骨髓间充质干细胞详解
制作人：黄俊波 专业：中西医结合基础
主讲内容：
2020/9/26
• BMSCs概念
• BMSCs微观结构
• BMSCs分离、培养、鉴别
四 BMSCs分化 五一 BMSCs运用
干细胞的分类：
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骨髓的分类：
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黄骨髓
骨
血窦
髓
红骨髓
造血干细胞
二、BMSCS微观结构：
相邻细胞间还可见到一些细胞膜局部 电子密度增高、细胞膜内颗粒相互融 合的缝隙连接。缝隙连接可加强相邻 细胞的连接,但更重要的是细胞的一种 通讯结构,有利于细胞间信息传递，与 细胞分泌、增殖、分化相关。
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三、BMSCS的分离、培养、鉴定：
目前用于分离BMSCs的方法主要有密 度梯度离心法、贴壁筛选法、流式细 胞仪分离法和磁珠分选法。 流式细胞仪和磁珠分选法虽然可获得 较纯的细胞，但是费用昂贵、操作复 杂、不适合临床应用。
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三、BMSCS的分离、培养、鉴定：
BMSCs的培养方法有二维培养（极低 密度传代培养，低氧张力下培养) 、 三维培养、静止性0/9/26
三、BMSCS的分离、培养、鉴定：
BMSCs没有特异性的抗原表型，对 其鉴定还没有直接的方法。
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一、BMSCS概念：
骨髓间充质干细胞的基本概念是上世 纪70年代，Friedenstein等在做全骨髓 培养时报道了骨髓中有骨髓多能基质 干细胞。 由于呈成纤维细胞样外观也被称为集 落形成单位成纤维细胞(clony forming units fibroblasts，CFU--F)或骨髓基质细 胞(bone mesenchymal stem cells BMSCs)。
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二、BMSCS微观结构： BMSCs有粗细不均的胞质突起,透射电 镜下胞质中有丰富的细胞器,如核糖体、 粗面内质网、分泌小泡、线粒体等， 细胞表面可见微绒毛突起,表明该细胞 具有较强的蛋白质合成能力,是其能够 分泌许多生长因子，维持自身生长分 化，支持造血干细胞造血的结构基础。
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造血组织
骨基质细胞（间充质干细胞）
一、BMSCS概念： 骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs) 是在骨髓中发现的 一种起源于胚胎中胚层，具有自我复 制和多向分化潜能的非造血干细胞。
一、BMSCS概念：
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BMSCs对骨髓造血干细胞起支持、诱导作用。
四、BMSCS的高分化能力和多分化潜能：
对BMSCs进行传代培养时可传25代， 扩增50倍以上。 对细胞周期研究发现， 绝大部分细胞处于GO／G1期。这提示 其有高分化能力。 骨髓中所含的少量多能MSCs是多种细 胞的前体细胞。其在不同的诱导条件 下, 能向成骨细胞、成软骨细胞、成纤 维细胞、脂肪细胞等中胚层组织细胞 分化。
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五、BMSCS的运用：
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随着细胞学和组织工程学的发展,利用 BMSCs的多向分化性及其可在体外表 达多种外源目的基因的特性,将其作为 种子细胞用于细胞治疗和基因治疗的 研究己成为当前研究的热点之一。
