细菌分离及鉴定的实验方案
从土壤里分离及鉴定细菌的实验方案 1实验材料：新鲜土壤。 a) 培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基； 高氏一号培养基 ；马铃薯蔗糖培养基；
细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培养基； LB培养基 b) 试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95% 乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等 c) 仪器：有玻璃珠100ml三角瓶（1）、培养皿（50套）、试管（20支）、移液管（3支）、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无菌操作台、灭菌锅、纱布，电子天平、记号笔，火材等
相关培养基的配方: 相关培养基的配方表
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 牛肉膏3g 蛋白胨10g 琼脂15—20g
水1000ml NaCl 5g PH 7．4—7．6
高氏一号培养基 可溶性淀粉20g 琼脂15—20g 水1000ml NaCl 0．5g KNO3 1g .K2HPO4•3H2O 0．5g MgSO4• 7H2O 0．5g
FeSO4•7H2O 0．01g
马铃薯蔗糖培养基
葡萄糖20g
马铃薯
200g 琼脂15~20g 水1000ml
细菌半固体培养基 肉膏蛋白胨液体培养基 琼脂0.35-0.4 PH 7.6
淀粉培养基 牛肉膏5g 蛋白胨10g 琼脂15~20g 水1000ml NaCl 5g 可溶性淀粉2g
葡萄糖酵解培养基 蛋白胨水培养基1000ml 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1-2ml PH 7.6 乳糖酵解培养基 牛肉膏3g 蛋白胨10g
1.6%溴甲酚
紫乙醇溶液1-2ml 水1000ml NaCl 5g 乳糖5g
LB培养基 酵母膏5g 蛋白胨10g
水1000ml
NaCl 10g PH 7.0
1.1实验总流程
❖ 1土壤取样： LB培养基 2制备土壤稀释液： 2.1. 称取土壤1g，放入99mL无菌水的三角瓶中，振荡 20min，即为稀释10-2的土壤悬液。 2.2. 另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔分别编上10-3、10-－4、10-5、10-6。取已稀释成10-2的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10-3的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10-3土壤稀释液。同法依次连续稀释至10-4、10-5 、10-6,10-7土壤稀释液。 在土壤稀释过程中，需换用不同的吸管（或枪头） 3倒平板富集培养 3.1 按照配方分别在三种培养基上富集培养，每一个稀释梯度每一个培养做三个平行实验。其如下表： 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
A
B C
高氏一号培养基
A
B C
马铃薯蔗糖培养基
A
B C
3.2吸取稀释液 取一吸管，以无菌操作法分别吸取10-4、10-5、 10-6,10-7土壤稀释液0.1mL，加在已制好的平板培养基上。 3.3涂板 用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，倒置于恒温箱培养。 3.4计算出每克土壤中细菌的数量。 细菌数=某一培养皿内真菌的菌落数×该培养皿接种液的稀释倍数即得
4分离 4.1配置LB培养基 4.2划线 4.2.1连续划线法 将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。完毕后，倒置于28～300C温室培养。 4.2.2分区划线法 用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在培养基的一边作第一次平行划线3—4条，再转动培养皿约600C角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于温室培养。
10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 连续划线法 A B C
分区划线法 A B C
