高羊茅再生体系及其遗传转化研究进展
高羊茅再生体系及其遗传转化研究进展摘要高羊茅在我国有着广泛的种植面积，是多年生冷季型牧草和草坪草。
介绍了高羊茅的再生体系，从它的转化方法、转化目标、影响因素、生物安全问题等方面综述了高羊茅的外源基因转化研究进展。
关键词高羊茅；再生体系；遗传转化；影响因素；展望中图分类号s688.4 文献标识码a 文章编号1007-5739(2009)01-0042-03高羊茅又名苇状羊茅，属于禾本科羊茅属，原产于欧洲西部，我国在20世纪70年代引进，现已是世界温带地区建立人工草地和补播天然草场的重要草种[1]。
高羊茅是多年生疏丛型禾草，其具有耐旱耐湿耐热、生长迅速、再生性强等特点，随着我国人工草地建植的不断发展，其建植面积正在不断地扩大。
高羊茅在我国具有广泛的气候和土壤环境适宜性，大部分地区均可种植。
它属于多年生冷季常绿型，生长期达8～10个月，可充分利用太阳辐射，耐瘠薄，在黏至砂质土壤上均表现良好。
但是，高羊茅在抗旱性、耐寒性方面还需要进一步提高。
利用常规育种技术耗时周期长，效率差，存在很多的局限性。
利用基因工程技术即将抗逆功能基因有目的、有针对性地导入特定品种的愈伤组织或原生质体，获得改良的转基因植物[2]，如利用转基因技术培育抗旱节水、耐寒的高羊茅新品种就是目前研究的热点。
建立高效的组织培养体系是植物遗传转化的先决条件，高羊茅组织培养方面的研究开始于20世纪80年代，1979年lowe和conger 从高羊茅成熟种子胚成功地诱导愈伤组织并得到再生植株。
此后，人们通过花粉囊培养、幼穗培养、从悬浮培养细胞获得原生质体的培养和成熟种子诱导愈伤的培养等都获得了再生植株。
1高羊茅再生体系高羊茅等羊茅草种的组织培养开始于20世纪70年代，dale首先从高羊茅的分生组织顶端培育出小植株[3]，其后，随着研究的不断深入，愈伤组织再生系统、悬浮细胞再生系统、原生质体再生系统等各种途径的高羊茅再生体系相继建立。
1.1愈伤组织再生系统对于单子叶植物高羊茅来说，选用愈伤组织再生系统是最为理想的，因为单子叶植物悬浮系的建立和原生质体的再生十分困难，而由器官直接分化再生植株难度更大[4]。
目前通过对高羊茅不同外植体（如成熟种子、成熟胚、幼胚、幼穗、节外植体、叶片基部的切片、分生组织及花梗组织等）的诱导已经获得了愈伤组织并建立了相关的再生体系[5]。
基因型是影响高羊茅愈伤组织诱导与植株再生的一个重要因素。
eizenga等[6]在对高羊茅研究过程中发现不同品种之间愈伤组织诱导率及其再生频率有显著差异，而且产生愈伤组织最多的基因型未必再生植株最多。
bai等[7]对美国多个高羊茅常见品种进行了比较研究，愈伤诱导率变幅在16.7％～58.8％，分化成苗率1％～22％，并且发现愈伤组织诱导率低的品种，愈伤组织再生频率不一定低。
王维飞在研究高羊茅愈伤组织及植株再生过程中认为不同基因型因其内源激素是不同的，故基因型对愈伤组织诱导存在影响。
在常用的植物组织培养基本培养基类型中，高羊茅组织培养采用最多的基本培养基是ms。
将不同的植物激素、有机物或其他物质添加到培养基中可以改变愈伤组织的诱导率。
与其他禾本科草不同，高羊茅成熟种子诱导愈伤组织需要较高浓度的植物生长物质2，4-d[8]。
2，4-d是诱导高羊茅外植体形成愈伤组织的关键因素[4]，最佳2，4-d浓度是5～9mg／l[7，9]，高于12mg／l或低于2mg／l则对愈伤组织的诱导有强烈抑制作用[10]。
1.2胚性悬浮细胞再生系统禾本科植物悬浮细胞的植株再生比较困难，高羊茅也不例外[11]。
胚性悬浮细胞系作为分离原生质体的来源，已经广泛用于体细胞杂交和遗传转化[12]，高羊茅胚性悬浮细胞系的建立，为高羊茅原生质体培养和遗传转化提供了一个极好的体系[13]。
相较于愈伤组织再生系统，由高羊茅胚性悬浮培养细胞再生植株的工作在20世纪80年代后期已取得成功[14]，dalton等[15]采用碳化纤维法转化高羊茅细胞悬浮物，获得了转基因植株。
在已报道的高羊茅悬浮细胞再生分化的研究中，大多存在着绿苗再生频率低、白化苗发生率高的问题，胡张华等[16]在试验过程中认为用经2.5mg/l cuso4·5h2o筛选出的胚性愈伤组织在短期内建立稳定的高质量胚性悬浮细胞系是研究成功的前提；而将悬浮细胞进行高渗处理并结合高浓度琼脂培养是试验成功的关键[16]。
1.3原生质体再生系统自从1960年英国学者cocking用酶法首次从番茄根尖分离出大量有活性的原生质体，并通过培养再生细胞壁以来，人们对植株原生质体的分离和培养进行了广泛地探索[17]。
原生质体可用于直接基因转移和融合，产生转基因植株和体细胞杂种[18]。
据研究报道，从高羊茅细胞悬浮细胞培养系分离的原生质体可以分成4类，即含有大淀粉粒（5～10μm）的具液泡原生质体、含有小淀粉粒（2μm）的具液泡原生质体、只具液泡的原生质体和没有可见液泡的小而细胞质稠密的原生质体[19]。
takamizo[20]等将碘乙酰胺失活的高羊茅原生质体与非形态发生的意大利黑麦草原生质体电融合，并再生获得了若干绿色植株[20]。
2外源基因的遗传转化2.1转化方法迄今为止，利用基因工程技术把外源基因导入植物细胞从而实现基因转化方法的技术主要包括peg法、电激法、硅碳纤维法、基因枪法和农杆菌介导法。
wang等[21]1992年用peg法以悬浮细胞系为受体，获得了转hpt和bar基因的转基因高羊茅；ha等[22]1992年以胚性细胞为受体通过电激融合法获得了转hpt和gus基因的转基因高羊茅；dalton等[23]1998年首次采用硅碳纤维转导法转化高羊茅细胞悬浮培养物，获得了转基因植株；spangenberg等[24]1995年通过基因枪法以胚性悬浮系为受体获得了转gus基因的高羊茅[24]；bettany等[25]2003年通过农杆菌介导法以胚性悬浮细胞为受体获得了转hpt和gus基因的2个独立转基因株系的高羊茅[25]。