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骨 髓 间 充 质 干 细 胞 临 床 运 用
MSC干细胞
脊髓损伤动物模型
干细胞注射液
间充质干细胞治疗肝病技术，为传统医学难以解决的病毒性
肝炎导致肝硬化、肝功能衰竭提供新的治疗途径。该技术
2009年得到总后卫生部批准，在临床进行科研性质的使用 间充质干细胞修复脑中风后中枢神经损伤科研项目，2009年 在北京市科委立项，并得到专项科研经费资助； 获得“人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液及其制备方法” 专利技术（ZL201010551722.8），并于2010年12月10日在 药监局注册；
UC-MSC治疗肝硬化
患者胡某，男性，48岁，诊断为肝硬化早期，脾功能亢进。
病情简介：腹胀， 纳差，精神萎靡，乏力，牙龈出血，鼻衄，不能正 常工作。超声提示，脾大，门脉增宽。
07 年 11月第一次 MSC 治疗。 2 个月后腹胀、乏力减轻，食欲增加，牙 龈出血减轻，鼻出血消失。超声提示，脾脏缩小，门脉变窄。化验显 示，肝功能指标基本恢复正常。 08年3月21日行第二次MSC治疗，目前已经正常工作。
MSC促进皮肤移植成功
MSC的多向分化能力
MSC在人体的分布
胰腺 骨髓
脐血
胎盘 胎肝
间充质干细胞
脐带 脂肪
胎肺
骨骼肌
羊水
真皮
骨膜
不同来源MSC的比较
脐带间充质干细胞 成人骨髓间充质干细胞
多潜能性、增殖能力强 天然生物资源 低抗原性，无免疫排斥，调节免疫 MSC产率高,1MSC/1600MNC 细胞纯净，病毒污染风险低 易产业化和临床应体来源、无免疫排斥 MSC产率低,1-10MSC/106MNC 有病毒感染风险
有限临床应用
脐带间充质干细胞(UC-MSC)
体外培养扩增获取人UCMSC
原代贴壁
骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展
骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展1. MSCs成骨分化途径的调控机制：多种信号通路参与了MSCs的成骨分化，特别是BMP (bone morphogenetic protein) 信号通路、Wnt/β-catenin 信号通路、TGF-β (transforming growth factor-beta) 信号通路等。
这些信号通路可以通过调控一系列关键性转录因子例如Runx2 (runt-related transcription factor 2)、Osx (osterix) 和Ocn (osteocalcin)等，来促进MSCs向成骨细胞分化。
2. MiRNA 调控MSCs成骨分化：近年来，研究发现MicroRNA (miRNA) 在调控MSCs成骨分化中起着重要作用。
例如，miR-2861 可以通过靶向抑制MEKK2 (mitogen-activated protein kinase kinase kinase 2) 来促进MSCs的成骨分化。
此外，miR-125b 可以通过调控Smurf1 (SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1) 表达来抑制MSCs的成骨分化。
3.MSCs与激素调控成骨分化：激素对于MSCs的成骨分化也具有重要影响。
例如，雌激素通过与雌激素受体结合，可以促进MSCs向成骨细胞分化，并抑制骨吸收。
此外，研究还发现糖皮质激素会抑制MSCs成骨分化并诱导MSCs向脂肪分化。
4. MSCs与骨组织工程：越来越多的研究开始将MSCs应用于骨组织工程中，通过将MSCs和多种生物材料结合，可以制造出用于骨缺损修复的生物人工骨。
例如，Makino等人成功地利用MSCs和羟基磷灰石（HA）复合材料构建了能够促进骨骼再生的生物人工骨。
此外，MSCs与多肽纳米材料的结合也显示出了巨大的应用潜力。