4.4斜面培养 将分离好的菌接种到斜面培养基上培养保存 5鉴定 5.1细菌菌的基本形态及运动性鉴定 a) 简单染色步骤 i. 涂片 取一块载玻片，在上边用胶头滴管加半滴无菌水，用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；（注意取菌不要太多） ii. 干燥与固定 涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准； iii. 染色 将载玻片平放于载波片支架上，滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可，染色1.5min iv. 水洗 倾去染液，将载玻片的涂菌面朝下，自来水冲洗，水流不宜太急、太大，至洗出水无色为止； v. 干燥 用吸水纸吸去多余水分后自然干燥； vi. 镜检 将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌的形态。 b) 革兰氏染色步骤 i. 涂片 先在载玻片一侧用记号笔标记间隔的四个区域，在另一侧四个区域的位置分别滴加半滴无菌水。分别取四种活跃生长期菌种（大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌和一种自选菌）按常规方法涂片（不宜过厚），用酒精灯按照简单染色中所述干燥和固定的方法对四种菌进行干燥和固定。 ii. 初染 滴加草酸铵结晶紫染液使之覆盖涂菌部位，染色1.5min后水洗； iii. 媒染 先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min后水洗； iv. 脱色 先用乙醇冲去水迹，然后用95%乙醇覆盖脱去色素，脱色约30s，立即用水冲洗； v. 复染 先用番红洗去水迹，然后滴加番红复染1.5min后水洗； vi. 镜检 将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌。分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照，来判断枯草杆菌以及另一种自选菌的染色结果。 c) 半固体穿刺法观察细菌运动性 i. 配制培养基 配制半固体牛肉膏蛋白胨培养基，分装于4支试管内，110度灭菌20-30分钟，正立于烧杯中冷却至室温； ii. 在无菌操作台上右手握接种针,以针挑取菌苔.垂直刺入半固体琼脂培养的中心直至接近(但勿触及)试管底,然后循原路退出。如图所示：
接种完成后在30℃条件下培养两天观察并判断其运动性。 5.2细菌菌的生理生化试验 a) 淀粉水解试验 i. 培养基制备 配制淀粉培养基，灭菌后将冷却至50℃左右，无菌操作制成平板； ii. 接种 用记号笔将平板划成四部分，将所鉴定的菌种在不同位置点种。（注：由于四种菌对淀粉的水解程度不同，为防止由于接种量过大导致四种菌对应区域水解部位发生重叠，宜采用点种的方式，如下图）。接种完成后贴好标签； iii. 培养 将上述已接种的平板倒置于30℃培养箱中培养48小时。 b) 葡萄糖发酵试验 i. 培养基配制 将配制好的葡萄糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。 ii. 接种 用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。取盛有葡萄糖发酵培养基的试管2支，接种鉴定菌，另一支作为对照。 iii. 培养 将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时。 c) 乳糖发酵试验 i. 培养基配制 将配制好的乳糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。 ii. 接种 用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。取盛有乳糖发酵培养基的试管2支，接种鉴定菌，另一支作为对照。 iii. 培养 将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时。 d) 甲基红试验 i. 培养基的配制 将配制好的蛋白胨水培养基分装于试管中后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。 ii. 接种 用记号笔在各试管上标明所接种的菌名。取盛有蛋白胨水培养基的试管2支，接种鉴定的菌种。 iii. 培养 将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时。 任务分配情况 组 成员 任务
第一组 A组 土样采集
B组 土样稀释
第二组 A组 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基下的富集培养 B组 高氏一号培养基下的富集培养 C组 马铃薯蔗糖培养基下的富集培养
第三组 A组 LB培养基的制备 B组 连续划线法 C组 分区划线法
第四组 A组 大肠杆菌的基本形态及运动性鉴定
B组 大肠杆菌的生理生化试验
土传病害生防菌的分离筛选及鉴定
Screening and Identification of Antagonisms Against the Soilborne Pathogens
(1Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Anhui Academy of Agricultural Sciences , Hefei 230031;
