结核分枝杆菌及其耐药基因的特征
系统细菌学
课程论文
题目：结核分枝杆菌及其耐药基因的特征
专业：生物工程
姓名：魏文凭
学号：2016304120036
中国·武汉
二0一六年十二月
结核分枝杆菌及其耐药基因的特征
摘要：分枝杆菌属主要包括结核分枝杆菌复合群（包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌）、麻风分枝杆菌和非结核分枝杆菌。造成人畜共患病的结核分枝杆菌和引起麻风病的麻风分枝杆菌是威胁人类健康的两类病原菌，而非结核分枝杆菌病疫情也逐年增加。因此关注分枝杆菌具有重要的科学意义及应用价值，对农业、卫生和环境都用深远影响。本文主要介绍分枝杆菌的特征和一些耐药基因的研究。
关键词：耐药机制 结核病 生物学特征
1、 结核病的认识及治疗发展
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tuberculosis）是全球第二大致死性传染病—结核病的病原体。结核分枝杆菌最大的特点就是持留性（persistence）[1]，有时感染可达几十年，因此全球约有三分之一的人口感染结核分枝杆菌，其中每年死于结核病的人数高达180万（World Health Organization.
2016）。中国是结核病高发的国家，已被世界卫生组织列为全球22个结核病高负担和特别警示的高耐药国家之一。
结核病很早就存在，在考古学界，从新石器时代人遗骨中发现有骨结核，古埃及木乃伊中也发现有结核病，说明结核病的历史可追溯到公元前2400-3400年。在中国历史上，结核病也是广泛流行的，当时称为痨病，是一种慢性呼吸道疾病，在认识到它的致病菌之前，人们没有治疗的手段，只能通过环境的影响，在空气清新、气候湿润的地域抑制结核病的发作。在1882年，德国微生物学家罗伯特·科赫（Robert Koch）通过特殊的染色技术，发现了细棒状的结核杆菌，又通过血清培养基获得了结核杆菌，证实了结核杆菌是结核病的病原菌。自此对结核病有了清晰的认识，对于结核病的检测技术也不断发展。法国科学家卡尔梅特（Calmette）和格林（Guerin）在1908年和1919年间，经过230次的传代，获得了一株牛分枝杆菌减毒株，卡介苗[2]。自1921年首次使用以来，成为有效治疗儿童结核病的疫苗，但对于成人型结核病的的治疗很有限。到了上世纪中期以来，临床上又应用了一些抗结核的药物，如异烟肼（INH）、利福平（RIF）、
链霉素（SM）、吡嗪酰胺（PZA）等，使得结核病的防治得到了有效控制。但到了90年代，耐多药菌和广泛耐药菌的发现，以及世人对结核病防治的放松导致该病大有席卷重来之势。因此对结核分枝杆菌疗效确切、治疗周期短、安全性高的疫苗的研发迫在眉睫。
2、结核分枝杆菌的特点
2.1 细胞结构特点
结核分枝杆菌是一种胞内菌，属于放线菌，传统革兰氏染色效果不明显，因为其细胞壁含有分枝菌酸，抗酸性染色为阳性。分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，大小为1-4×0.4μm，无鞭毛，无芽孢，不能产生内外毒素，需要特殊的培养基进行培养，生长极度缓慢，菌体成分为糖类、脂质、蛋白质等。科学工作者研究一般选择耻垢分枝杆菌，它是分枝杆菌的模式生物，具有快速生长无致病性的优点[3]。
分枝杆菌具有大量的脂质，占菌体重量的20%—40%，胞壁中含量最多。几乎没有其他生物能像结核杆菌这样产生如此多的脂溶性分子，多项研究表明细菌的毒力与其所含的脂质分子有关，尤其是糖类[3]。脂质可防止菌体水分丢失，因此结核杆菌对干燥的抵抗力特别强。对酸（3% HCl或6% H2SO4）或碱（4%