2.2转化的主要目标早期的高羊茅转基因研究的主要是为了建立遗传转化体系，因此所转的外源基因只局限于选择基因hpt（潮霉素磷酸转移酶基因）和bar（膦丝菌素乙酰转移酶基因）以及报告基因gus（葡糖苷酸酶基因）[26]。
目前的转化目标主要包括以下几个方面。
2.2.1改良高羊茅的品质。
作为牧草型用的高羊茅，提高它的干物质消化率以利于动物吸收，从而改善动物的适口性和其品质与营养价值，采用基因工程育种技术能比传统的育种技术更快的达到目的。
wang等[27]在2001年将向日葵清蛋白sfa8与内质网定位信号kdel转入了高羊茅，使转基因植株中sfa8蛋白含量占总溶蛋白的0.2%，比未转基因植株的0.01%提高了许多。
sfa8含有23%的甲硫氨酸和半胱氨酸，这2种含硫氨酸都属于反刍动物营养中最为限制性的必需氨基酸，将此基因导入牧草型高羊茅，表达产生含硫氨基酸丰富的优质蛋白质，对提高动物生产率具有重要意义。
2.2.2获得抗除草剂性能。
随着城市经济的快速发展，草坪草在城市环境美化、绿化扮演着越来越重要的角色，化学除草剂因此得以广泛地应用。
目前使用的化学除草剂大多属于高毒高污染的化学药品，它的大量使用将会严重污染土壤、地下水，挥发到空气中还可污染空气，同时还会破坏生态系统。
生物除草剂由此诞生，抗除草剂基因是其重要组成部分。
抗除草剂基因的表达以其特有的除草剂抗性特征，在植物基因工程技术中得以广泛应用，在很多遗传转化系统中简化了筛选过程。
利用抗除草剂基因作为遗传转化筛选标记基因的研究报告有很多。
kuai等[28]1999年获得具有可育性的转基因高羊茅，对除草剂glufosinate ammonium 有明显的抗性。
在以培育抗除草剂植物为目的的研究中，wang等[29]1992年用抗除草剂基因（bar）转化高羊茅原生质体。
2.2.3提高抗逆性。
植物的抗逆性是十分复杂的性状，包括抗寒性、抗旱性、耐盐性等，是多个基因来参与调控的。
抗逆基因的分离、克隆和转化一直都是国内外科学家研究的热点。
目前已经分离出大量相关的基因，如抗寒有关的mn-sod基因等、抗旱有关的拟南芥cbf基因等、耐盐有关的脯氨酸合成酶基因等。
提高高羊茅的抗旱性，既可以降低它作为草坪草的管理费用，又能使它在干旱地区得以广泛种植。
任伟[30]通过根瘤农杆菌介导drebia基因转化高羊茅获得了抗旱性牧草株系。
梁蕊芳[31]利用基因枪法将nhx1、cbf耐逆相关基因导入高羊茅获得了相关的抗性植株。
2.2.4提高抗病害性。
病虫害普遍存在于高羊茅的生产中，病虫害多、分布广，严重影响生产。
化学药品的过度使用使得各病虫害的耐药性加强，而传统的育种技术周期过长，无法满足目前的生产需求。
目前的抗虫基因主要包括植物外援凝集基因、蛋白酶抑制基因和bt基因。
抗病毒基因的技术路线有：导入病毒外壳蛋白(coat protein，cp)基因；利用病毒的卫星rna(satellite rna，sat- rna)；利用病毒的非结构蛋白基因，特别是复制酶—replicase 基因；利用人工构建的缺损干扰颗粒(defective interfering particle)；利用植物本身编码的抗病毒基因和利用动物中的干扰素(interferon)基因；利用反义rna 技术；利用中和抗体法技术；设计核酶剪切病毒rna 等。
在这些技术路线中，导入cp基因是目前最为成功的一种[32]。
2.3 遗传转化的影响因素2.3.1筛选方法的选用。
目前，在植物遗传转化中常用的选择标记大多用抗生素作为筛选标记基因，主要有以下类型：新霉素磷酸转移酶基因(nptii基因，具有抗卡那霉素或g418 特性)、潮霉素磷酸转移酶基因(hpt基因，具有抗潮霉素特性)、除草剂转移酶基因(bar基因，提供对除草剂basta的抗性)等[33]。
在高羊茅的遗传转化中，研究人员大多采用潮霉素磷酸转移酶基因筛选，简单不连续筛选时，植株再生最多，但导致大量逃逸植株的产生；而采用低浓度潮霉素连续筛选，虽然一些未转化愈伤组织能够存活和生长，但不能再生植株，因而产生的转基因植株数最多且没有逃逸[34]。
2.3.2抗生素的使用。
农杆菌介导转化法在高羊茅的遗传转化中已获得了成功，在筛选转化体的培养基中需要加入抗生素以杀灭农杆菌。
高羊茅的研究中常使用头孢霉素与羧苄青霉。
吴关庭等[35]在研究抗生素对高羊茅胚性愈伤组织生长与分化的影响时发现头孢霉素明显抑制愈伤组织生长，而浓度低于500mg／l的羧苄青霉素能促进愈伤组织生长；2种抗生素对愈伤组织分化均有抑制作用，但羧苄青霉素的抑制作用要比头孢霉素小。
2.3.3培养时间。
采用胚性细胞悬浮物为再生系统时，悬浮物培养时间对高羊茅再生植株影响明显。
多枝赖草_高羊茅的组织培养和愈伤组织诱变
多枝赖草、高羊茅的组织培养和愈伤组织诱变葛荣朝1, 赵宝存1, 秘彩莉1, 郭光艳1, 赵茂林2(1.河北师范大学生命科学学院,河北石家庄 050016;2.北京市农林科学院农业生物技术研究中心,北京 100089)摘要:以多枝赖草、高羊茅的种子为材料,在诱导培养基上进行暗培养,产生愈伤组织.愈伤组织经多次继代培养后仍可保持分化潜力.在分化培养基上进行光照培养后,可以分化出丛生状幼苗,并大量生根,形成再生植株.用EMS 溶液对2种愈伤组织进行诱变处理,结果表明:不同体积分数的EM S 对愈伤组织的致死率不同,随着体积分数的提高,致死率逐步升高.经统计,初步确定EMS 溶液对多枝赖草、高羊茅愈伤组织的半致死体积分数分别为6mL/L 和8mL/L.关键词:多枝赖草;高羊茅;组织培养;愈伤组织;EM S 诱变中图分类号:S 543 文献标识码:A 文章编号:1000 5854(2007)04 0531 04随着世界经济的飞速发展和人们生活水平的日益提高,人类对环境质量越来越重视.