陈丽园等： 土传病害生防菌的分离筛选及鉴定
·9·
土传病害危害程度深。20 世纪 70 年代， 美国俄亥俄州 大学植物病理学教授 Hoitink 等[1]首次利用树皮制作的 堆肥， 成功地防治苗圃中严重的根腐病、 疫霉病和立枯 病等土传病害， 开拓了利用土壤有益微生物对土传病 害进行防治的研究领域。生物防治具有高效、 零污染、 不产生抗药性和防治结合等优势， 其中生防有机肥集 生物肥和有机肥的优点于一身， 有机肥作为拮抗菌的 载体， 能为其提供足够的碳、 氮源， 延长其在土壤中的 生存时间， 使其容易形成优势菌群， 从而有效抑制了病 原菌的生长
基金项目： 国家现代产业技术体系 “国家现代产业技术体系 （蛋鸡） 专项经费” (CARS-41-K19)。 第一作者简介： 陈丽园， 女， 1981 年出生， 福建永定人， 助理研究员， 硕士， 主要从事饲料及环境微生物方面的研究。E-mail： semidry2@。 通讯作者： 詹凯， 男， 1968 年出生， 安徽安庆人， 研究员， 博士， 从事家禽育种及生产研究。通信地址： 230031 安徽省合肥市农科南路 40 号省农科院创 新大楼 402 室 安徽省农科院畜牧所， Tel： 0551-62160598， E-mail： zhankai633@。 收稿日期： 2014-02-20， 修回日期： 2014-05-12。
土壤中分解尿素尿素的细菌的分离与计数
2
将涂布好的培养皿放在30 ℃温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。
比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。
挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图2-10的颜色反应。
03
02
01
为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
另一种方案(空白对照)：
可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验,增加实验组数(每同学做四个平板)，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。
一种方案(相互对照)：
实验方案有两种
实验的具体操作步骤如下:
土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装（事先要灭菌）入准备好的信封中。
土壤中某样品细菌的分离与计数
四、实验案例
准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。
加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌
不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌
加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌
不加含碳有机物的培养基:分离自养微生物
5
不含碳、氮源的培养基：分离自养固氮微生物
实验方案(双歧杆菌的分离)
1双歧杆菌的分离1.1样品取出生后20天母乳喂养健康婴儿粪便。
1.2培养基根据目前的双歧杆菌选择性培养基，以及X-Gal在这方面的应用。
选择使用NPNL培养基，在其基础上添加X-Gal。
1.2.1缓冲蛋白胨水溶液（BP）成份：蛋白胨10gA磷酸氢二钠2g葡萄糖5g 磷酸二氢钾2g氯化钠5g 蒸馏水1000ml制法：精确称取各种试剂，加人到1000ml的蒸馏水中，加热溶化后分装于250ml的三角瓶中，每瓶90ml，121°C，杀菌15min后置4°C的冰箱中备用。
1.2.2选择性改良NPNL培养基（苏世彦）成份：酵母膏5g淀粉0.5g蛋白胨10g L-半胱氨酸0.5g胰蛋白胨5g溶液A10ml大豆蛋白胨5g溶液B5ml葡萄糖10g溶液C50ml乳糖3g琼脂A15g吐温801g pH7.2牛肝提取液150ml制法：将各成分准确量取后，分别加热溶化，混合摇匀后分装，121C杀菌10min，备用。
溶液A：K2HPO4 10g、KH2PO4 10g 溶于蒸馏水100ml。
溶液B：FeSO ・7H O 0.2g、MgSO ・7H O 4g、MnSO ・4H O4 2 8^42$ 4 20.135g、NaCl 0.2g 溶于蒸馏水100ml。
溶液C：丙酸钠30g、硫酸巴龙霉素400mg、硫酸新霉素200mg、NaCl 6g溶于蒸馏水1000ml。
1.2.3 NPNL培养基（孙雪）培养基成分及用量：牛肉浸汁粉（oxoid）3g，蛋白胨10g，胰蛋白酶5g，植胨3g,酵母浸出汁5g,肝浸出汁150ml，葡萄糖10g，可溶性淀粉0.5g，溶液A 10ml,溶液B 5ml,吐温80 1g,盐酸半胱氨酸0.5g, 琼脂15g，蒸馏水815ml, X-Gal（5-漠-4-氯-3』引噪-。
-D-半乳糖苷）60mg。
pH 7.2, 121 °C, 15min 高压灭菌。