NaOH）有抵抗力，15min内不受影响。对多种抗生素敏感，但长期使用易引起耐药性，而且耐药基因能够遗传。
结核分枝杆菌能侵染机体的任何组织、器官，其生长极度好氧，肺部感染是最主要的致病方式，目前研究发现其毒力因子很多，包括索状因子、脂阿拉伯甘露聚糖、分泌蛋白、代谢相关因子、转录因子、双组份调节系统、分泌系统和应激蛋白等[4]。从分子生物学角度来看，对毒力基因的了解知之甚少。研究较多的是：编码毒素-抗毒素系统的基因，控制细胞的程序性死亡以应对环境压力[5]。编码sigma因子的基因，通过与whiB3相互作用而活化相关基因的表达[6]。编码过氧化氢酶的基因应对低氧胁迫及对抗宿主巨噬细胞的活性氧[7]。Lam，KatG对细菌在巨噬细胞中的生存起作用[8]。
2.2 基因组和比较基因组特点
M.tuberculosis H37Rv全基因序列图于1998年由英国和法国科学家联合完成，2001年临床分离株CDC1551的全基因组测序完成，标志着分枝杆菌的研究进入
到后基因组时代。对基因组的注释及分析成为当务之急，近些年来，全球组学的研究取得了巨大进展，为分枝杆菌的诊断、进化、靶标提供了良好的基础。H37Rv全基因组由4411529bp组成，包括4000多个基因，已发现4005个ORFs[9]。其基因组有几个重要的特征，G+C 含量相对稳定，高达65.6%；起始密码子中有35%是GTG，远远高于枯草杆菌的9%和大肠杆菌的14%，这造成结核菌高G+C偏向；有明确功能的基因大概有2441个，不含插入序列的假基因有6个，仍有600多个基因不知其功能[10]。值得注意的是其有相当多的基因编码参与到脂肪代谢的酶类中，有10%的基因编码PE和PPE蛋白家族，这是分枝杆菌特有的重复序列基因，而其功能仍未知，不过根据已有的研究表明，它们在免疫学方面有重要作用[9]。
近年来，有人通过芯片技术来比较不同分枝杆菌菌株的基因组差异。在无毒性的耻垢分枝杆菌中，mutY和mutM在维持耻垢非致病性起作用，另外耻垢通过半胱氨酸天冬酰胺酶依赖途径来诱导宿主细胞凋亡，相比结核杆菌，非致病菌能诱导机体产生更强的天然免疫应答[11]。在结核分枝杆菌特有的129个开放阅读框中（ORF），指出有39个ORF在卡介苗BCG中缺失（主要存在3个RD区域），29个在部分BCG菌株中缺失[3]。这些H37Rv特有的ORF在无毒株中缺失，表明这些基因可能是代表了毒性因子编码基因，也可能是结核分枝杆菌保护性抗原编码基因[12]。
3、结核分枝杆菌的致病机理
结核分枝杆菌在长期的宿主-细菌相互作用过程中，形成了自身独特的生活习性，使其能够适应宿主的免疫系统[13]。在感染宿主后机体会调动自身免疫防御系统来抵御外来入侵者，巨噬细胞在其中起重要作用。巨噬细胞是人体抵御外界压力的第一道天然免疫屏障，在巨噬细胞感染后会利用吞噬溶酶体来降解细菌，并和树突状细胞一起引起宿主的一系列信号传导导致感染的细胞死亡[14]。结核分枝杆菌通过调控相关蛋白的表达使其能够在宿主中存活几十年，和宿主达到一种平衡[15]。
在成熟的吞噬溶酶体内，会由细胞氧化酶和诱导性氮氧化物合酶生成大量的活性氧，从而杀死病原菌。而分枝杆菌则通过分泌GroEL2蛋白与巨噬细胞发生相互作用，影响巨噬细胞的识别与吸附[16]。通过也会阻止吞噬溶酶体的形成和