草坪具有调温、调湿、降低空气污染、降低城市噪音、防止水土冲刷和泥土上路等功能,在城市环境绿化中起着重要的作用.我国的草坪业起步较晚,草坪草育种相对落后,为了满足城市绿化的需求,我国每年都要进口大量的草籽,且呈逐年上升趋势.因此,培育出一些适宜于本地种植的优良草种及草种组合是当务之急[1,2].多枝赖草具有很好的耐盐碱性,对黄矮病具有突出的抗性;同时还具有耐干旱、耐瘠薄、耐污染、光能利用率高的特性;具有横向生长的地下茎,横向扩展性较好;具有较好的耐践踏、耐刈割特点,可用于各种绿地.所以,多枝赖草具有培育成优良抗逆草坪草种的潜力[3,4].本文中,笔者主要是对多枝赖草、高羊茅进行组织培养,然后对其愈伤组织进行诱变处理,并获得再生植株,以期从再生植株或其后代中筛选出较为优良的草坪草品种.1 材料与方法1.1 实验材料多枝赖草、高羊茅的种子.1.2 实验方法1.2.1 培养基组成基本培养基为MS 培养基,附加30g/L 蔗糖、5g/L 琼脂,用NaOH 调溶液至pH 5.8.诱导培养基为MS+3mg/L 2,4-D+0.5mg/L Kt;继代培养基为MS +1mg/L 2,4-D+0.5mg/L Kt;分化培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg /L IBA.1.2.2 再生体系的建立选取籽粒饱满的草籽反复清洗,室温浸泡24h,然后于超净台上用700mL/L 的乙醇消毒30s,无菌水冲洗3次,再用含2mL/L Tw een20的有效氯为20mL/L 的NaClO 溶液浸泡20min,之后用无菌水冲洗3次.将消毒的种子接种于诱导培养基上,25 暗培养.种子诱导出愈伤组织后,将生长良好的愈伤组织块从种子上剥离,接种到继代培养基上,移至光照培养箱中培养.愈伤组织生长到合适大小时,将生长旺盛的愈伤组织一部分用于诱变处理,一部分接种到分化培养基,诱导生芽、生根.以上培养条件均为(25 2) ,每天16h 光照.1.2.3 愈伤组织的诱变处理用无菌水分别配置2,4,6,8,10mL/L 的甲基磺酸乙酯(EM S)溶液,将2种愈伤组织在预先灭菌的培养 收稿日期:2006 12 07;修回日期:2007 03 02基金项目:国家自然科学基金(30070461,30370905);北京市自然科学基金(5032009)作者简介:葛荣朝(1974 ),男,河北故城人,副教授,主要从事小麦、草坪草、饲草育种和分子细胞遗传学研究.通讯作者:赵茂林(1965 ),男,研究员,主要从事小麦边缘杂交育种.E-mail:zhaomaolin@第31卷/第4期/2007年7月河北师范大学学报/自然科学版/J OU RNAL OF HEB EI NO RMAL UNIV ER SITY /Natu ral Scien ce Edition /Vol.31N o.4Jul.2007皿中用解剖刀切成3mm !3m m 大小,分别倒入不同的EM S 进行诱变处理,2h 后用无菌水冲洗3次,将诱变后的愈伤组织块接种在继代培养基上,每瓶接种大约30块,每处理接种10瓶.每隔1周统计1次,计算各处理的愈伤组织致死率:致死率=褐化死亡的愈伤组织块数接种的愈伤组织总块数!100%.2 结果与分析2.1 愈伤组织的诱导与生长2种草坪草种子接种到诱导培养基上,暗培养7d 左右,高羊茅出现萌动、生芽,14d 后,多数种子萌发,一些幼芽的基部生长出愈伤组织.多枝赖草的种子在培养到21d 时,种胚处观察到白色突起,形成愈伤组织.生长约40d 后,将2种愈伤组织转移到继代培养基上继续暗培养,愈伤组织生长趋于旺盛,大约30d 继代1次.在继代的过程中,高羊茅的部分愈伤组织有分化出绿苗的现象.A.高羊茅愈伤组织;B.多枝赖草愈伤组织;C.高羊茅愈伤组织出苗;D.多枝赖草愈伤组织出苗;E.高羊茅幼苗移栽到大田.图1 多枝赖草和高羊茅的组织培养2.2 愈伤组织的分化与生根将暗培养的愈伤组织移至分化培养基上,在光照条件下诱导形态建成.高羊茅愈伤组织在20d 左右即分化出幼苗,分化率达83.9%以上.多枝赖草的愈伤组织表面约14d 后产生若干淡绿色芽点,25d 左右长成丛生状幼苗,平均每块愈伤组织块可以分化出20~30个小植株,其分化率约为63.9%以上.在2种幼苗生长的同时会生出大量须根,生根率可达100%.成苗后打开瓶口炼苗7d.然后取出小苗洗净琼脂,移栽于大田,覆盖塑料薄膜培养10多天后,去掉塑料薄膜,使其自然生长,成活率可达95%以上.2.3 愈伤组织的诱变2种草坪草的愈伤组织经过EMS 诱变,分别接种到继代培养基上.在培养到第3周时,不同诱变处理间的愈伤组织出现明显的生长差异;培养到第4周时,统计愈伤组织的致死率.分析统计结果可以发现,多枝赖草和高羊茅的愈伤组织经过EM S 溶液处理后,其生长明显受到抑制,而且随着处理液体积分数的提高,其∀532∀生长受抑制的现象更加明显,褐化死亡的数目明显增加(见图2、表1).多枝赖草愈伤组织经过6mL/L EMS 溶液处理2h 后,308块愈伤组织只有42块出现明显生长,187块褐化死亡,致死率达到60.7%;而高羊茅的愈伤组织经8m L/L EM S 溶液处理后,310块愈伤组织有25块出现明显生长,195块褐化死亡,致死率为62.9%.所以通过本试验初步确定EM S 溶液对多枝赖草愈伤组织的半致死体积分数为6mL/L,对高羊茅愈伤组织的半致死体积分数为8mL/L.A.2mL/L EM S 溶液诱变的高羊茅愈伤组织;B.6mL/L EM S 溶液诱变的多枝赖草愈伤组织;C.8mL/L EM S 溶液诱变的高羊茅愈伤组织.