5.MSCs与骨性疾病的治疗：由于MSCs具有分化为成骨细胞的潜能，并能产生一系列促进骨骼再生的细胞因子，因此MSCs也被广泛应用于骨性疾病的治疗。
骨髓造血干细胞的分类
骨髓造血干细胞的分类骨髓造血干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，它们在人体内起着至关重要的作用。
根据其分化能力和功能特点的不同，骨髓造血干细胞可以分为多个分类。
本文将介绍骨髓造血干细胞的主要分类及其特点。
1. 多能造血干细胞（multipotent hematopoietic stem cells）多能造血干细胞是骨髓中最早出现的干细胞种类，也是最原始的造血干细胞。
它们具有自我更新能力，可以不断分化为各种成熟的血细胞系列，包括红细胞、白细胞和血小板。
多能造血干细胞在造血过程中起着至关重要的作用，能够维持骨髓内各种血细胞的正常水平。
2. 淋巴造血干细胞（lymphoid stem cells）淋巴造血干细胞是一类具有淋巴细胞分化潜能的骨髓干细胞。
它们主要分化为T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）。
T淋巴细胞和B淋巴细胞是免疫系统中的重要成分，参与体内的免疫应答和免疫记忆的形成。
自然杀伤细胞则具有直接杀伤肿瘤细胞和感染细胞的功能。
3. 髓样造血干细胞（myeloid stem cells）髓样造血干细胞是一类具有髓样细胞系分化潜能的骨髓干细胞。
它们主要分化为红细胞、粒细胞、巨噬细胞、单核细胞和血小板。
红细胞携带氧气和二氧化碳，粒细胞和巨噬细胞参与机体的免疫防御，单核细胞具有巨噬细胞和树突状细胞的功能，血小板参与血液凝固过程。
4. 间充质干细胞（mesenchymal stem cells）间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的干细胞，来源于骨髓或其他组织。
它们可以分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种成分，参与骨骼和结缔组织的形成和修复。
间充质干细胞具有免疫调节和抗炎作用，在医学领域中有广泛的应用前景。
5. 血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells）血管内皮祖细胞是一类具有分化为内皮细胞潜能的骨髓干细胞。
它们可以分化为血管内皮细胞，参与新血管的形成和修复。
骨髓间质干细胞成软骨诱导分化实验原理
骨髓间质干细胞成软骨诱导分化实验原理
软骨的破坏、缺失是包括骨关节炎（osteoarthritis，OA）在内的多种骨科疾病的重要病理改变。
由于软骨特殊的解剖及组织特性，如缺乏血管和淋巴管的分布，使得其自我修复能力异常不足，因此通过人工方法修复软骨破坏具有重要临床意义。
近年来，随着间充质干细胞的发现和研究深入，其来源广泛、良好的增殖能力、多分化潜能、与各种3D支架材料具有良好的生物相容性等特性，使得其在软骨修复应用中具有令人期待的潜力。
MSC成软骨分化的过程：MSC首先收回其突起，聚集成团，这个团中间的细胞经分裂分化转变成一种大而圆的细胞，即成软骨细胞；成软骨细胞产生基质和纤维（主要为II型胶原蛋白），当基质的量增加到一定程度时，成软骨细胞被分隔在陷窝内，分化为成熟的软骨细胞。
体外诱导成软骨分化的鉴定主要围绕成软骨的标志物——II型胶原蛋白来进行，包括通过免疫组化、Westernblot检测II型胶原蛋白的表达和RT-PCR检测II型胶原蛋白的mRNA的表达，不同的角度进行鉴定；而甲苯胺蓝则主要检测成软骨细胞内酸性粘多糖。
下图是骨髓间充质干细胞的成软骨分化诱导图，可以看到软骨细胞埋藏在软骨间质内，它所存在的部位为一小腔，称为软骨陷窝（cartilage lacuna）。
骨髓间充质干细胞研究与应用概况
骨髓间充质干细胞研究与应用概况于雷;高俊玲【摘要】骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal cells,BMSCs)是当下热点研究对象之一。
