第十二章抗生素测定ppt课件
抗生素检验讲义1
前 言
自1929年英国细菌学家弗来明（Fleming）发现第一个抗生素—青霉素以来，已有半个多世纪，抗生素种类越来越多，它们在治疗感染性疾病，保障健康方面作出了令人瞩目的贡献。
在当今世界医学临床上，抗生素类药物已是一类不可缺少的重要化学药物，在很多国家的医药工业中的产值居于首位。抗生素在农、牧业上也已被广泛应用，随着抗生素应用范围的扩大，对抗生素药品分析的任务更加繁重，现代化学分析技术的发展，特别是各种仪器分析、自动分析技术的日新月异，有可能对各种抗生素进行有效的快速测定，但传统的生物检测法以及经典的化学定性、定量方法，还是目前各国药典中采用最多、最主要的检测方法，针对抗生素药品的性质和生产方法等特点，各国对抗生素药物都有专门的管理条例和检验规程。为保证抗生素药品的安全有效性，对抗生素药品的检验及质量控制显得尤为重要。
本讲义主要介绍生物检定法（包括生物统计学知识），内容较单一，可作为抗生素检验技术的参考资料。由于时间仓促，水平有限，讲义内容中难免有错误及不妥之处，请提出批评指正。
编 者
1
生物检定法
在60年代前人们认为抗生素是微生物代谢过程中产生的一种化学物质，具有抑制或杀死另一些微生物的能力，人们把这种能力称为“杀菌作用”，因此，曾把这类物质译成“抗菌素”。
随着抗生素研究工作的发展，抗生素涉及的面扩大到抗肿瘤 、抗病毒、抗原虫和抑制某些酶的活力等方面。还逐渐发现有些抗生素有镇咳、降低血胆固醇、消炎等生理活性。某些动植物、低等植物（藻类和地衣等）虽然也产生某些抗菌物质，但就目前来说，微生物是产生抗生素的主要来源。所以，现在通常把经化学改造的天然来源抗生素或微生物代谢的其它产物，以低微浓度能抑制或影响它种生物机能的化学物质统称为抗生素。
抗生素类药物在我国医药行业及兽药行业的治疗及预防中已被广泛使用。这一类药物的生产不同于一般药品，其整个工艺过程包括生物合成、化学提炼及制剂加工、分装等几个主要部分，生产过程长，技术比较复杂，最终产品中也会含有一定量的杂质。因此，产品除了抗菌作用外还有其它生理活性作用，这些生理作用有的是抗生素本身引起的，有的是杂质引起。
第十二章药物疗法与过敏试验法4
教 案
姓名_王玉珍__ 2010~2011学年 第1学期 时间_ 节次_
课程名称 基础护理学 授课专业及层次 09高职护理3班
授课内容 第十二章药物疗法与过敏试验4 学时数 4（理论2+实践2）
教学目的 掌握青霉素过敏试验及过敏反应的处理；破伤风抗毒素脱敏注射法。
熟悉链霉素、破伤风抗毒素、普鲁卡因、细胞色素C、头孢菌素类药物过敏试验法机过敏反应的处理
重 点 青霉素过敏试验及过敏反应的处理、各种皮试液的配制
难 点 各种皮试液的配制
自学内容 无
使用教具 板书
相关学科知识 药理学
教 学 法 多媒体、讲授
讲授内容纲要、要求及时间分配
复习检查上次课的内容
第五节 药物过敏试验及过敏反应的处理
一、青霉素过敏试验及过敏反应的处理
（一）青霉素过敏反应的原因
（二）青霉素过敏试验法（示教法、讲解）
（三）青霉素过敏反应的临床表现
1、过敏性休克
（1）呼吸道阻塞症状：由于喉头水肿、支气管痉挛，肺水肿所引起胸闷、气急、发绀 、口吐白沫伴濒死感。
（2）循环衰竭症状: 由于周围血管扩张导致有效循环血量不足而引起面色苍白、冷汗、紫绀、脉细弱、血压下降、烦躁不安等。