图2 多枝赖草和高羊茅愈伤组织的EMS 诱变表1 多枝赖草和高羊茅愈伤组织EMS 的诱变结果EM S 溶液/(mL ∀L -1)多枝赖草愈伤组织接种数褐化数明显生长致死率/%高羊茅愈伤组织接种数褐化数明显生长致死率/%23107910125.53274918715.043201237638.4324889527.263081874260.73171335942.083202762686.33101952562.910331315395.23032491182.23 讨 论试验中多枝赖草由种子诱导出愈伤组织的时间偏长,且出愈率较低,分析其原因主要是由于多枝赖草种子本身发芽所需时间较长,约15d 左右,且发芽率较低.在愈伤组织诱导过程中,生长素与细胞分裂素的协同调控作用在组织培养中非常重要.试验中同时添加了生长素2,4 D 和细胞分裂素Kt 2种植物激素,其中2,4 D 主要诱导愈伤组织产生、Kt 则促进了愈伤组织的快速生长,二者协同作用,使愈伤组织得以顺利诱导和旺盛生长.化学诱变是通过采用一些分子结构不太稳定的化学诱变剂进行,常见的化学诱变剂包括甲基磺酸乙酯(EM S)、硫酸二乙酯(DES)和叠氮化钠(NaN 3)等,其中EM S 是当前已研究证明使用效果最明显的化学诱变剂.EMS 主要是通过在鸟嘌呤的O 6位置进行烷基化,然后在DNA 复制过程中,烷基化鸟嘌呤与胸腺嘧啶形成配对,造成G:C 转换成A:T,从而造成单一碱基对的改变而形成点突变[5,6].这些点突变植株可以最大限度保持原品种的全部优良特性,同时增加一些新的性状,如抗病性、耐盐性、耐寒性等[7].在笔者的诱变试验中,生长状态较好的高羊茅愈伤组织对EMS 溶液的损伤具有更高的抵抗力,其半致死体积分数要高于多枝赖草.经过初步实验得出了2种草坪草的组织培养方法和EM S 诱变的半致死体积分数,这对进一步利用EM S 诱变这2种愈伤组织、获得优良草种具有很好的应用价值.参考文献:[1] 谢盛椿,李杰.浅谈北京的草坪草种及其应用[J].绿化与生活,2005,121(3):11 14.[2] 张殿京,白冬梅,李悦生,等.我国草坪业生产发展中存在的问题及解决途径[J].天津农业科学,2001,3:52 54.∀533∀[3] 黄春堂,廖帆,杨光,等.克拉玛依地区冷季型草坪草引种栽培[J].林业科技通讯,2000,6:26 30.[4] 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the same time.Tw o kinds of callus were induced and handled by EMS (ethyl methane sulphonate).T he results show ed that the lethality rate of callus w as increasing w hen we increased the concentration of EMS.By analyzing the results,the median lethal concentration of EM S for the callus of Leym us multicaulis and tall fescue w as 6mL/L and 8mL/L respectively.Key words :L ey mus multicaulis ;tall fescue;tissue culture;callus;EMS mutation(责任编辑 柴 键)(上接第530页)[16] 毛国红,汤文强,郭毅,等.白芷细胞外ECBP 21全长cDNA 克隆[J].科学通报,2002,47(9):689 692.[17] M EY ERO WIT Z E M.Plants Compar ed to Animals:T he Br oadest Comparative Study of Evelopment [J].Science,2002,295:1482 1488.The Comparison of the Structure Between ExtracellularPolypeptide of Plant and Human CytokinesLIU Hui 1,2, GUO Yi 1(1.College of Life S cience,Hebei Normal U niversity,H ebei S hijiazhuang 050016,China;2.School of Science,H ebei University of Technol ogy,Tianjin 300130,China)Abstract:Extracellular polypeptides of plant have been proved to be important signals in sig nal transduc tion.U sing tools of bioinform atics,the amino acid sequence of these extracellular polypeptides of plant,animal and microbe w ere studied.Some interesting results w ere found that there is some common character about ex tra cellular polypeptide from different species,which is the very correlative 3D ing bioinformatics tool,the 3D structure of receptor of calmodulin,an important new extracellular polypeptides of plant w as g iven.What w ere found would help to identify new extracellular polypeptides of plant.Key words:extracellular polypeptide;cytokine;structure;bioinformatics(责任编辑 柴 键)∀534∀。