溶液A：K2HPO4 25g, KH2PO4 25g，蒸馏水250ml。
实验二土壤中微生物的分离纯化及观察
实验结果
➢ 详细描述实验中各种微生物在斜面上、半固体和液体 培养基中的培养特征。
思考题
➢ 一个好氧的具周生鞭毛的菌株分别在斜面、半固体和 液体培养基中的培养特征。
➢ 用斜面检测微生物的培养特征接种时，为什么不要划 多条线或蛇形，而只要划一条直线？
➢ 接种环（针）接种前后灼烧的目的是什么？为什么在 接种前一定要将其冷却？如何判断灼烧过的接种环已 冷却？
法和步骤； ➢ 掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方
法。
培养基的种类
➢ 按成分不同分 天然培养基 合成培养基 半合成培养基
➢ 按培养基的物理状态分 固体培养基 半固体培养基 液体培养基
➢ 按培养基的用途分 基础培养基 营养培养基 鉴别培养基 选择培养基
培养基的配制方法和步骤
➢ 称量：按照配方正确称取各种原料置于搪瓷杯中； ➢ 溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解，补足水
（使样品中的微生物细胞充分分散，成单个细胞存 在），再取一定量的稀释液接种，使其均匀分布于培 养皿中特定的选择性培养基内，最后根据在平板上长 出的菌落数计算出每克或每毫升样品中的微生物数量。
实验器材 ➢ 土壤稀释液的三种不同培养基的培养平板 ➢ 菌种：大肠杆菌菌悬液 ➢ 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 ➢ 仪器或其他用具：1mL无菌吸管，无菌平皿，盛有
灭菌
干热灭菌 ➢ 火焰灼烧法 ➢ 干热灭菌法（烘箱内热空气灭菌法） 湿热灭菌法 ➢ 加压蒸汽灭菌法 紫外线灭菌法 微孔滤膜过滤除菌
火焰灼烧法
直接在火焰上灼烧灭菌 主要用于实验室接种针(环)、试管口、三角瓶口和金属小 工具等的灭菌。
干热灭菌法
设备：电热烘箱 适用于耐高温器皿，160-170℃，维持2小时 注意事项：
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
3.重复组的结果是否一致
如果各位同学选取的是同一种土样，统计的结 果应该接近。如果结果相差太远，则需要从各项操 作过程中去分析、寻找可能的原因。
六、课 题 延 伸
能分解尿素的细菌的鉴定
鉴定的原理： 细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，会使培养基
的pH升高。 鉴定方法：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指 示剂，利用此培养基进行细菌培养，观察培养基 的颜色变化。
三、设置对照
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试 因素对实验结果的影响
A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。 一是由于土样不同，二是由于培养基污染或培养基混有 其它氮源。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实 验方案有两种。一种方案是可以接种其它菌种，看是否 有菌落的出现，验证培养基是否混有其它氮源。另一种 方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培 养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
1.培养物中是否有杂菌污染以及选择 培养基是否筛选出菌落
对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长， 说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的 菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选 择培养基已筛选出一些菌落。Leabharlann 2.样品的稀释操作是否成功
如果得到了2个或2个以上菌落数目在 30～300的平板，则说明稀释操作比较成 功，并能够进行菌落的计数。
碳源是葡萄糖，氮源是尿素。
2.分析该配方的培养基对微生物是否具有筛选 作用？如果有，又是如何进行筛选的？
有筛选作用，它的氮源只含有尿素，只有能合 成分解尿素的脲酶的细菌才能生长。
二、 统计菌落数目
原理
运用稀释涂布平板法来统计样品中的活 菌数。
统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释 度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源 于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释 度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果 准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板 上，培养后再选择菌落数在30 ～300的平板进行 计数。