（3）中枢神经系统症状：由于脑组织缺氧可引起头晕眼花、面部及四肢麻木、意识丧失、抽搐、大小便失禁等 。
（4）皮肤过敏症状：瘙痒、荨麻疹等。
5分钟
5分钟
20分钟
10分钟
讲授内容纲要、要求及时间分配（附页）
2、血清病样反应
多于用药后7～12天发生，临床反应与血清病相似，有发热，荨麻疹，关节肿痛，淋巴结肿大，腹痛，皮肤发痒等。
3、各器官或组织的过敏反应
（四）青霉素过敏性休克的处理
１.立即停药，患者平卧、报告医生，就地抢救。
２.首选盐酸肾上腺素注射，病儿剂量酌减：立即皮下注射0.1％肾上腺素0.5～1ml，症状如不缓解，可每隔半小时皮下或静脉注射该药0.5ml，直至脱离危险期。
第十二章 抗菌药
第十二章 抗菌药
本章只讨论磺胺类药物及抗菌增效剂；喹诺酮类抗菌药；抗结核药物。
一、磺胺类药物及抗菌增效剂
磺胺类药物为对氨基苯磺酰胺的衍生物，具有以下基本结构：
磺胺类药物在20世纪30年代发展很快，临床上应用的药物曾有20余种，40年代以后由于青霉素等抗生素的出现，磺胺类药物在化学治疗药物中的地位下降，但是磺胺类药物有抗菌谱广、疗效确切、可以口服，吸收较迅速等特点。与抗菌增效剂甲氧苄啶(Trimethoprim)合用可使抗菌作用增强。仍为比较常用的抗菌药。磺胺类药物作用机制的阐明，确立了抗代谢学说，为发展新药开辟了一条新途径。目前临床上使用较多的药物有磺胺嘧啶(Sulfadiazine)和磺胺甲噁唑（Sulfamethoxazole）。
（一）磺胺类药物作用机制
磺胺类药物作用机制有多种学说其中众所公认的Wood-Fields学说认为磺胺类药物能与细菌生长所必需的对氨基苯甲酸（PABA）产生竞争性拮抗，干扰了细菌的酶系统对PABA利用，PABA是叶酸的组成部分，叶酸为微生物生长中必要物质，也是构成体内叶酸辅酶的基本原料。PABA在二氢蝶酸合成酶的催化下，与二氢蝶啶焦磷酸酯及谷氨酸或二氢蝶啶焦磷酸酯与对氨基苯甲酰谷氨酸合成二氢叶酸。再在二氢叶酸还原酶的作用下还原成四氢叶酸，为细菌合成核酸提供叶酸辅酶。
由于磺胺类药物分子大小及电荷分布和PABA及为相似，使得在二氢叶酸的生物合成中，可以取代PABA位置，磺胺类药物抑制二氢蝶酸合成酶，阻断了二氢叶酸的生物合成。二氢叶酸经二氢叶酸还原酶作用还原为四氢叶酸，后者进一步合成辅酶F。辅酶F为DNA合成中所必需的嘌呤、嘧啶碱基的合成提供一个碳单位。人体作为微生物的宿主，可以从食物中摄取四氢叶酸，因此，磺胺类药物不影响正常叶酸代谢，而微生物靠自身合成四氢叶酸，一旦叶酸代谢受阻，生命不能继续，因此微生物对磺胺类药物敏感。
抗生素效价测定
项目２青霉素效价测定
一、知识连接
(一)抗生素效价表示方法
效价就是评价抗生素效能得标准,也就是衡量抗生素活性成分含量得尺度。效价一般指得就是生物活性得大小或者高低,生物活性得大小与高低就是与效价成正比得。实际应用中,合理使用抗生素得剂量十分重要。抗生素应用时剂量小,因此除重量外,常用特定得效价单位(unit)表示,效价单位也称抗菌活性单位。
最初,由于抗生素无法制得纯品,用其生物活性得大小来表示其剂量、
一个青霉素得效价单位(Ｕ):能在5０mL肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株得发育得最小青霉素剂量。
