烟草幼苗的基因组总DNA为模板，以正向插入片段检测引物PF-1和PF-2进行PCR扩增；以反向插入片段检测引物RT-1和RT-2进行PCR扩增。电泳检测PCR扩增结果表明，RNAi干扰表达载体pART27-FR已成功转入烟草W38中（图3）。 3 讨 论 RNA干扰（RNAi）在许多生物中普遍存在，在真核生物中RNAi的功能主要表现在抵抗病毒复制表达、抑制转座子转座以及调控基因表达等方面，利用RNAi技术对于研究植物基因功能和转基因植物具有积极的意义。目前，植物RNAi介导的方法主要包括正义RNA介导的共抑制、反义RNA介导的基因抑制、病毒介导的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）和hpRNA介导的基因沉默[9]。其中，VIGS法采用幼苗或植株局部接种的方式，不能稳定遗传，因而无法对萌发期和幼苗期表达的基因功能进行研究[10]。正义RNA介导的共抑制和反义RNA介导的基因抑制的基因沉默效率为0%～30%，而hpRNA介导的基因沉默效率可达到48%～100%[7]。hpRNA介导的基因沉默已成为RNAi研究的热点，它具有有效率高、干扰作用持久、可稳定遗传给子代、应用范围广泛等优点[11]。 RNAi干扰载体构建过程中，干扰片段的长度和在靶基因中的位置将影响RNAi的效率和效果[9]。因此，干扰片段的选择是RNA干扰实验中的一个重要环节。一般情况下，选择的干扰片段长度应在90～900 bp 之间，选择的区段可以在基因的内部编码区，也可以在3′或5′端的非编码区，对于300 bp以上的干扰片段，基本可以保证被加工后所得的前体中包含能够有效进行RNA干扰的dsRNA。此外，为了避免非特异性RNA干扰的发生，在选择干扰片段时，对于基因的保守区域应该谨慎对待。在对烟草幼苗的检测过程中，也分别根据启动子和终止子序列设计了PCR扩增引物，试图对包括正向插入片段、内含子以及反向插入片段的区域进行扩增。但是，这样的尝试都没有成功，这很可能是由于该片段序列特殊，能够自身形成发夹结构，使引物不能与模板结合，导致PCR反应无法继续进行。 植物中存在着多条调控腋生分生组织形成的途径，对拟南芥的研究表明，LAS和RAX是两条相对独立的调控途径，LAS在REV的上游起作用，而RAX在CUC2的上游起作用，REV和CUC2又进一步对分生组织标记基因（STM）进行调控，LAS和RAX在功能上可能存在一定的互补[4,12]。由于植物中存在着多条调控腋生分生组织形成的途径，NtLS基因被RNA干扰后，腋生分生组织的形成可能会从其他途径得到补偿，本研究中，对于转基因阳性烟草的鉴定是在DNA水平的PCR检测，转基因阳性植株中NtLS基因在时空表达上的差异，还需进一步在RNA和蛋白质水平上进行研究，并结合植株形态观察，以确定NtLS基因的表达抑制效果及腋芽发生的变化。
ARF基因导人烟草的遗传转化研究
第２７卷第５期 ２００７年１Ｏ月 中南林业科技大学学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＶｏＩ．２７ ＮＯ．５ ０Ｃｔ．２００７ 文章编号：１６７３—９２３Ｘ（２００７）０５—０００６—０７
ＡＲＦ基因导人烟草的遗传转化研究
徐刚标 ，卢孟柱 ，陆燕 （１．中南林业科技大学，湖南长沙４１０００４；２．中国林业科学研究院林业研究所，北京１０００９１） 摘 要： 以烟草无菌苗叶片为外植体，利用叶盘法，将含生长素应答基因（ａｕｘｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ，ＡＲＦ）的根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４携 带双元质粒载体（ｐＢｉｎ４３８）介导进行遗传转化．结果表明：诱导烟草叶片不定芽的最佳分化培养基为ＭＳ＋０．８ ｍｇ・Ｌ ６－ＢＡ＋ ０．０５ ｍｇ・Ｌ～ＮＡＡ，生根培养基为１／２Ｍｓ＋０．０２ ｍｇ・Ｌ ＩＢＡ＋０．０２ ｍｇ・Ｌ＿。ＮＡＡ，分化率、生根率分别为９６．９％、９６．７％；将预 培养３ ｄ的外植体与农杆菌菌液浸染３～５ ｍｉｎ后，共培养２～３ ｄ，然后转化到含Ｋｍ７５ ｍｇ・Ｌ 的选择培养基上进行分化筛选，再转 入Ｋｍ为７５ ｍｇ・Ｌ～、１００ ｍｇ・Ｌ 的培养基上进行生根筛选，生根率为６６．１％；与对照相比，转基因烟草在形态上发生了明显的改 变，叶片颜色变深绿，叶片增厚，主叶脉变粗壮等．ＰＣＲ扩增，获得４Ｏ株阳性转基因苗，证明ＡＲＦ基因已导人烟草中． 关键词： 生物技术；ＡＲＦ基因；烟草；根癌农杆菌；遗传转化 中图分类号：Ｑ８１３．２；￥５７２ 文献标志码： Ａ
Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｘｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｆａｃｔｏｒ Ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ Ｔｏｂａｃｃｏ
ｘｕ Ｇａｎｇ—ｂｉａｏ ，ＬＵ Ｍｅｎｇ—ｚｈｕ ，ＬＵ Ｙａｎ （１．Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０００４，Ｈｕｎａｎ，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，ＣＡＦ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａｇｒｏ—ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＬＢＡ４４０４ ｍｅｄｉａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＢｉｎ４３８ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＡＲＦ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ＡＲＦ（ａｕｘｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ）ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ｔｏｂａｃｃｏ ａｓｅｐｔｉｃ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｌｅａｖｅｓ．Ｔｈｅ ｍａｉｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ．Ｔｈｅ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｓｈｏｏｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ｌｅａｆ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅ，ｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ０．８ ｍｇ・Ｌ一 ６－ＢＡ ａｎｄ ０．