1867年德国病理学家Cohnheim教授[1]在研究创口愈合过程中发现骨髓中存在一种非造血系统的多潜能细胞,但研究因为条件原因未能深入。
后来有研究者[2]在20世纪60年代开展一系列开创性研究,发现从骨髓中分离得到长梭状、成纤维细胞样的细胞群,在塑料培养皿中呈集落样贴壁生长;1987年,又发现这种骨髓单核细胞可在一定的条件下分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。
培养增殖二十代后仍保有其多向分化的潜能。
于是把这种多能细胞称为间充质干细胞(mesenchyma stem cell,MSC)。
【期刊名称】《华北理工大学学报：医学版》【年(卷),期】2018(020)002【总页数】5页(P164-168)【关键词】骨髓间充质干细胞;肺纤维化;缺血性脑卒中【作者】于雷;高俊玲【作者单位】[1]华北理工大学基础医学院,河北唐山063000;[1]华北理工大学基础医学院,河北唐山063000;【正文语种】中文【中图分类】R329.2骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal cells，BMSCs)是当下热点研究对象之一。
1867年德国病理学家Cohnheim教授[1]在研究创口愈合过程中发现骨髓中存在一种非造血系统的多潜能细胞，但研究因为条件原因未能深入。
后来有研究者[2]在20世纪60年代开展一系列开创性研究，发现从骨髓中分离得到长梭状、成纤维细胞样的细胞群，在塑料培养皿中呈集落样贴壁生长；1987年，又发现这种骨髓单核细胞可在一定的条件下分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。
培养增殖二十代后仍保有其多向分化的潜能。
于是把这种多能细胞称为间充质干细胞(mesenchyma stem cell，MSC)。
骨髓间充质干细胞的研究
的 ｓｉ／ ｇ裸 鼠的胫 骨 前 肌 ， 胞 迁 徙 入 该 区域 ， 生 成 ｃ ｂ ｄ 细 发 肌 分 化 ， 与 了肌 纤 维 的再 生 。Ｗ ａ ｇ等 将 Ｄ ＰＩ 参 ｎ Ａ 标 记 后 的成 年 小 鼠 的 ＭＳ ｓ 注 入 另 一 小 鼠 的 心 肌 中 ， ～ Ｃ ， ４
１ ２周 后 ， 者 ＭＳ ｓ向 心 肌 细 胞 分 化 。 供 Ｃ
维普资讯
国 外 医 学 输 血 及血 液 学 分册 ２ ０ ０ ２年 第 ２ ５卷 第 ４期
骨 髓 问充 质 干细 胞 的 研 究
岑航辉 综 述 韩 春 茂 审 校
【 要 】 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 （ Ｃ ） 骨 髓 中 的 非 造 血 细 胞 ， 成 造 血 微 环 境 ， 持 造 血 ， 有 向 成 骨 摘 ＭＳ ｓ 是 构 支 具
种 于 体 内 的胶 原 明 胶 支 架 上 ， 比较 所 修 复肌 腱 的动 力 学
和细胞形态 。
１． ４ 向 成 肌 ／ 肌 细 胞 方 向 心
分 化 为成 骨 细 胞 、 骨 细 胞 、 肪 细 胞 、 肌 细 胞 、 经 软 脂 成 神 元 等 。 目前 对 这 些 细 胞 还 没 有 相 对 统 一 的 称 呼 。 最 初
Ｗ ａ ｉ ｎｓ ８将 兔 ＭＳ ｓ ５ ｋｔ ｉ 等 ａ Ｃ 用 一氮 胞 苷诱 导后 ， 产 生 含 多 个 长 核 的 肌 管 的 细 胞 。 Ｆ ｒａｉ ｅｒｒ 等 将 表 达 转 入
了 ８ ａａｔｓ ａｅ基 因 的 Ｍ Ｓ ｓ植 入 已 注 射 心 肌 毒 素 一ｇ ｌｃｏｉ ｓ ｄ Ｃ
首 次 用 硫 代 甘 油 和＿ 参 注 射 液 诱 导 人 ＭＳ ｓ分 化 为 神 ＿ 丹 Ｃ 经 元样 细 胞 ， 达 神 经 元 特 异 性 烯 醇 化 酶 、 经 丝 蛋 白 表 神
大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)的分离、鉴定与培养