酸化，抑制自噬的形成，从而维持分枝杆菌的蛋白活性[17]。分枝杆菌在低氧的环境中会进行休眠，并合成大量的交叉连结肽聚糖维持自身的生存，PhoP等双组份调控系统对于应对低氧胁迫有重要作用[18]。DosR蛋白与分枝杆菌的潜伏感染息息相关，DosR能调控约50个快速响应的基因，起到应对低氧环境紧急措施的目的；在低氧处理一段时间后，受到调节的基因达到几百个。显然这些持久性低氧胁迫基因与结核分枝杆菌的潜伏持留感染有关[19]。
4、结核分枝杆菌中的耐药基因
结核分枝杆菌在抗结核药物研发出来时，有很好的治疗效果，但由于结核杆菌耐药机制的形成，造成药物的长期使用疗效急速下降。而目前结核杆菌的耐药机制仍未完全了解清楚。近几十年的研究表明药物作用的靶标的改变是大部分结核杆菌产生耐药的主要原因，但也包括细菌的药物外排泵机制、细胞膜通透性的改变等[20, 21]。
结核杆菌耐INH的原因很多，涉及到katG、NADH脱氢酶基因ndh、烯酰基载体蛋白还原酶基因ihhA、酮酰基酰基转移蛋白酶基因kasA以及烷基过氧化氢酶基因ahpC等。其中主要的是katG的突变，katG编码过氧化氢-过氧化物酶，该酶能将INH氧化成异烟酸，成为烟酸的类似物，从而抑制细胞壁枝菌酸的合成[22, 23]。
利福平的作用是通过与结核杆菌RNA聚合酶的β亚单位结合，干扰转录的开始和RNA的延伸。若β亚单位突变，则阻止利福平的结合，造成耐药；而细胞壁结构的改变则会导致药物的摄入减少，这种情况在鸟分枝杆菌复合群中有发现；因此两种可能都不能排除[24]。
链霉素是第一种有效的抗结合药物，目前在没有新药出现的情况下仍是结核病治疗的一线药物。它是一种氨基环醇糖苷类抗生素，通过干扰蛋白质的合成而发挥作用。编码核糖体蛋白S12基因和16S rRNA基因的突变是目前认为耐SM的的原因，但具体机制不完全清楚[21]。
吡嗪酰胺是一种烟酰胺类似物，PZA渗透入吞噬细胞后并进入结核杆菌菌体内，菌体内的酰胺酶使其脱去酰胺基，转化为吡嗪酸而发挥抗菌作用。pncA基因突变导致吡嗪酰胺酶活性下降或丧失，严重影响酶的功能。在耐PZA的一部分分离株中，发现pncA基因并未突变，说明还有其他的耐药机制[25]。
5、小结
耐多药菌和广泛耐药菌的出现以及未有新的抗结核药上市的情况下，人类正面临着结核分枝杆菌的严重威胁，对抗结核药物的新靶点的发现、全新抗结核药物机制的筛选，以及结核治疗靶向给药系统等的研究将为人类有效控制结核病奠定了基础。
参考文献
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扬州市结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变分析
扬州市结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变分析
摘要】目的：了解本地区结核分枝杆菌异烟肼耐药基因katG和inhA的突变特征。方法：利用基因芯片检测505例经鉴定为结核分枝杆菌的菌株异烟肼耐药基因，分析本地区katG和inhA基因突变特征。结果：katG基因315位点突变频率为79%（83/105），inhA -15位点突变频率为22.9（24/105），其中katG基因315位点联合inhA -15位点突变频率为2%（2/105）。结论：本地区MTB对异烟肼耐药基因突变中katG 315（AGC→ACC）为最主要突变类型，inhA-15（C→T）次之。
【关键词】结核分枝杆菌；异烟肼；基因突变
【中图分类号】R378.911 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）30-0313-02