三倍体毛白杨遗传转化体系的建立及分子鉴定
三倍体毛白杨遗传转化体系的建立及分子鉴定木质素是植物体中具重要生物功能的次生代谢产物。
然而纸浆生产主要是将原料中的木质素与用于造纸的纤维素分离，该工艺过程产生了造纸工业的主要污染废液，并且增加造纸成本。
本研究目的在于利用反义RNA技术，在分子水平调节木质素的生物合成，降低中国特有造纸树种三倍体毛白杨的木质素含量，培育更适于我国造纸工业的原料树种。
而建立高效的遗传转化体系是利用植物基因工程改良三倍体毛白杨造纸性能的关键。
本论文取得如下结果：（1）首次建立起三倍体毛白杨高效组织培养再生体系，得出以三倍体毛白杨叶片为外植体的最优分化培养基是MS+6-BA（0.25mg／L）+IBA（0.25mg／L）+ZT（0.25mg／L）；以茎段为外植体的最优分化培养基是MS+IBA （0.25mg／L）+ZT（0.25mg／L）+TDZ（0.1μM）。
（2）本实验优化三倍体毛白杨遗传转化体系并着重研究影响农杆菌转化效果的因素，得出EHA105是用于毛白杨遗传转化的适宜菌株；在共培培养基中加入200μM的乙酰丁香酮可以提高三倍体毛白杨的转化频率，由1.8％提高到7.0％；同时还发现共培培养基中去除微量元素的CoCl<sub>2</sub>2H<sub>2</sub>O，转化频率由2.9％升高到6.0％。
此外，本实验得出最佳菌液浓度为OD<sub>600</sub>=0.3和浸菌时间为15-20分钟。
（3）通过农杆菌介导法，将反义表达载体APCoA转化三倍体毛白杨。
PCR，PCR-Southern检测证实，外源基因已整合到三倍体毛白杨基因组中。
Northern点杂交结果表明外源基因已在转录水平表达。
（4）本实验已获得大量转基因三倍体毛白杨，并已将42个转基因株系移栽至温室中成活，为CCoAOMT基因功能分析，筛选出木质素含量降低的三倍体毛白杨的工程植株奠定坚实基础。
草坪植物遗传转化的研究进展
草坪植物遗传转化的研究进展
何勇;田志宏
【期刊名称】《生物技术通讯》
【年(卷),期】2003(014)006
【摘要】从草坪植物组织培养与植株再生体系的建立、转基因的研究现状以及转基因育种的应用前景和存在的问题入手,综述了近年来草坪植物遗传转化的研究进展,并对草坪植物遗传转化的几种主要方法作了较为详细的阐述.
【总页数】4页(P539-542)
【作者】何勇;田志宏
【作者单位】湖北农学院,生命科学学院生物技术重点实验室,荆州,434025;湖北农学院,生命科学学院生物技术重点实验室,荆州,434025
【正文语种】中文
【中图分类】Q943
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2.梨遗传转化与遗传标记研究进展 [J], 刘淑芳;汤浩茹;罗娅;王小蓉
3.农杆菌介导禾本科牧草遗传转化的研究进展 [J], 张月;李莹;戴绍军
4.欧李再生和遗传转化体系的研究进展 [J], 郎绍裕;任静;王迪;笈小龙;宋兴舜
5.木本植物遗传转化研究进展 [J], 徐赛赛;翟晓巧
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杏植株再生与遗传转化研究进展
杏植株再生与遗传转化研究进展
王鸿;郝燕;王玉安;陈建军;王发林
【期刊名称】《果树学报》
【年(卷),期】2011(28)5
【摘要】杏是我国主要果树之一,其育种一直以传统方法为主,一般存在周期长、成本高、可利用资源有限、种间杂交后代成活率低等问题。
植物生物技术育种方法可以解决这些问题。
再生与转化系统是实现杏基因转化的前提与基础。
杏的再生与转化技术还不成熟,目前只限于少数几个品种或种子材料,其再生与转化方法有待进一步研究。
结合作者的研究结果,综述了杏的不同类型外植体再生体系的建立,分析了各种因素如基因型、培养基、激素等对再生的影响,并总结了杏在遗传转化方面取得的最新进展及影响转化效率的关键因素。
【总页数】5页(P875-879)
【关键词】杏;根癌农杆菌;外植体;转基因;抗生素
【作者】王鸿;郝燕;王玉安;陈建军;王发林
【作者单位】甘肃省农业科学院林果花卉研究所;Departamentode Mejora Vegetal,CEBAS-CSIC
【正文语种】中文
【中图分类】S662.2
【相关文献】
1.基因枪法导入Bar基因转化小麦幼胚的研究--抗性愈伤组织与再生植株的遗传转化 [J], 曹颖;胡尚连;李文雄;刘锦红
2.月季的植株再生及遗传转化研究进展 [J], 高莉萍;包满珠
3.高羊茅和其他羊茅植株再生与遗传转化研究进展 [J], 吴关庭;胡张华;陈锦清
4.短柄草植株高频再生及遗传转化体系的探索 [J], 宋昌梅
5.菊花高效瞬时转化体系建立及稳定遗传植株再生 [J], 邓叶;阳淑金;杜新平;董彬;任丽萍;房伟民;陈发棣;蒋甲福
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马铃薯高效再生及遗传转化体系的优化
马铃薯高效再生及遗传转化体系的优化作者：***来源：《安徽农业科学》2024年第03期摘要為优化马铃薯高效再生及遗传转化体系，研究鄂马铃薯3号茎段外植体在不同激素浓度配比下愈伤组织及分化情况，获得最佳愈伤组织及分化激素配比，再采用根癌农杆菌的遗传转化进行筛选，获得最佳转化体系，为马铃薯优质品种的基因工程育种提供依据。
结果表明，不同激素浓度配比下愈伤组织及分化率差异较大，其中2.0 mg/L ZR+0.1 mg/L IAA 激素配比下可高效再生出芽，出芽率高达100%，芽长势粗壮。