实验03土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
专题03土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、实验原理：（1）土壤中的细菌之所以能分解尿素是因为它们能合成尿酶。
（2）配置以尿素为唯一氮源的培养基，能够在这个培养基上生长的细菌就是能分解尿素的细菌。
二、操作步骤：(1)土壤取样①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。
②取样部位：距地表约3～8 cm的土壤层。
(2)样品的稀释测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养，当第一次做这个实验时可以将稀释的范围放宽一点。
(3)微生物的培养与观察①培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。
细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d。
②观察a．观察方法：每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
b．记录菌落的特征：包括菌落的形状、大小和颜色等。
2、灭菌培养基：高压蒸汽灭菌法3、培养皿灭菌：干热灭菌法三、操作提示(1)无菌操作①取土样的用具在使用前都需要灭菌。
②实验操作均应在酒精灯火焰旁进行。
(2)做好标记：本实验使用的平板和试管较多，为避免混淆，最好在使用前做好标记。
例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数操作中需注意的问题(1)为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
(2)恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键。
(3)为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组，目的是排除实验中偶然因素对实验结果的影响。
(4)分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
(5)为防止培养时间不足导致菌落遗漏，在菌落计数时，每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
环境工程微生物学大实验实验报告
环境工程微生物学大实验实验报告实验十二环境中四环素抗性细菌的分离鉴定组员：吴富华，张真，，金炯震环5205一、实验目的1、自行设计实验方案从环境中分离四环素抗性菌的实验方法。
2、分离获得四环素抗行菌。
3、检测并分析获得的菌株的四环素抗性强弱。
4、学会通过16SrDNA鉴定实验获得的菌株的种属。
二、实验要求1、自行设计实验证明富集培养是否成功。
2、观察并记录实验现象，作适当的分析或解释。
3、获得至少一株四环素抗性菌（不要多于三株），并进行短期保存。
4、根据实验视频指导和说明，完成菌株基因组DNA纯化，16SrDNA的PCR扩增。
5、比较各组筛选出的抗性菌抗性强弱。
6、各组间交流实验过程和实验结果，分析抗性菌抗性的影响因素。
7、养成良好的实验习惯和团队合作的作风，并给出评价。
三、实验器材1、培养基（营养琼脂，琼脂粉，酵母膏，胰蛋白胨，氯化钠），提供四环素，琼脂糖，灭菌条件。
2、室温和37℃恒温培养箱和摇床。
3、离心机，漩涡震荡仪，PCR仪，电泳仪，紫外成像分析仪。
四、实验步骤（略）1、配置富集培养基和四环素梯度培养基2、四环素抗性菌富集培养3、单菌株筛选4、四环素抗性强弱比较5、单菌株基因组DNA的提取6、16SrDNA的PCR扩增7、PCR产物电泳实验内容、具体操作单菌株基因组DNA提取（5.17进行步骤1-4；5.18进行步骤5-10；5.20进行步骤11）（1）选择5.8号挑选的菌株进行DNA提取实验；（2）取200μL菌液转移到1.5mL灭过菌的EP管中，10000rpm常温离心1min，去掉上清（得到菌细胞）。
菌细胞可在-20℃冻存。
（3）如果是革兰氏阳性菌，取100μL，1mg/mL的溶菌酶/TE加到菌液中，漩涡震荡混匀，37℃温浴1h（溶菌步骤）。
（4）用取液器（移液枪）缓慢吸加500μL（革兰氏阳性）或600μL（革兰氏阴性）裂解缓冲液和20μL，20mg/mL蛋白酶K（proteinase K），充分混匀，50℃过夜（完全裂解细菌并降解所有蛋白质）。
实验(二)土壤中微生物的分离纯化及观察
2.稀释:
0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml
原样
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
0.2ml