一个链霉素效价单位(U):能在1mＬ肉汤培养基中完全抑制大肠杆菌(ATCC9６3７)发育得最小剂量。
重量单位(μg):以抗生素得有效成分(生理活性成分)得重量作为抗生素得基准单位(大多数使用)。
(二)抗生素效价测定
抗生素微生物检定法可分为稀释法、比浊法与琼脂扩散法(管碟法与打孔法)。各国药典通常采用后两种方法测定抗生素得效价。
管碟法就是利用抗生素在琼脂培养基得扩散渗透作用,在含有高度敏感性试验菌得琼脂平板上放置小钢管(内径6、0±0。l mm,外径8、0±０。l mm,高1０±０.lmm),管内放入标准品与检品得溶液,经16～1８小时恒温培养,当抗生素在菌层培养基中扩散时,会形成抗生素浓度由高到低得自然梯度,即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此,当抗生素浓度达到或高于MIC(最低抑制浓度)时,试验菌就被抑制而不能繁殖,从而呈现透明得无菌生长得区域,常呈圆形,称为抑菌圈。抑菌圈得大小代表药剂抗菌力得高低。在一定得药剂浓度范围内,药剂得浓度越高则抑菌圈得直径越大。目前最常用得就是游标卡尺与直尺直接测量抑菌圈直径、根据扩散定律得推导,抗生素总量得对数值与抑菌圈直径得平方成线性关系,即通过检测抗生素对微生物得抑制作用,比较标准品与供试品产生抑菌圈得大小,计算出供试品得效价。
抗生素效价检测
抗生素效价检测
抗生素效价测定
⒈准备工作
①干热灭菌（150-160℃干热灭菌2小时）：带盖培养皿，陶瓦盖（定期清洗灭菌），钢管，刻度吸管（25ml，10ml，1ml各一根）
②湿热灭菌（121℃蒸汽灭菌30分钟）：水，缓冲液，培养基（根据要求设置灭菌温度和时间）
③试验用菌悬液活化
④效价操作间紫外灯消毒30分钟后开通风，室温控制在20-25℃
⑤实验前检查酒精灯，打火机，酒精棉球，洗耳球，温度计，移液枪，枪头等
⒉对照溶液和样品溶液的制备
①一步用灭菌水稀释至1000μ/ml（即称样量=稀释浓度×1000/标识效价），黏菌素稀释至10000μ/ml（即称样量=稀释浓度×10000/标识效价），称样量必须大于等于理论值，根据实际称样量补水
②二步以后用灭菌缓冲液稀释，根据兽药典稀释到要求的浓度范围
⒊双碟的制备（一批需6个以上）
①底层：用25ml刻度管吸取20ml培养基注入双碟内，静置待其凝固
②菌层：待培养基温度降至实验菌适应范围（一般细菌48-50℃，芽孢可至60℃），加入适量菌悬液摇匀，用10ml刻度管吸取带菌培养基5ml，使均匀分布在底层培养基上（一边放带菌培养基一边在平面上摇晃培养皿）
③放置钢管，做好标记，静置
④滴加对照溶液和样品溶液，移液枪调至245μL，注意枪头不能挂壁
⑤滴加完毕后盖上陶瓦盖，移入培养箱，于35-37℃培养至所需时间
⒋抑菌圈的测量与计算
测量抑菌圈直径，根据公式P=log-1[(T2+T1-S2-S1)/ (T2+S2-T1-S1)×0.301]×100％计算
抗生素
“抗生素效价”是衡量抗菌效能的标准，效价高低是衡量抗生素质量的相对标准。效价以“单位” （每ml或每mg样品中所含某种抗生素的有效成分的多少）表示。
我们把某种抗生素所能抑制或杀灭病原体的范围称之为该种抗生素的抗菌谱。
1.5.1 根据微生物来源分类：一、放线菌产生的抗生素二、 真菌产生的抗生素三、 细菌产生的抗生素四、 动植物产生的抗生素
