综合训练 抗生素效价的微生物学测定ppt课件
管碟法测定抗生素效价
管碟法测定抗生素效价（四环素类）
一、目的和要求
1、了解管碟法的原理。
2、掌握二剂量法测定抗生素效价单位的技术和计算方法。
二、原理
抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。
当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。
三、实验材料
1、四环素类抗生素的标准品和样品。
2、试验菌：藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）。
3、培养基：250ml三角瓶分装150ml LB琼脂，150ml三角瓶分装50ml
LB琼脂，50ml三角瓶分装20ml藤黄八叠球菌悬液用培养液。
4、灭菌物品：培养皿，牛津杯（内径：6.0±0.1mm，外径：7.8±0.1mm，高度：10.0±0.1mm），滴管，1ml吸管，pH6.0的磷酸缓冲液，弯头镊子，15×150mm试管，瓦盖。
5、其它：分析天平，容量瓶，玻璃板，水平仪，游标卡尺。
四、实验实施
1、配制标准品溶液
2、配制样品溶液
3、制备菌悬液。
4、制备平板：
（1）取6套无菌培养皿，分别加入约20mlLB培养基后，置水平玻璃板上凝固，作为底层。
（2）另取冷却至50℃左右的50ml LB培养基，加入1ml试验菌悬液，迅速摇匀后，用10ml破口吸管取6ml混菌培养基倒在底层平板上，作为菌层，并放置在水平玻璃板上凝固。
5、在培养基平板底部作好相应标记，用弯头镊子在每个培养皿中等距离放入4个牛津杯。
抗生素效价测定实训报告
一、实训目的
1. 掌握抗生素效价测定的原理和方法。
2. 熟悉管碟法测定抗生素生物效价的相关操作步骤。
3. 提高实验操作技能和数据分析能力。
二、实训时间
2023年11月X日
三、实训地点
实验室
四、实训内容
本次实训采用管碟法测定抗生素的生物效价，以青霉素为例进行实验。
五、实验原理
抗生素的效价是指在一定条件下，抗生素对特定微生物的抑制作用。抗生素效价测定通常采用微生物学方法，其中管碟法是目前国际上通用的方法。管碟法的基本原理是：在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管，管内放入标准品和检品的溶液，经过恒温培养后，抗生素在菌层培养基中扩散，形成抑菌圈。抑菌圈的大小与抗生素的浓度呈线性关系，通过比较标准品和检品的抑菌圈大小，可以计算出抗生素的效价。
六、实验步骤
1. 准备工作
- 准备实验所需材料：无菌平板、牛津杯、青霉素标准品、青霉素样品、产黄青霉、琼脂、生理盐水等。
- 将青霉素标准品和样品分别稀释成不同浓度的溶液。
2. 制备琼脂平板
- 将产黄青霉接种于琼脂平板，培养至适宜的生长状态。
3. 放置牛津杯 - 在琼脂平板上均匀放置牛津杯，每个平板放置4个。
4. 加入溶液
- 在牛津杯中分别加入不同浓度的青霉素标准品溶液和样品溶液。
5. 培养
- 将平板放入恒温培养箱中，培养16-18小时。
6. 观察和测量
- 观察抑菌圈的形成情况，测量抑菌圈的直径。
7. 数据处理
- 根据抑菌圈直径，计算青霉素标准品和样品的效价。
七、实验结果与分析
1. 实验结果
- 青霉素标准品在不同浓度下，抑菌圈直径与浓度呈线性关系。
- 青霉素样品在不同浓度下，抑菌圈直径与浓度呈线性关系。
2. 数据分析
- 通过比较青霉素标准品和样品的抑菌圈直径，可以计算出青霉素样品的效价。
八、实验总结
1. 通过本次实训，掌握了抗生素效价测定的原理和方法，熟悉了管碟法测定抗生素生物效价的相关操作步骤。
抗生素效价的测定方法