通过构建植物表达载体pCambia1301，以GV3101为介导菌株，预培养2～3 d，共培养2～3 d，350 mg/L羧苄青霉素，50 mg/L卡那霉素筛选浓度转化效果较好，转化效率可达65%，其中转化苗在0.8 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA激素配比的培养基中可形成再生植株，再生率达80%，苗茎粗壮，根系发达。
关键词马铃薯；茎段；激素；遗传转化；转化率中图分类号 S532 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）03-0035-05doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.03.009Optimization of High Efficiency Regeneration and Genetic Transformation System in PotatoAbstract In order to optimize the efficient regeneration and genetic transformation system of potato， the effects by using stem segment of Hubei potato No.3 as explants were studied in different hormone concentration ratios， and the optimal callus and differentiation hormone ratio were obtained. Then， the genetic transformation of Agrobacterium tumefaciens was used for screening to obtain the best transformation system， which provided the basis for genetic engineering breeding of high quality potato varieties. The results showed that the callus and differentiation rate were great different under the ratio of different hormone concentration. The hormone ratio of 2.0 mg/L ZR and 0.1 mg/L IAA could regenerate the buds efficiently， the germination rate was as high as 100%， and the bud growth was strong. By constructing expression vector pCambia1301 in plant， GV3101-mediated strain， pre-cultured for 2-3 days， and co-cultured for 2-3 days， and 350 mg/L carbenicillin， and 50 mg/L kanamycin to screen the concentration was better. The transformation efficiency could reach 65%. The transformed seedlings could form regenerated plants in the medium of 0.8 mg/L IBA and 0.2 mg/L NAA hormone. The regeneration rate could reach 80%， the stems were thick and the roots were developed.Key words Potato;Stem segment;Hormone;Genetic transformation;Conversion rate马铃薯（Solanun tuberosum L.）为茄科茄属一年生草本块茎植物［1］，是我国主要粮食作物之一，产量排在小麦、玉米、水稻之后占第四位［2］。
羊草分子生物学研究进展
羊草分子生物学研究进展摘要：羊草是一种优质牧草。
对发展我国优质草地畜牧业具有重要意义，以往研究对羊草生物学以及生理生态学进行了比较深入的探讨，但对于羊草分子生物学的研究起步较晚，进展也比较缓慢，近年来，随着分子生物学研究手段和技术的进步，以及羊草遗传改良的需要，人们在羊草遗传多样性、愈伤组织培养、酶蛋白分析以及基因克隆与转化等研究领域陆续开展了一些有益的尝试，并取得了重要的研究成果，结合科研工作的需要，对羊草分子生物学的最新进展进行了概述，并就亟需解决的问题进行了分析，提出了该领域今后的发展方向。
关键词：羊草；分子生物学；遗传多样性；组织培养；基因克隆羊草(Leymus chinensis)是多年生禾本科赖草属草本植物，由于其环境适应性较强。
具有耐寒、耐旱、耐盐碱等优点而成为松嫩平原的优势物种，同时羊草也是一种重要的牧草资源，蛋白质含量高，适口性好，耐践踏，在发展草原畜牧业方面具有重大的经济和社会效益，但羊草种子发芽率低、种子萌发最适pH值为8.0～8.5，加上过变放牧和草地盐碱化日益加重等原因，我国现存系统管理重点实验室项目(K09M6)羊草草地约有90％以上发生了不同程度的退化，因此，研究羊草的遗传分化、抗逆机理、栽培育种以及转基因等对于改善生态环境和草场建设具有重要意义，随着分子生物学对各个学科的交叉渗透，使羊草的研究从细胞水平进一步深入到分子水平，羊草属于异交植物，物种趋向于在种群中具有较高水平的变异性，仅在松嫩草原中西部靠近内蒙古高原东部草原上的羊草种群就数以千计，这为研究羊草种群的遗传多样性提供了对象，培养愈伤组织是进行羊草转基因研究的前期工作，但诱导率低的问题尚未得到解决，笔者结合自己的科研工作，对羊草分子生物学领域的研究成果加以综述，旨为羊草抗逆分子机理研究提供参考资料。