异烟肼（INH）对结核分枝杆菌（MTB）具有较强的杀菌作用，是治疗结核病重要的一线药物。近些年，INH的耐药率逐渐上升，全国抽样调查显示我国INH耐药率已达17.6%，属高耐药国家。
INH的耐药主要是由于基因突变造成，主要跟下列基因改变有关：过氧化氢一过氧化物酶基因katG、烯酸基载体蛋自还原酶基因inhA、NADH脱氢酶基因ndh、酮酸基酸基转移蛋自酶基因kasA、烷基过氧化氢酶基因ah-pC等[1]。本研究利用基因芯片技术对扬州地区结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变位点特征进行了分析，现报道如下。
1.资料与方法
1.1 一般资料
收集我院2017年经传统固体培养，并经鉴定为结核分枝杆菌的菌株共505例。
1.2 仪器与试剂
仪器：基因芯片检测配套仪器由北京博奥生物有限公司提供。试剂：传统培养和鉴定试剂由珠海贝索生物有限公司提供，基因芯片试剂由北京博奥生物有限公司提供。基因芯片检测katG基因315（AGC→ACC、AGC→AAC）和inhA -15（C→T） 3个突变位点。
武汉地区结核分枝杆菌临床分离株乙胺丁醇耐药分子特征研究
第３２卷第３期 ２０１３年９月 武汉工业学院学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｗｕｈａｎ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｖ０１．３２Ｎｏ．３ Ｓｅｐ．２０１３
文章编号：１００９－４８８１（２０１３）０３－００１３－０５
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９－４８８１．２０１３．０３．００４
武汉地区结核分枝杆菌临床分离株
乙胺丁醇耐药分子特征研究
丁冰冰 ，马峻 ，陈高瞻 ，刘志国 ，李睿 ，胡申才 ，郭利 ，余晓丽。，张舒
（１．武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉４３００２３；２．武汉市医疗救治中心检验科，湖北武汉４３００３２； ３．武汉轻工大学校医院，湖北武汉４３００２３；４．上海交通大学基础医学院病原生物学教研室，上海２０００２５）
摘要：探讨武汉地区结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药基因ｅｍｂＢ的分子特征，为深入研究结核分
枝杆菌乙胺丁醇（ＥＭＢ）耐药分子机制、快速检测技术的建立和个体化临床用药奠定基础；同 时探索武汉地区“北京基因型”菌株的传播类型，为结核防控提供参考。收集８５株临床分离 株，采用ＰＣＲ直接测序法分析ｅｍｂＢ基因的突变特征；采用ＲＤ１０５基因缺失检测法鉴定８５株
分离株中“北京基因型”菌株。结果显示２２例ＥＭＢ耐药株中，１５（６８．２％）例在ｅｍｂＢ基因检 测到突变，其中１４例为３０６位点突变，突变类型为Ｍ３０６Ｖ ＡＴＧ ＧＴＧ和Ｍ３０６Ｉ ＡＴＧ ＡＴＡ，１
例为３１９位点突变，突变类型为Ｙ３１９Ｃ ＴＡＴ＿＋ＴＧＴ；同时，在６３例ＥＭＢ敏感株中也检测到了５ 株（７．９％）发生了ｅｍｂＢ基因突变，其中４例在３０６位点，１例在３１９位点。８５例临床分离株中
７８株为“北京基因型“菌株，占全部茵株的９１．８％，非“北京基因型”菌株有７株，占８．２％。研 究表明ｅｍｂＢ３０６位点突变不仅在乙胺丁醇耐药菌株中，而且在乙胺丁醇敏感菌株中也能检测