抗生素效价的测定方法
1. 磁敏感性法：该方法是将细菌和抗生素共同培养在琼脂平板上，然后在琼脂平板的一侧放置磁性探针，通过磁力对菌落的影响，测定抗生素效价。这种方法操作简单，结果可重复性好。
2. 微量滴定法：该方法是将不同浓度的抗生素加入含有微生物的培养基中，控制每次加量相同，直至培养基中出现明显的抑菌圈，然后根据最小抑菌浓度来测定抗生素的效价。这种方法对药物浓度的变化比较敏感，但误差较大。
3. 黏度测定法：该方法是根据细菌代谢后产生的黏性物质的变化，来测定抗生素的效价。该方法操作简单，但对试验条件较为严格。
4. 限制性酶切割法：该方法是将抗生素和细菌混合后，通过限制性酶将其切割成小片段，进而测定抗生素的效价。这种方法需使用限制性酶切割试剂和设备，相对较为复杂。
5. 形态学观察法：该方法是观察抗生素对细菌的形态和结构的影响，来判断抗生素的效价。这种方法适用于细菌的菌落比较大的情况，但操作比较繁琐。
6. 代谢产物测定法：该方法是根据细菌代谢产物的变化，来测定抗生素的效价。这种方法操作比较简单，但对试验条件较为严格。
7. 荧光标记法：该方法是将抗生素用荧光标记，然后与细菌共同培养，通过荧光强度的变化，来测定抗生素的效价。这种方法对试验条件要求比较高，但结果可靠性较高。
8. 酶联免疫吸附测定法：该方法是将抗生素用于特定的抗体结合，然后通过检测抗体与细菌结合的情况，来测定抗生素的效价。这种方法的优点是灵敏度高，同时避免了细菌对抗生素的耐药性。
9. 质谱法：该方法是使用质谱仪分析样品中的分子质量的变化，来测定抗生素的效价。这种方法可分析多种抗生素，但设备价格昂贵。
10. 核磁共振法：该方法是使用核磁共振仪测定样品中的氢、碳、氮等原子的共振频率和空间结构，来测定抗生素的效价。这种方法对试验条件的要求非常高，且设备也价格昂贵。
综合实验2：土霉素的发酵
1 综合实验2：土霉素摇瓶发酵实验
一、实验目的
1、 熟悉放线菌的微生物学特性及培养方法
2、 了解和掌握种子制备和摇瓶发酵技术和方法
3、 了解抗生素发酵的一般规律和代谢调控理论
4、 熟悉和掌握常用的比色分析方法的操作技术
二、实验原理
土霉素是四环类抗生素，其在结构上含有四并苯的基本母核，随环上取代基的不同或位置的不同而构成不同种类的四环素类抗生素。其结构和命名如图。
R1 R2 R3 R4 R5
土霉素 H OH CH3 OH H
四环素 H OH CH3 H H
金霉素 Cl OH CH3 H H
去甲基金霉素 Cl OH H H H
多西环素 H H CH3 OH H
米诺环素 N(CH3)2 H H H H
美他环素 H =CH2 OH CH2(NH)CH(COOH)(CH2)4NH2
土霉素具有广谱抗菌性，能抑制多种细菌、较大的病毒及一部分原虫。土霉素能抑制细菌的生长，在浓度高的时候也具有杀菌的作用。它的作用机制是干扰蛋白质的合成。由于它的毒副作用小，所以其在医疗上用途广泛，主要是应用于呼吸道和肠道感染。
土霉素是由龟裂链丝菌产生的，属于放线菌中的链霉菌属，它们具有发育良好的菌丝体，菌丝体分支，无隔膜，直径约0.4～1.0米，长短不一，多核。菌丝体有营养菌丝、气生菌丝 R3 N
H H
O H
O H O O H O R2
O H
N HR5
O C H 3
C H 3 R4 R1 2 和孢子丝之分，孢子丝再形成分生孢子。而龟裂链丝菌的菌落灰白色，后期生褶皱，成龟裂状。菌丝成树枝分支，白色，孢子灰白色，柱形。
龟裂链丝菌的菌落形态 显微镜观察的菌丝特征
土霉素是典型的次级代谢产物，其发酵的特点之一就是分批过程分为菌体的生长期、产物期和菌体期三个阶段。龟裂链丝菌的生长和土霉素的生物合成受到许多发酵条件的影响：温度、发酵pH值、溶氧、接种量、泡沫等。同时还受到一些代谢调控机制的控制：磷酸盐的调节作用、ATP的调节和产生菌生长速率的调节等。