０５ ｍｇ・Ｌ一 ＮＡＡ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｒｏｏｔｅｄ ｏｎ １／２ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．０２ ｍｇ・Ｌ一 ＮＡＡ ａｎｄ ０．０２ ｍｇ・Ｉ 一ＩＢＡ．Ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｓｈｏｏｔｉｎｇ ａｎｄ ｒｏｏｔｉｎｇ ｗａｓ ９６．９％，９６．７％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｌｅａｆ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｉｍｍｅｒｓｅｄ ｉｎ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｆｏｒ ５——６ ｍｉｎｕｔｅｓ ａｆｔｅｒ ｂｅｉｎｇ ｐｒｅ—ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｏｒ ２ ｄａｙｓ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｃｏ—ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｆｏｒ ２——３ ｄａｙｓ．Ｔｈｅｎ，ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ７５ ｍｇ・Ｌ～ ｋａｎａｍｙｃｉｎ ａｎｄ ｒｏｏｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ７５ ｍｇ・Ｌ一 ａｎｄ １００ ｍｇ・Ｌ一 ｋａｎａｍｙｃｉｎ．Ｉｔｓ ｒｏｏｔｉｎｇ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｗａｓ ６６．１ ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ，ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｔｏｏｋ ａｎ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉ ｉｔｓ ｌｅａｖｅｓ ｗｅｒｅ ｇｒｅｅｎｅｒ ａｎｄ ｔｈｉｃｋｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｈｉｅｆ ｖｅｉｎｓ ａｒｅ ｂｏｌｄｅｒ ａｎｄ ｔｈｉｃｋｅｒ．Ｔｈｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｏｂａｃｃｏ ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｗｉｔｈ ＡＲＦ ｇｅｎｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ＡＲＦ ｇｅｎｅ；Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．；Ａｇｒｏｂａｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆｉｚｃｉｅｎｓ；ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ 生长素影响植物的生长发育，包括细胞分裂、细胞伸长和分化、顶端优势、植物向性、衰老、脱落以及促使某 些植物开花．目前，对生长素的合成及其在植物体内的运输，能在分子水平和细胞层次上认识它对植物生长发 育所起的作用ｎ］．近年来，有关生长素信号反应途径的研究已取得突破性进展，许多实验室都致力于生长素调 节的基因表达机制的研究，其中研究得最多的是生长素早期或原初的反应基因．这些基因的启动子通常包括最 小的生长素反应元件（ａｕｘｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ，ＡｕｘＲＥ）ＴＧＴＣＴＣ序列．生长素应答基因（ａｕｘｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ，ＡＲＦ）与这类生长素反应元件特异性地结合后调节着生长素反应基因的表达ｌ２ Ｊ． 烟草是基因工程进行遗传转化的模式植物，它具有操作容易、组织培养周期短、转化效率高等优点．为了研
烟草CHS基因RNA干扰载体的构建及其遗传转化
７８ 中国烟草科学Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ
烟草ＣＨＳ基因ＲＮＡ干扰载体的构建及其遗传转化
李尊强 ，一，杨爱国 ，常爱霞 ，张长静 ，郑吉云１，２，冯全福
（１．中国农业科学院烟草研究所，烟草行业烟草基因资源利用重点实验室，青岛２６６１０１； ２．中国农业科学院研究生院，北京１０００８１）
摘要：类黄酮化合物是烟草香气形成的重要前体物质，其形成需要多个调控基因的参与，查尔酮合成酶基因（ＣＨＳ）是类 黄酮物质合成途径中的关键基因，它的突变或沉默可能影响香气物质的形成。为了探讨ＣＨＳ基因的下调表达对烟草香气的 影响以及为选育优良的高香气品种提供技术，采用ＧＡＴＥＷＡＹ技术经ＢＰ反应和ＬＲ反应将ＣＨＳ基因片段重组到表达载体 ｐＨ７ＧＷｌＷＧ２（Ｉ）上，成功构建了具有反向重复序列的ＣＨＳ基因的ＲＮＡｉ表达载体，并通过农杆菌介导法转染烟草‘大白筋 ５９９’，以期为研究ＣＨＳ基因在烟叶香气物质方面的作用奠定基础。经过鉴定，获得２４株阳性转基因‘大白筋５９９’。 关键词：烟草；查尔酮合成酶；ＣＨＳ；基因；ＲＮＡｉ载体；遗传转化 中图分类号：￥５７２．０１ 文章编号：１００７．５１１９（２０１３）０５．００７８．０５ ＤＯＩ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００７．５１１９．２０１３．０５．０１６
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡｉ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ＣＨＳ Ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｏｂａｃｃｏ
ＬＩ Ｚｕｎｑｉａｎｇ ，ＹＡＮＧ Ａｉｇｕｏ ，ＣＨＡＮＧ Ａｉｘｉａ ，ＺＨＡＮＧ Ｃｈａｎｇｊｉｎｇ ，ＺＨＥＮＧ Ｊｉｙｕｎ ，ＦＥＮＧ Ｑｕａｎｆｕ （１．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｇｅｎｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｔｏｂａｃｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＣＡＡＳ，Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６１０１，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆＣＡＡＳ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１，Ｃｈｉｎａ）