到。由于乙胺丁醇耐药菌株同时还耐其他药物，故不能排除其他药物与ｅｍｂＢ３０６位点突变的 关系，因此ｅｍｂＢ３０６位点突变与结核分枝杆菌耐药的相关性有待深入探讨。本研究发现武汉 地区结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药株中ｅｍｂＢ基因突变类型并不存在地域差异，而在敏感株中
青岛地区左氧氟沙星耐药结核分枝杆菌gyrA基因突变特征分析
山东医药２０１３年第５３卷第４４期
青岛地区左氧氟沙星耐药结核分枝杆菌
ｇｙｒＡ基因突变特征分析
邹悦，王军，苏海涛 （青岛市胸科医院，山东青岛２６６０４３）
摘要：目的分析青岛地区左氧氟沙星耐药结核分枝杆菌ｇｙｒＡ基因突变特征。方法ＤＮＡ测序法收集来自 青岛地区４６株左氧氟沙星耐药的结核分枝杆菌和１４株左氧氟沙星敏感的结核分枝杆菌，应用ＰＣＲ—ＤＮＡ测疗法 对其ｇｙｒＡ基因片段（包含９０—９４位点）进行分析。结果１４株左氧氟沙星敏感菌株中均未发生ｇｙｒＡ基因９０—９４ 位点突变；４６株左氧氟沙星耐药菌株中有４２株发生了ｇｙｒＡ基因９０～９４位点突变，突变率为９１．３０％（４２／４６），９０ 位点突变率２１．７４％（１０／４６），９１位点突变率８．７０％（４／４６），９４位点突变率４７．８３％（２２／４６），９０位点与９４位点联 合突变率１３．０５％（６／４６）。结论青岛地区左氧氟沙星耐药结核分枝杆菌ｇｙｒＡ基因中９０—９４位点突变对，其中 以９４位点突变为主。 关键词：分枝杆菌，结核；左氧氟沙星；突变；青岛 ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２—２６６Ｘ．２０１３．４４．０１５ 中图分类号：Ｒ９７８．３ 文献标志码：Ｂ 文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１３）４４—００４２￣３
近年来，由于氟喹诺酮类药物的滥用，结核分枝 杆菌对其的耐药程度越来越严重，严重影响氟喹诺 酮类药物在耐药结核病中的治疗效果…。结核分
枝杆菌耐氟喹诺酮类药物主要是ｇｙｒＡ基因突变所
致，且多位于氟喹诺酮耐药决定区（ＱＲＤＲ），其中尤 以９０～９４位点的突变最为多见。本研究对青岛地
区左氧氟沙星耐药结核分枝杆菌的ｇｙｒＡ基因突变 特征进行分析。现报告如下。
１材料与方法 １．１材料 １．１．１菌株来源６Ｏ株结核分枝杆菌临床分离株 均来源于２００９年１月～２０１２年１２月青岛市胸科医
院确诊的肺结核患者痰标本，其中左氧氟沙星敏感
结核分枝杆菌的耐药性及检测方法
结核分枝杆菌的耐药性及检测方法
结核病是一种由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的慢性传染病，主要累及肺部，但也可侵犯其他器官。然而，近年来出现了结核分枝杆菌对抗生素的耐药性问题，给结核病的防治带来了巨大挑战。本文将就结核分枝杆菌的耐药性机制以及常用的检测方法进行论述。
一、耐药性机制
1.多重耐药（MDR）
多重耐药是指结核分枝杆菌对两种最主要的抗结核药物——异烟肼和利福平同时产生耐药现象。这种耐药形式使得传统治疗手段无法有效控制感染，并且增加了传播风险。
2.延迟耐药（XDR）
延迟耐药是在MDR基础上，又产生对氟喹诺酮类等二线抗结核药物的耐药性。这使得治疗选择更加有限，且通常需要使用更昂贵和毒副作用更大的抗结核药物。
3.全耐药（TDR）
全耐药是指对所有一线和二线抗结核药物都产生耐药现象，这种情况下仅能依靠其他的药物才能进行治疗。然而，这些替代治疗方案费用昂贵且可行性有限。
二、检测方法
1.传统的抗生素敏感性测试