抗生素效价
用管碟法（2.2）法，测定链霉素活菌剂的效价，估计效价为1 000 000 u/g，供试品最终浓度为1.4u/ml及0.7u/ml。
链霉素的效价测定
抗生素微生物检定法
本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效性）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验。
除另有规定外，本法的可信限率不 得大于5%。
第一法 管碟法
本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
菌悬液的制备
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）悬液
取枯草芽孢杆菌［CMCC（B） 63501］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85％以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)悬液
取短小芽孢杆菌［CMCC(B)63202］的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液
取金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］的营养琼脂斜面培养物,接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液
微生物表格
菌属 菌种
（型） 排列方式 革兰染色 特殊结构 培养特性生化反应 抗原构造 致病物质 所致疾病 微生物学检查法 防治原则 其它 阳性 阴性 鞭毛 菌毛 荚膜 芽孢
葡萄球菌属
（32种，
16种在人体，最常见的化脓
性球菌） 金黄色葡萄球菌 葡萄串状 V
1 需氧或兼性厌氧
2 条件适宜，脂溶
性色素
3 分解甘露醇（非致病菌无，用于鉴定）
4 在无芽胞的细菌中金葡菌抵抗力最强 1多糖抗原
2 蛋白质抗原
3 细胞壁中重要成分抗原：
SPA
（葡萄球菌A蛋白，
可用于协同凝集试验检测抗原） ］肠毒素
2凝固酶（鉴定指标）
3葡萄球菌溶血素
4杀白细胞素
5表皮剥脱毒素
6毒性休克综合征毒素1 1化脓性感染
2毒素性疾病：
食物中毒烫伤样皮肤综合征
（SSSS）
毒性休克综合征
（TSS） 1标本
2直接涂片镜检
3分离培养与鉴定（血琼脂平板）
4凝固酶试验、甘露醇试验
5药敏试验
6食物中毒的检测 1个人卫生
2 皮肤创伤的及
时处理
3 医务人员手部充分消毒
4脓肿引流
5选用敏感药物 免疫性：
成人对金葡菌感染有强抵抗力
早期化脓性病灶局限化1特异免疫性不强，
可再感染表葡菌与腐葡菌：
白色，无血浆凝固酶，无A蛋白，不分解甘露醇，致病性弱，表葡菌可有溶血素。
链球菌属直径1um A群链球菌 链状 V
类菌毛结构 透明质酸
1 营养要求较高血液或组织液、生长因
子
2 菌落细小S型
3R溶血环
4液体培养成絮状
沉淀 1核蛋白抗原
（P抗原，无特异性）
2多糖抗原
（C抗原，分群的依据）
3蛋白质抗原
（表面抗原，有
M、T、R和S
四种抗原，与致病性有关的是M抗原） 1：细胞壁成分：脂磷壁酸
LTA
M蛋白
2致热外毒素（红疹毒素）
3溶血素
4侵袭性酶：
透明质酸酶链激酶（SK）链道酶（SD） 1化脓性感染
2毒素性疾病：猩红热链球菌毒性休克综合征
3超敏反应疾病：风湿热急性肾小球肾炎 1标本
抗生素微生物效价测定法中一剂量法及二剂量法计算公式的推导_百.