大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定材料试剂(一)主要设备和产地1.手术器械上海手术器械厂2.台式水平离心机Eppendorf，5810R德国3.Nanopure超纯水仪日本SANYO公司4.AA一200型电子天平美国Denver Instrumol/Lent公司5.低温高速离心机ThermoForma公司6.90一2型磁力搅拌器上海沪西分析仪器厂7.电动匀速垂直转轮上海沪西分析仪器厂8.微量移液枪德国Eppendorf公司9.烧杯、容量瓶上海实生公司10.全自动酶标光度仪美国Bio-Rad公司11.6cm/10cm细胞培养皿美国Conring12.2mL冻存管、细胞冷冻储存器美国Conring13.低温高速离心机ThermoForma公司产品14.YJ-875超净工作台苏州工业园区三兴净化科技有限公司15.C02培养箱3111型美国Thermo Forma公司16.CK40-F200型倒置显微镜日本Olympus公司17.10ml注射器美国BD公司(二)试剂和材料1.谷氨酰胺(L-Glutamine)美国Hyclone公司2.75%消毒酒精上海生工3.肝素美国sigma公司4.胰蛋白酶美国Amresco公司5.胎牛血清美国Gibco公司6.α-MEM培养液美国Hyclone公司7.5-6周龄SD大鼠上海斯莱克实验动物有限公司8.Percoll细胞分离液美国GE公司9.DMSO(细胞培养级)美国Sigma公司Rat BMSC的分离与培养分离颈椎脱臼法处死大鼠，75%酒精中浸泡5分钟，超级工作台内依次取下大鼠两条胫骨及两条股骨。
用手术器械将长骨上附着的肌肉组织尽量去除干净，整个过程保持无菌。
用剪刀剪去长骨两端，10ml注射器吸取加入肝素的完全培养液（10%FBSα-MEM），从长骨一端开口处注入，将骨髓腔内的细胞出入到50ml离心管内，直至长骨冲洗的发白，认为骨髓腔内的细胞都被吹入离心管内。
骨髓间充质干细胞成软骨分化机制研究进展
骨髓间充质干细胞成软骨分化机制研究进展张佳瑶同济大学口腔医学院·同济大学附属口腔医院修复科，上海牙组织修复与再生工程技术研究中心 200072刘玛丽浙江杭州师范大学 310000摘要：近年来，随着我国科技实力的不断增强，骨组织工程飞速发展，为骨修复带来了全新的期盼。
骨髓间充质干细胞是骨组织工程中的种子细胞，通过诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞能够有效治疗骨关节炎、软骨缺损等疾病，由于骨髓间充质干细胞在分化过程中不仅涉及众多信号通路，并且还会受到蛋白质、药物、RNA以及基因等多种因素的影响，因此，为进一步提升骨髓间充质干细胞在科学研究和临床中的应用效果，本篇文章将依据国内外的相关研究，对骨髓间充质干细胞成软骨分化机制的研究进展展开综述。
关键词：骨髓间充质干细胞；软骨细胞；分化机制引言：骨髓间充质干细胞是一种尚未分化充分的类中胚层细胞，具有多向分化潜能，能够在特定的条件下分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞以及神经元等[1-5]。
由于骨髓间充质干细胞取材方便、对身体损伤小并免疫原性相对较低，所以，它在组织工程学中的应用非常广泛，是骨组织工程中不可或缺的种子细胞。
近年来，随着我国人口老龄化的加剧，软骨病变、骨关节炎等疾病的发病率显著提升，对广大老年人群的机体健康和日常生活造成了严重的影响。
软骨组织主要由细胞外基质和软骨细胞共同组成，属于一种结缔组织，由于该组织内缺少血管和神经支配，一般无法自我再生，再加之软骨细胞的增殖能力也非常薄弱，所以，软骨损伤通常无法自我修复，如何有效治疗软骨相关疾病一直深受医学界的关注。
随着骨组织工程的高速发展，诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化在治疗软骨病变、骨关节炎等疾病中的优势作用日益凸显，但是，由于骨髓间充质干细胞成软骨在分化过程中很容易因发生肥大变性而生成纤维软骨，从而导致治疗陷入中断或者失败，故此，总结分析骨髓间充质干细胞成软骨分化机制的研究进展对于相关科学研究及临床治疗具有重要意义[6-10]。