传统的抗生素敏感性试验使用培养分枝杆菌，并将其接种于含有抗生素的琼脂平板上。通过观察细菌在不同浓度抗生素下的生长情况来判断其对该抗生素是否具有耐药性。尽管这种方法简单易行，但其确诊时间较长，且容易出现误判。 2.分子检测方法
随着分子生物学技术的进步，利用PCR技术可以更快速地检测结核分枝杆菌的耐药基因突变。这种方法通过检测与耐药性相关基因序列的存在与否来确定细菌对特定抗生素是否具有耐药性。由于PCR技术高灵敏度和高特异性，它已成为常用的结核分枝杆菌耐药性检测方法之一。
3.流式细胞术
流式细胞术利用荧光标记的结核分枝杆菌单个细胞对特定抗生素的反应进行测定。通过测量细胞内荧光信号的变化来判断其对抗生素是否产生了耐药性。这种方法具有高通量和快速的优势，但需要对样本进行前期处理以获得单个菌落。
4.质谱法
质谱法利用MALDI-TOF质谱仪检测结核菌代谢产物图谱与数据库匹配，从而快速确定结核分枝杆菌的耐药类型。这是一种新兴的方法，有望成为检测结核分枝杆菌耐药性的有效手段。
结核分枝杆菌形态染色特点
结核分枝杆菌形态染色特点
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是一种革兰氏阳性、抗酸染色阳性的细菌，是引起人类结核病的主要病原体。在形态和染色特点方面，结核分枝杆菌具有以下特征：
1. 形态特点：结核分枝杆菌呈细长、略弯曲的杆状，有时呈Y字形或V字形。菌体长度为0.2-0.6微米，直径为0.05-0.2微米。菌体表面光滑，无鞭毛、荚膜和芽孢。在固体培养基上，结核分枝杆菌可形成黄色、干燥、不透明、边缘不规则的结节状菌落。
2. 染色特点：结核分枝杆菌对多种染料具有抗酸性，因此常用抗酸染色法进行染色。常用的抗酸染色方法有齐尔-尼尔逊（Ziehl-Neelsen）染色法和金胺O（Auramine O）染色法。在这两种染色方法中，结核分枝杆菌均呈现红色，与其他细菌的蓝色或绿色背景形成鲜明对比。
3. 细胞壁结构：结核分枝杆菌的细胞壁较厚，主要由肽聚糖、脂肪酸、磷脂和蛋白质组成。其中，肽聚糖层由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸交替连接而成，具有高度分支的特点。这种分支结构使得结核分枝杆菌具有较强的抵抗外界压力的能力。
4. 生长特性：结核分枝杆菌生长缓慢，需要较长时间才能在固体培养基上形成可见的菌落。在液体培养基中，结核分枝杆菌以球形、棒状或螺旋状的形式存在。此外，结核分枝杆菌对营养要求较高，需要丰富的碳水化合物、氨基酸和维生素等营养物质才能正常生长。
5. 耐药性：结核分枝杆菌具有一定的耐药性，尤其是在长期使用抗结核药物治疗的情况下。耐药性的产生与菌体内的突变、基因重组和外源性基因的引入等多种因素有关。为了克服耐药性问题，临床治疗中常采用联合用药的方法，以提高治疗效果。
异烟肼耐药结核分支杆菌katG基因分析
异烟肼耐药结核分支杆菌katG基因分析
黄海南;韩金祥;王进鸿;高雪芹;鲁艳芹
【期刊名称】《中华微生物学和免疫学杂志》
【年(卷),期】2003(023)006
【摘 要】@@ 结核分支杆菌(M tuberculosis, TB)的katG基因是位于细菌染色体上的结构基因,全长2223bp,它的编码产物是过氧化氢-过氧化物酶,而后者在维系异烟肼(Isoniazid, INH)杀菌毒性中,发挥重要作用.因此,katG基因结构的正确性是编码产生功能正常的过氧化氢-过氧化物酶的先决条件,也是发挥INH特有的药理作用的重要基础.通过检测katG基因的分子结构,尤其是检测某些关键位点的碱基突变,可以快速发现TB对INH耐药的变异情况,对及时的指导临床用药,具有重要的意义.