所 得 计 算 公 式 。一 二 , 音 。 』 一 , 。 斜率 一 , 抑 菌圈 直 径 之 差 、 一
斜率 一 吕 抑菌圈 直径 之差 。 ‘ “ , 百 示叶 ・ ,。 。 不 亩 翁 , 一 , 行渝 一 留 斜率
抑 菌 圈 直 径 平 方 之差 , 兀 公式 , 主 要 是 斜 率部 分 不 同 , , 斜率 , 恰 是斜 测 定
法 中 一 剂量 法 和 二 剂 量 法 的 计 算 公 式 率 的 倒数 体 现 于座 标 图 上 由 于
将 抗 生 素 轴 上 所 得 的 标 准 曲 线与 习 轴 上 所得 的 曲线 , , 并 与 以 往 的 一
些 推导 相 比 较 绍 了斜 率 导 最小 二 平方 法 。 , 加 以讨 论 , 介 浓 度的对数置
于 , 的计 算公 式 及 其 简 化公 式 的 推 惯 上 使抗 生 素 浓 度 置 于 用直 线 方 程
十 其 斜 率必 然 不 同 前 者 的 值 将 是 后 者 的 倒数 。 本 文 承 卫 生 部 药品 生
物 制 品所 郑 昌 亮 同 志 审 阅 特 此 , 来 推 导 所 得 的一 , 感谢 。 剂 量 法计 算 公
式 与 上 海 药 检 所 用 回 归 直 线方 程 一 。 。 推导 所得 完全 相 同 但推 张绪敏
参 考 资 料 抗 菌 素 微生 物 效 价 测 定 法 , , 导 过 程 明显 简化 二 剂 量 法 的 推
导方 式 与 以 往 用 氏 扩 散 动 力 学方 程 来 推 导 的相 同 由于 二 , 人 民 卫生 剂
量 法 可 以 消 去 斜 率 与截 距 的 影 响 得 的计 算 公 式 与 以 往 的 完 全 相 同 。 ,
因而所 按 本文 的 推导 方 式 推导 过 程 , 可 将 一 剂 量 法和 二 剂 量 法 的 推导 ,
统 一 于 同 一 直 线方 程 下 来 进 行 。 简 化 了整 个 抗 菌 素 效 价 的 生 物 检定
药品生物测定技术课程标准
《药品生物测定技术》课程标准
课程名称及代码：药品生物检定技术
课程性质：专业选修课
课程类别：B类
学 分：4.5
计划学时：72
适用专业：应用化工技术（药品检测方向）
1. 前言
1.1课程定位
《药品生物测定技术》是应用化工技术专业（药品质量检测方向）重要的专业必修课程之一。本课程是教学内容是在《中国药典》及《中国药品检验标准操作规范》的基础上将药品生物检定中将的理论知识与实践技能系统的传授给学生，其目的是使学生掌握药品生物检测的基本理论和基本技能，同时培养学生科学思维、独立思考、分析问题和解决问题的能力；培养学生相互沟通和团结协作的能力，为培养高素质高技能型人才奠定良好的基础。
1.2设计思路
本课程是一门实践性较强的学科，在课程教学上不但要重视学生对理论知识的掌握，更重要的是强调课程的实践性，提高学生的动手操作能力。贯彻以实践技能培训为主导、理论知识够用的原则，培养学生的实际操作能力以及综合分析实际问题的能力。
本课程建议课时为72学时。
2 课程目标
2.1总体目标
通过对《药品生物测定技术》的学习，掌握药品生物测定的基本理论和实践方法。
2.2具体目标
2.2.1知识目标
2.2.1.1掌握无菌检查、药品的微生物检查、控制菌检查的原理和方法；
2.2.1.2掌握抗生素效价的微生物测定的原理和方法；
2.2.1.3掌握药品生物测定技术的基本操作要点和操作技能。
2.2.2能力目标
2.2.2.1通过课堂学习，感受药品生物检测技术在应用化工技术专业（药品检测方向）中的重要性。激发学习兴趣，调动学习的积极性。
2.2.2.2具备药品生物检测的能力
2.2.2.3参与课堂讨论，培养学生信息收集整理、知识综合运用和交流表达能力。
2.2.3素质目标
2.2.3.1具有药学岗位应有的个人职业道德素养和团队合作精神，明确开展药学服务工作的责任要求，熟悉药学人员与服务对象之间和药学人员之间的道德准则；
抗生素微生物检定法测定土霉素片含量的不确定度评定
抗生素微生物检定法测定土霉素片含量的不确定度评定
李俨;孙立丽;王婉婷
【摘 要】目的 分析抗生素微生物检定法测定土霉素片含量的系统误差.方法 采用容量分析法操作.结果 土霉素片的含量为(101.6±3.4)%.结论 该方法条理清晰、简便、准确,可有效评价土霉素含量测定所带来的不确定度,并能较好地分析其中每一个检验步骤带来的误差,以便综合性考虑该药品的质量.%Objective To analyze
the systematic errors in the determination of Terramycin Tablets by
microbiological assay of antibiotics. Methods The volumetric analysis was
adopted. Results The content of Terramycin Tablets was (101. 6 ± 3. 4)%.