1.5.2 根据抗生素的作用分类：一、抗革兰氏阳性菌抗生素二、抗革兰氏阴性菌抗生素
三、 广谱抗生素四、抗真菌类抗生素五、抗结核分枝杆菌类抗生素六、抗肿瘤抗生素
七、抗原虫类抗生素八、抗病毒和噬菌体类抗生素九、免疫抑制剂 十、酶抑制剂
1.5.3 根据抗生素的作用机制分类：一、抑制细胞壁合成的抗生素二、影响细胞膜功能的抗生素三、抑制核酸合成的抗生素四、抑制蛋白质合成的抗生素五、抑制生物能作用的抗生素
1.5.4 根据生物合成途径分类：一、氨基酸、肽类衍生物二、糖类衍生物三、以乙酸，丙酸为单位的衍生物
1.5.5 根据化学结构分类：一、β－内酰氨类二、氨基糖苷类三、大环内酯类四、四环类
五、多肽类六、多烯类七、苯烃基胺类八、蒽环类九、环桥类十、其它类
（4）药代动力学良好，给药（注射、口服等）后，很快吸收，并迅速分布至被感染的器官或组织；在人体内发挥其抗生效能并不立即遭体内破坏；
3.1 抗生素的生产方法
发酵法、化学合成法、半合成法。
3.1.1生物合成法（即微生物发酵法）发酵法生产抗生素时，首先利用特定的微生物，也就是抗生素的产生菌，在一定的条件下（培养基、温度、PH、通气、搅拌等）使之生长繁殖，在代谢过程中产生抗生素。然后利用抗生素的特定理化性质，用适当的化学手段将抗生素从发酵液中提取出来，井如以精制，最后获得抗生素成品。
其特点是成本较低，周期长、波动性较大等。
3.1.2 化学合成法（即全化学合成法）只当某些抗生素的化学结构已经明确且结构较简单时，就可采用全化学的方法进行合成，制取抗生素。
抗生素生物效价测定
真验一 抗死素死物效价测定之阳早格格创做
【真验手段】
1. 掌握抗死素死物效价测定的本理战要领；
2. 掌握管碟法测定抗死素死物效价相闭的支配要领.
【真验本理】
抗死素的效价常采与微死物教要领测定，它是利用抗死素对于特定的微死物具备抗菌活性的本理去测定抗死素效价的要领，如管碟法.管碟法是暂时抗死素效价测定的国际通用要领，尔国药典也采与此法.管碟法是根据抗死素正在琼脂仄板培植基中的扩集渗透效率，比较尺度品战检品二者对于考查菌的抑菌圈大小去测定供试品的效价.管碟法的基根源基本理是正在含有下度敏感性考查菌的琼脂仄板上搁置小钢管（内径，中径，下），管内搁人尺度品战检品的溶液，经16~18小时恒温培植，当抗死素正在菌层培植基中扩集时，会产死抗死素浓度由下到矮的自然梯度，即扩集核心浓度下而边沿浓度矮.果此，当抗死素浓度达到大概下于MIC（最矮压制浓度）时，考查菌便被压制而不克不迭繁殖，进而浮现透明的无菌死少的天区，常呈圆形，称为抑菌圈.根据扩集定律的推导，抗死素总量的对于数值与抑菌圈曲径的仄圆成线性闭系，比较抗死素尺度品与检品的抑菌圈大小，可预计出抗死素的效价. 时常使用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法.后二法已经加进药典.二剂量法系将抗死素尺度品战供试品各稀释成一定浓度比率（2:1大概4:1）的二种溶液，正在共一仄板上比较其抗药活性，再根据抗死素浓度对于数战抑菌圈曲径成曲线闭系的本理去预计供试品效价.与含菌层的单层仄板培植基，每个仄板表面搁置4个小钢管，管内分别搁进供试品下、矮剂量战尺度品下、矮剂量溶液.先丈量出四面的抑菌圈曲径，按下列公式预计出检品的效价.