0.2ml
0.2ml
3.取样
10-4
10-5
10-6
4.倒平板：倒入融化后冷却至45℃的培养基15～２５ml， 置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀。
么？
当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在
一起时，你认为问题出在哪里？
用倾注法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不
同？为什么要培养较长时间（48h）后观察结果？
倾注法
涂布法
倒平板
a 皿加法
b手持法
细 菌Leabharlann 霉菌放线菌实验内容
一、稀释涂布平板法（全组完成）
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 ：涂布10-3、10-4、10-5三个剃度，每个剃度两 块平板 高氏Ⅰ号培养基：涂布10-2、10-3、10-4三个剃度，每个剃度两块平板 马丁氏（孟加拉红）培养基：涂布10-2、10-3、10-4三个剃度，每个剃度 两块平板
器材
分离源：自采集土壤样品
培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，高氏Ⅰ号 培养基、马丁氏（孟加拉红）培养基 溶液或试剂 盛4.5ml无菌水的试管，盛90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。
仪器或其他用具 振荡器，无菌培养皿，无菌 吸管，接种环，电磁炉，培养箱，吸耳球等。
一、稀释涂布平板法（全组完成）
1、编号：取无菌平皿１８个。另取无菌水４支，依次 标明10-2、10－3、10-4、10-5。
0.5ml
各4.5ml 无菌水
实验具体实施方案
课题设计（选题一：需1人完成）1、微生物的菌群随季节的变化规律(参照不同栽培年限人参根区土壤微生物区系变化和草原土壤微生物受放牧的影响及其季节变化）1.1 材料2011年3月,毛乌素沙漠采集供试土壤样品。
采用5点取样法采集人参根区5~10 cm处土壤样品,装入无菌聚乙烯自封袋中,采回土样即刻对微生物进行分离、鉴定。
1.2 材料处理采用稀释平板法[1-3]对真菌、细菌和放线菌进行分离和数量测定。
真菌的分离用马丁氏或马铃薯培养基;细菌的分离用牛肉膏蛋白胨培养基;放线菌的分离用高氏号培养基+重铬酸钾。
准确称取10 g已过筛土壤,加入盛有90ml无菌水的三角瓶中,加入玻璃珠后用振荡仪剧烈振荡30S,得10-1土壤悬浊液。
充分涡旋后,立即吸取1ml悬浊液加入另一盛有9ml无菌水的试管中,得10-2土壤悬浊液。
按上述方法依次将土壤稀释成10-3, 10-4, 10-5和10-6的悬浊液。
1.3 土壤微生物的分离、统计根据待分离的微生物类型,分别吸取不同稀释倍数的土壤悬浊液(真菌为10-3,放线菌为10-4,细菌为10-5)0.2m,l加入至预先制备好的平板培养基,用无菌涂布器将土壤悬浊液均匀涂布在培养基上,每种处理设3次重复。
将培养基在特定温度下恒温培养数天后观察、统计菌落数目。
真菌培养温度为25℃,培养时间为6~7 d;放线菌培养温度为28℃,培养时间为4~5 d;细菌培养温度为30℃,培养时间为2~4 d。
根据不同培养基中生长出的菌落数统计真菌、细菌和放线菌数量,结合土壤样品的稀释倍数,按照公式:土壤微生物浓度(cfu/g)=(菌落平均数×稀释倍数)/每皿菌液加入量(ml),求得土壤中可培养真菌、细菌和放线菌浓度。
统计结果用SPSS 18. 0进行显著性方差分析。
1.4结果与讨论：菌落总数的变化规律，做图表。
（选题二：需2人完成）2.微生物菌群随时间的变化规律微生物是土壤生态系统中的重要成员。
沙门氏菌生化鉴定结果
沙门氏菌生化鉴定结果
一、引言
沙门氏菌是一种常见的致病菌，可引起肠胃道感染，严重者甚至会危及生命。
因此，对于沙门氏菌的生化鉴定结果具有重要的临床意义。
二、样品来源
本次实验所用样品为从患者粪便中分离出的沙门氏菌。
三、实验方法
1.革兰染色法
首先进行革兰染色法，观察细胞形态和结构。
结果显示该菌为革兰阴性杆菌。
2.氧化酶试验
将沙门氏菌接种于含有1%亚硝酸钠的液体培养基中，加入少量Tetramethyl-p-phenylenediamine溶液，观察是否产生蓝色反应。
结果显示该菌不产生氧化酶。
3.卡波芬染色法
采用卡波芬染色法检测该菌是否产生荧光素类似物。
结果显示该菌不产生荧光素类似物。
4.甲烷双酚蓝试验
将沙门氏菌接种于含有甲烷双酚蓝的液体培养基中，观察菌落是否产生变色。
结果显示该菌不产生甲烷双酚蓝。
5.利用API系统进行鉴定
利用API系统对该菌进行鉴定。
结果显示该菌为沙门氏菌，鉴定号为1104。
四、结论
综合以上实验结果，可以得出该样品中分离出的细菌为沙门氏菌，并且通过API系统得到了具体的鉴定号码。
五、临床意义
沙门氏菌是一种常见的肠道致病菌，能够引起严重的肠胃道感染。
通过对沙门氏菌进行生化鉴定，可以准确地确定其种属和特征，从而有助于制定有效的治疗方案和预防措施。
同时，这也为临床上的诊断和治疗提供了参考依据。