Conclusion The method is clear,simple and accurate,it can effectively
evaluate the uncertainty caused by the content determination of
terramycin,and can well analyze the errors caused by each inspection step
in the determination of terramycin content,so as to comprehensively
consider the quality of the drug.
【期刊名称】《中国药业》
【年(卷),期】2017(026)016
【总页数】3页(P26-28)
【关键词】抗生素微生物检定法;土霉素;含量测定;不确定度
【作 者】李俨;孙立丽;王婉婷
林可霉素的发酵及生物效价测定
微生物发酵即是指利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程,微生物发酵生产水平主要取决于菌种本身的遗传特性和培养条件
林可霉素（Lincomycin）是一类具有重要临床意义的高效抗生素，是美国普强公司的Manson等人于1962年首先从美国内布拉斯加州林肯市附近土壤中分离得到的一种由林可链霉菌所产生的抗生素，主要对革兰氏阳性菌有效，特别是对金黄色葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌等有良好抑菌作用，对革兰氏阴性菌亦有一定的抑制作用。
林可霉素的作用机制是通过与核糖体50S亚基23S rRNA的中心环相结合而抑制蛋白质生物合成过程中的转移定位，因此通过影响蛋白质的合成抑制细菌生长。
抗生素抗菌物质的含量称效价。抗生素效价测定有化学法或生物法。生物法就是将抗生素溶液，在含有敏感试验菌的琼脂培养基上进行扩散渗透，经过一定时间后，抗生素扩散到适当的范围，产生透明的抑菌圈。
抑菌圈的直径与抗生素总量、抗生素的扩散系数、扩散时间、培养基的厚度和最低抑菌浓度等因素有关。抗生素总量的对数和抑菌圈直径的平方呈直线关系。因此，抗生素效价可以由抑菌圈的大小来衡量.
将已知效价的林可霉素标准液先制成标准曲线，比较已知效价标准液与未知效价的被检品溶液的抑菌圈的大小，算出样品中林可霉素的效价。
菌种：林可链霉菌（林可霉素产生菌）
藤黄八叠球菌（林可霉素指示菌）
培养基：种子培养基TSBY（30ml）、发酵培养基YMG （30ml）、指示菌培养皿YMG
器皿：三角瓶 、容量瓶、恒温摇床、离心机、恒温培养箱、灭菌锅等
主要试剂：5 mol/L NaOH等
1. 发酵前工作：
培养基、试剂的配制；包培养皿、枪头等。灭菌工作。
2. 发酵培养
(1) 将菌种接至固体培养基，30℃培养7天放冰箱0℃-8℃保存备用
(2) 从固体培养基上挖1cm×1cm正方块，接入装有已灭菌发酵培养的摇瓶内，放入摇床（30℃，220r/min）摇瓶2天观察菌丝形态，测菌丝浓度和培养液pH