（1）供出W战V：W=（SH+UH）-（SL+UL） (式
2.10-1)
V=（UH+UL）-（SH+SL）
(式2)
式中：UH：供试品下剂量之抑菌圈曲径；
UL：供试品矮剂量之抑菌圈曲径；
SH：尺度品下剂量之抑菌圈曲径；
实验11-抗生素的抑菌试验
实验十一 抗生素的抑菌试验
一 目的要求
1、掌握纸片法测定抗生素抗菌作用的基本方法
2、了解抗生素的抗菌谱
二 实验原理
抗生素是某些植物与微生物生长到对数期前后所产生的次生代谢产物，其在低浓度下可其它微生物生长具抑制作用或杀死作用的物质。抗生素对敏感微生物的作用机理分为抑制细胞壁的形成、破坏细胞膜的功能、干扰蛋白质合成及阻碍核酸的合成。
由于不同微生物对不同抗生素的敏感性不一样，抗生素的作用对象就有一定的范围，这种作用范围成为抗生素的抗菌谱，作用对象广的抗生素称为广谱抗生素，作用对象少的抗生素称为窄谱抗生素。而且当某种抗生素长时间用于敏感微生物生长后，即使同一种菌的不同菌株对不同药物的敏感性也常发生改变，甚至出现耐药菌株，亦即产生抗性菌株，则抗生素将失去对抗性菌株生长的抵制，只以采用新的抗生素才可能控制抗性菌株的生长与繁殖，因而不断开发新的抗生素是保健人类身体健康的重要工作。新抗生素产生菌的分离筛选应通过拮抗菌发酵，然后以发酵产物进行抗菌活性实验，根据实验结果而获得产新抗生素的菌株。微生物代谢产物的抗菌活性常以管碟法与纸法进行检测，根据透明抑菌圈的有无与大小作为依据。
三 实验器材
1、菌种 枯草杆菌、大肠杆菌。
2、培养基 MH（Mueller-Hintion）琼脂。
3、试剂 青霉素、链霉素。
四 方法步骤
1、无菌滤纸片 以孔径6mm打孔器将滤纸打为圆形纸片，放入培养皿内，121℃蒸汽湿热灭菌，100℃烘干2h。
2、抗生素溶液制备 将取适量青霉素、链霉素，以无菌水溶解。
3、指示菌悬浮液的制备 枯草杆菌、大肠杆菌斜面菌种分别以无菌水洗下菌苔细胞，到入无菌三角瓶内，制备适宜浓度的细胞悬浮液。
4、混菌平板制备 取批示菌细胞悬浮液1mL加入无菌培养皿内，再加入温度为43~45℃的PDA培养基或牛肉膏蛋白胨琼脂培养基20mL，立即振荡使细胞与培养基混合均匀，静置冷凝。
抗生素最低抑菌浓度（MIC）和半数抑菌浓度（MIC）测定方法
抗生素最低抑菌浓度（MIC）和半数抑菌浓度（MIC）测定方法
抗生素最低抑菌浓度（MIC）和半数抑菌浓度（MIC）测定方法常量肉汤稀释法
1.1抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如
1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相关机构。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如：
需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为
182.6 mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6mg×750μg/ml）
/1280μg/ml=
107.0ml，然后将
182.6 mg抗生素粉剂溶解于
107.0ml稀释剂中。制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。
1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
1.3.培养基NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH
7.2~
7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。 1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至
0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成
抗生素效价测定 2
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1 / 6 项目2青霉素效价测定
一、知识连接
（一）抗生素效价表示方法
效价是评价抗生素效能的标准，也是衡量抗生素活性成分含量的尺度。效价一般指的是生物活性的大小或者高低，生物活性的大小和高低是和效价成正比的。实际应用中，合理使用抗生素的剂量十分重要。抗生素应用时剂量小，因此除重量外，常用特定的效价单位（unit）表示，效价单位也称抗菌活性单位。
最初，由于抗生素无法制得纯品，用其生物活性的大小来表示其剂量。
一个青霉素的效价单位（U）：能在50mL肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株的发育的最小青霉素剂量。
一个链霉素效价单位（U）：能在1mL肉汤培养基中完全抑制大肠杆菌（ATCC9637）发育的最小剂量。
重量单位（μg）：以抗生素的有效成分（生理活性成分）的重量作为抗生素的基准单位（大多数使用）。
（二）抗生素效价测定
抗生素微生物检定法可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。
管碟法是利用抗生素在琼脂培养基的扩散渗透作用，在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0.lmm），管内放入标准品和检品的溶液，经16～18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。抑菌圈的大小代表药剂抗菌力的高低。在一定的药剂浓度范围内，药剂的浓度越高则抑菌圈的直径越大。目前最常用的是游标卡尺和直尺直接测量抑菌圈直径。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，即通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。