1羊草遗传多样性研究由于羊草生态适应性强、分布范围广、生境类型多样，在长期的适应和进化过程中，羊草种群之间在形态、生理、生态以及遗传特征方面均产生了趋异，RAPD(randomly amplified polymorphic DNA，随机扩增多态DNA)技术可以在对被检对象无任何分子生物学资料的情况下对其基因组进行分析，而且具有费用较低、方便易行、模板DNA用量少、不需要同位素，在安全性和实验操作上具有比AFLP(amplified fragment length polymorphism，扩增酶切片段多态性)、SSR(simple sequence rc-peat，微卫星重复序列)等分子标记更加简便易行等优点，从而使其成为目前研究羊草遗传多样性的最重要的手段之一，该技术主要是利用各种群羊草的总基因组DNA作为模版，筛选能够扩增出具有明显差异性条带的随机引物，以至少两次重复均出现的结果做0，1矩阵图，即有条带记为1，无条带记为0，计算总片段数及多态位点百分率、各种群间遗传相似系数和遗传距离，利用分析软件进行聚类分析从而得到其遗传结构树状图，羊草RAPD分析可以用于研究羊草的种群关系以及遗传分化的影响因子，崔继哲等应用RAPD技术证明相似生境或同一地域的种群在一些位点上表现出相似或相同的变化，刘惠芬等运用RAPD技术对内蒙古典型草原不同生境8个羊草种群进行分析，聚类结果显示生境相似的种群能够聚在一起，而地理距离最近的种群不一定归为一类，说明小范围内羊草种群间的遗传分化与地理距离不存在相关性，而与其生境间的相似度相关，影响遗传相似性的不是单一因子而是各种因子的综合作用，较小地理范围内羊草种群间的遗传分化主要是由环境的异质性所引起的，笔者曾以采自中国大安碱地生态试验站(N45°36′，E123°53′)的羊草种子单株播种栽培，以每株羊草幼苗的地上部为材料进行RAPD分析，30个实验样品的平均遗传距离为0.1909，共可分为4个类群(待发表)，通过RAPD分析，还可以进一步将羊草遗传分化多样性的原因具体化，汪恩华等””利用分子标记与形态标记以21个有效随机引物中对9份羊草材料进行RAPD分析，对随机抽取的17份禾草种质进行了种质评估的比较研究，结果表明，羊草种质的小穗数、种子千粒重、叶色、有性繁殖量和结实率5个形态学指标与遗传多样性指标存在一定的相关性，应用RAPD技术对不同生境羊草在水分胁迫下游离脯氨酸含量的变化做聚类图比较分析，证实水分是影响羊草种群间遗传变异和生态型分化的一个最主要的因子，虽然水因子是影响羊草分化的一个主导因子，但是在实际研究工作中也认识到羊草变异和分化是多种生态因子综合起作用的结果(如温度、海拔、经纬度、土壤类型等)，而且各因子之间又是相互影响，在不同的生境中限制因子又是变换的，这就造成不同地理种群的羊草遗传分化过程的复杂性，由此可见，目前以羊草为实验材料的RAPD分析虽有许多报道。
山羊转基因技术研究进展
基金项 目： 吉林省教育厅科学技术项 目（ ２ ０ ｉ ２ Ｎ ｏ ． ５ ６ ）
作者简介 ： 马馨（ 】 ９ ８ ０ 一 ） ， 女， 讲师， 博±。 通讯作者 ： 姜怀志 （ １ ９ ６ ８ 一 ） ， 男， 教授 ， 博士 ， 博士生导 师， 主 要从事绒 山羊遗传 育
种研究。
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收稿 Ｅ ｔ 期： ２ ０ １ ３ — ０ ６ — １ ８
吸引力 的介 于牛和兔之 间的中间物种 ， 且与绵 羊相 比也 具有一 定优势 ， 比如 山羊 的泌乳成绩要好 于绵羊 。事实 上， 利用山羊奶生产重组蛋 白的首次报道是在 １ ９ ９ １ 年ｎ ， 仅落后 于绵羊 ２ 年ｌ ２ Ｉ 。本文将 对当前 转基因山羊 的相关
关键词 ： 转基 因 羊； 原核 注射 ； 核 移植 ； 锌 指核酸酶
中图分类号 ： ￥ ８ ２ ７ ． ２ 文献标志码 ： Ａ 文章编号 ： ２ ０ ９ ５ — ３ ８ ８ ７ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ５ — ０ ０ ５ ２ — ０ ４
Ｐｒ ｏｇ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ Ｔｒ ａ ｎｓ ｇｅ ｎ ｉ ｃ Ｇ ｏａ ｔ
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｃ ｏ ｍｐ ａ ｒ ｅ ｄ ｗ ｉ ｔ ｈ ｐ ｉ ｇ ｓ， Ｃ Ｏ Ｗ Ｓ ａ ｎ ｄ ｓ ｈ ｅ ｅ ｐ， ｔ ｈ ｅ ａ ｐ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｉ ｓ ｉ ｎ ｇ ｏ ａ ｔ ｓ ｉ ｓ ｌ ｅ ｓ ｓ． Ｈｏ ｗｅ ｖ ｅ ｒ， ａ ｓ ｔ ｈ ｅ ｔ ｉ ｍｅ ｗｅ ｎ ｔ， ｉ ｔ
研究及应 用进行 了综述 ， 并 重点 阐述 目前 山羊基因组修
燕麦遗传转化体系的建立和披碱草再生体系的建立的开题报告
燕麦遗传转化体系的建立和披碱草再生体系的建立的开题报告1. 研究背景燕麦是一种重要的粮食作物，具有高蛋白、高纤维和低脂肪的特点，对人体健康具有很好的保健作用。
但由于其遗传转化难度高、生长周期长、生长速度慢等因素限制了其研究和应用。