四种骨细胞的功能
四种骨细胞的功能骨细胞是构成骨组织的主要细胞类型，主要包括成骨细胞（osteoblasts）、骨吸收细胞（osteoclasts）、骨上皮细胞（osteocytes）和骨髓间充质细胞（bone marrow stromal cells）。
每种骨细胞在骨体内具有不同的功能和特点。
1. 成骨细胞（osteoblasts）成骨细胞是骨骼生长和修复的关键细胞，它们负责合成和沉积由胶原蛋白构成的骨基质，并沉积骨矿盐，使骨组织增强和变硬。
成骨细胞是由骨髓间充质干细胞分化而来，这个过程被称为骨形成。
成骨细胞主要分布在骨组织的表面，它们形成连续的骨半管，沿着已有的骨表面或软骨基质分泌骨基质，逐渐转变为骨细胞。
2. 骨吸收细胞（osteoclasts）骨吸收细胞是用于骨重塑和骨代谢的多核骨细胞，主要由骨髓中的单核细胞与单核细胞前体细胞融合而成。
它们富含酸性小胞和酶，能够分泌酸和蛋白酶，以溶解骨基质中的无机盐和胶原蛋白。
通过破坏和溶解骨组织，骨吸收细胞能够调节骨钙平衡、维持骨密度并参与骨修复过程。
3. 骨上皮细胞（osteocytes）骨上皮细胞是骨细胞的成熟形态，每个骨小管内的一个空腔中包含一个骨上皮细胞。
它们通过树突与周围的骨细胞相连接，形成骨细胞系统。
骨上皮细胞能够通过树突与周围的细胞相互沟通，参与和调节骨代谢和骨生长过程。
它们可以感知压力、应变和电刺激，从而调控骨质状况和骨力学性能。
4. 骨髓间充质细胞（bone marrow stromal cells）骨髓间充质细胞是存在于骨髓中的多能干细胞，它们能够不仅分化为成骨细胞，还可以分化为成脂细胞（adipocytes）、软骨细胞（chondrocytes）和骨髓肿瘤细胞等。
骨髓间充质细胞在骨骼建设和修复中起着重要的作用，能够分泌生长因子和细胞外基质来调节细胞增殖和分化，促进骨形成和修复。
总结起来，四种骨细胞在骨组织的形成、修复和代谢过程中发挥着不可或缺的作用。
成体干细胞(间充质干细胞,造血干细胞)ppt课件
造血干细胞的微环境
骨髓微环境中的一些转录因子和蛋白分子对 造血干细胞的移行、增殖和分化起了调控作用。
干细胞因子
与干细胞表面的 C-kit 受体结合 GATA-2对造血前体细胞的增殖与存活是关键的 加强细胞的粘附作用 GATA-1调节红系、巨核细胞等的存活、增殖 参与维持干细胞数目的恒定 和成熟
PU1的表达可促使造血干细胞子代前体细胞进 一步分化产生淋巴系， 而且间充质干细胞相对容易在体外被诱导 分化为成骨细胞和软骨细胞，所以间充质 干细胞在骨损伤，先天骨组织畸形的治疗 方面将有广泛的应用。
间充质干细胞
间充质干细胞的来源
来源于发育早期的中胚层 和外胚层。 MSC最初在骨髓中发现。
具有多向分化潜能，理想
的种子细胞。
间充质干细胞的形态
在个体出生后， 间充质干细胞附于 骨髓窦的内腔面， 形成一种包埋于窦 状网络中的三维细 胞网络。
光学显微镜
扫描电镜
间充质干细胞的表面标志
SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、 CD106、CD120a、及CD124等
成体干细胞的概念
存在于成年个体的许多组织和器官
特点
修复 再生 自我更新
使组织和器官保持生长和衰退的 动态平衡。
成体干细胞的可塑性
成体干细胞可以突破其 “发育限制性”，跨系， 甚至跨胚层分化为其他类 型组织细胞
造血干细胞起源
（hemopoietic stem cell,HSC）是存 在于造血组织中的一群原始造血细 胞，它不是组织固定细胞，可存在 于造血组织及血液中。造血干细胞 在人胚胎2周时可出现于卵黄囊， 第4周开始转移至胚肝，妊娠5个月 后，骨髓开始造血，出生后骨髓成 为干细胞的主要来源。在造血组织 中，所占比例甚少，如在小鼠骨髓 中105核细胞中的有10个，在脾中 105有核细胞中只有0.2个。