披碱草是一种可生长于高盐、高碱环境下的植物，具有很强的适应性和生存能力，在生态修复、固沙治沙以及消防等方面具有广泛应用价值。
因此，建立燕麦遗传转化体系和披碱草再生体系对于推动农业科技进步和生态环境保护具有重要意义。
2. 研究目的和意义本研究旨在建立燕麦遗传转化体系和披碱草再生体系，为燕麦的基因工程和披碱草的生态修复提供支持和保障。
具体目标包括：（1）建立燕麦遗传转化体系，实现外源基因的导入和表达。
（2）优化燕麦遗传转化体系，提高转化效率和表达水平。
（3）建立披碱草再生体系，促进其生态修复效果。
（4）研究燕麦的抗病、抗逆性状，并利用遗传转化技术进行功能性基因的导入和表达，为燕麦的品种改良和功能开发提供基础。
3. 研究方法燕麦遗传转化体系的建立包括以下步骤：（1）筛选适合的燕麦品种和组织培养条件。
（2）采用农杆菌介导的遗传转化技术，导入目标基因。
（3）筛选、鉴定和验证转化植株的基因型和表型。
披碱草再生体系的建立包括以下步骤：（1）选取适宜的披碱草种子和培养条件。
（2）采用激素诱导和愈伤组织培养技术，促进披碱草再生。
（3）建立披碱草的快速繁殖和生长条件。
4. 研究预期结果（1）成功建立燕麦遗传转化体系，实现外源基因的导入和表达。
（2）优化燕麦遗传转化体系，提高转化效率和表达水平。
（3）成功建立披碱草再生体系，促进其生态修复效果。
（4）获得燕麦的抗病、抗逆转化植株，并鉴定和验证其基因型和表型，为燕麦品种改良和功能开发提供基础。
5. 参考文献1. 陈琪琦, 陈娟, 蔡泰兴. 燕麦遗传转化技术研究进展[J]. 安徽农业科学, 2019(27): 77-79.2. 张勇, 宋茂金, 张波. 披碱草的应用研究[J]. 化工时刊, 2018(10): 614-617.3. 沈翌, 胡建辉. 燕麦抗逆性状及其机制的研究进展[J]. 中国农业科技导报, 2016(18): 115-117.。
基因枪介导的老芒麦遗传转化体系的建立
植物学报 C /?/>?e s e of Bofany 2021, 56 (1): 62-70, doi: 10.11983/CBB20174•技术方法•基因枪介导的老芒麦遗传转化体系的建立杜鹏飞1'2’3,王玉2,曹英萍2,杨松2,孙志超2,毛德才3’4,鄢家俊3'4李达旭3’4,孙美贞5,付春祥2<,白史且3’f1西南民族大学，成都610041; 2中国科学院青岛生物能源与过程研宄所，中国科学院生物燃料重点实验室，山东省能源 生物遗传资源重点实验室，山东省合成生物技术创新中心，青岛266101; 3四川省草原科学研宄院，成都611731 4国家林草局青藏高原高寒草地生态修复工程技术研宂中心，成都611731; 5青岛市中心血站，青岛266071摘要川草2号老芒麦(Bymtyss/b/ricus)是青藏高原地区治理荒漠化和建设高产人工草地的主要栽培草种。
用川草2号老芒 麦5种外植体诱导愈伤组织，经分化测试，仅幼穗愈伤组织能分化再生。
以当代培养25天和35天的结构致密坚硬的幼穗愈伤 组织为受体，分别进行农杆菌侵染和基因枪转化，结果只有基因枪能转化成功。
在基因枪转化过程中，采用高渗培养和滤纸 干燥2种方式预处理愈伤组织，结果表明滤纸干燥处理比高渗处理转化效率高。
当代诱导25天的幼穗愈伤组织，滤纸干燥处 理2小时转化效率最高，达40%。
该研究成功获得了基因枪转化的以川草2号老芒麦幼穗愈伤为受体的阳性愈伤组织。
关键词川草2号老芒麦，幼穗，农杆菌侵染，基因枪转化，愈伤组织处理杜鹏飞，王玉，曹英萍，杨松，孙志超，毛德才，鄢家俊，李达旭，孙美贞，付春祥，白史且（2021).基因枪介导的老芒麦遗传转化体系的建立.植物学报56, 62-70.老芒麦(Symus s /z b /r /cus ) 乂名曲伯利业披碱草 (Siberian wildrye ),属于禾本科（Poaceae )小麦族 (Triticeae )披碱草属的一种多年生自花授粉、异源四 倍体疏丛型旱生牧草。
谷子转化及再生体系研究进展
随着世界人 口的不断增长 ，对粮食的需求量也相应 增加 ，世界粮农组织计 划至 ２ ２ ０ ５年 主要粮 食作物 产量
（ 括谷 子 ） 要 提 高 到 ４ ５ｔ ｍ 。谷 子 产 量 的提 高 不 包 ． ｈ ／
仅需 要 常 规 的 作 物 育 种 技 术 ，更 需 要 通 过 基 因 工 程 技
（ ｉｅ Ｒ ｓａ ｈＩｓｔ ｅ ｈｎｉ ｃｄｍ ｆ ｇ ｃｌ ｒ ｃ ｎ ｅ，Ｃ ａｇｈ ０ ６ ，Ｃ ｉａ Ｍ ｌ ｔ ｅｅｒ ｔｕ ，Ｓ ａｘ Ａ ａｅ ｙｏ Ａ ｒ ｕｔ ａ Ｓｉ ｃｓ ｈｎｚｉ ４ ０ ｈｎ ） ｌ ｃ ｎ ｉｔ ｉ ｕｌ ｅ １ １
Ａｂｓｒ ｃ ： Ｍｉｌｔｉ ｎ ｍｐ ｒａ ｔｒ ｇｏ ａ ｃｏ ｔ ｓｒｎ ｔｅ ｓ ｅ ｉｔｎ ｅ， ｗｉｅ ａ ａ ｔｂ ｌ ｙ ａ ｄ ｉｈ ｎ ｔｉ ｏ ． ｈ ｔａ ｔ ｌ ｓ ａ ｉ ｏｔｎ ｅ ｉｎ ｌ ｒｐ ｗｉｈ ｔｏ ｇ ｓｒ ｓ ｒｓｓａ ｃ ｅ ｄ ｄ ｐａ ｉｉ ｎ ｒｃ ｕｒｔ ｎ Ｔ ｅ ｔ ｉ ｒｐ ｒｓｏ ｎ ｖｔｏ ｒｇ ｎ ｒｔｏ ｙ ｔｍ ｎ ｅ ｅｉ ｒｎ ｆｒ ｔ ｎｏ ｌｅ ｒ ｅ ｔｈ ｍｅ ａ ｄ ａ ｒａ ． ｅｐ ｉ ｃｐｅ ｎ ｅ ｏｔ ｎ ｉ ｉ ｅ ｅ ｅａｉｎ ｓ ｓｅ ａ ｄ ｇ ｎ ｔｃｔａ ｓｏ ｍａｉ ｆｍｉ ｔａｅ ｆｗ ａ ｏ ｎ ｂ ｏ ｄ Ｔｈ ｒｎ ｉｌｓａ ｄ ｒ ｏ ｌ ｍｅｈ ｄ ｏ ｔｅ ｒｐ ｓｅ ｇ ｎ ｔｃ ｔａ ｓｏ ａｉｎ， ｔｓｕ ｃ ｌ ｒ ｒｇ ｎ ｒｔｏ ｓ ｓｅ ， ａ ｄ ｎ ｌｅ ｃｎ ｆｃｏ ｓ ａｅ ｔｏ ｓ ｆ ｈ ｅ ｏ ｄ ｅ ｅｉ ｒｎ ｆｒ ｔ ｍ ｏ ｉｓ ｅ ｕ ｔ ｅ ｅ ｅ ｅａｉｎ ｙ ｔｍ ｕ ｎ ｉ ｆ ｎ ｉ ｇ ａ ｔｒ ｒ ｕ