【总页数】1页(P441)
【作 者】黄海南;韩金祥;王进鸿;高雪芹;鲁艳芹
【作者单位】山东省医药生物技术研究中心;山东省医药生物技术研究中心;山东省胸科医院;山东省医药生物技术研究中心;山东省医药生物技术研究中心
【正文语种】中 文
【中图分类】R37
【相关文献】
1.吉林省耐多药结核分枝杆菌异烟肼耐药基因KatG突变特征分析2.武汉地区耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株katG基因突变的分子特征分析3.痰中耐药结核分枝杆菌katG基因的快速检测及异烟肼耐药机制研究4.牛结核分支杆菌临床分离株rpsL,rpoB,KatG基因突变分析5.等位特异PCR检测结核分支杆菌耐异烟肼基因katG突变研究
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Xpert MTBRIF对结核菌利福平耐药的诊断价值及rpoB基因突变特点的分析
临床肺科杂志2221年5月 第26卷第5期723
Xperi MTB/RIF对结核菌利福平耐药的诊断价值及
rpoB基因突变特点的分析
高春景杨洋阚宗卫成松魏素梅胡凯
【摘要】目的 分析
Xpert MTB/RIL检测对结核分枝杆菌利福平耐药的诊断价值及
rpoB基因突变特
点。方法 回顾分析
2012年、
月至
2022年
2月期间来院就诊患者相同标本，同时进行了结核分枝杆菌培养
及药敏试验和
Xpert MTB/RIL检测，且任一种方法检出
MTB。结果 用
Xpert MTB/RIL及培养药敏两种方法
检测标本共
7659例,
Xpert MTB/RIL对
MTB的检出率高，且有统计学意义
(P<2 45)。两种方法同时检出
MTB 3271例,
Xpert MTB/RIL检出利福平耐药
262例，培养药敏检出利福平耐药
238例;两种方法检测利福平
耐药的一致率为
99. 41% ;采用
Kappa检验，两种方法的检测结果完全符合。
RR-DB探针突变的频率为
E探
针
63. 37%、
D探针
20. 07%、
B探针
& 03%、
A探针
4. 53%、
C探针
2 80%、联合探针突变
2. 88% ；以培养药敏
结果为利福平耐药的金标准,
Xpert无探针突变组利福平耐药的准确性要明显低于有探针突变组;初治和复治
病例探针突变频率差异有统计学意义。结论
Xpert MTB/RIL检测可以快速有效的诊断利福平耐药结核，有
助于早发现、早治疗。利福平耐药结核探针突变主要发生在
E探针和
D探针,
C探针突变最少。
【关键词】 结核分枝杆菌;
Xpert MTB/RIL；耐药;
rpod突变
Diaanostic value of Xpert MTB/RIF assty t PUmpicin resistancc of Mycybacterinm thbercylosit and analy-
sit of rpoB geee mutation chal'actePshct
131株结核分枝杆菌耐药性分析
预防医学２００８年第２ｏ卷第６期２］ａｅｉｉａｎｇ Ｐｒｅｖ Ｍｅｄ，Ｊｕｎｅ ２００８，Ｖｏｌ ２０，Ｎｏ．６
１３ １株结核分枝杆菌耐药性分析
周庆沈小英方孝美
中图分类号：Ｒ３７８．９１ 文献标识码ｉ Ｂ 文章编号：１００７－０９３１（２．００８）０６—００２３－０２
结核病是目前严重威胁人类健康的重大传染性疾病之
一＿】Ｊ，但只要早期诊断和合理用药，绝大多数的结核病人
可以治愈。多年来，化学疗法在控制结核病的流行上发挥
着巨大的作用，使约９ｏ％以上的初治肺结核病人获得治愈。
但是由于抗结核化学药物的广泛应用，特别是在治疗过程
中不规定用药，导致出现耐药结核分枝杆菌，尤其是多重
耐药结核分枝杆菌，造成目前结核病疫情有所回升，成为
结核病疫情较难控制的一个重要原因。２００４～２００５年对来
我院进行治疗的痰涂片阳性肺结核病人分离的结核分枝杆
菌进行耐药性检测，现将结果报告如下。
材料与方法
１标本来源２００４～２００５年在海盐县人民医院就诊的所有
痰涂片阳性的肺结核病人，痰培养获取菌株。
２药敏试验采用绝对浓度法进行检测，凡培养阳性菌株
进行４种抗结核药：异烟肼（Ｈ）、利福平（Ｒ）、链霉素
（ｓ）、乙胺丁醇（Ｅ）耐药性测试。培养基的药物浓度分别
为异烟肼高浓度１０ｐ．ｇ／ｍｌ，低浓度ｌｔ，ｇ／ｍｌ；利福平高浓度
２５０ｔ，ｅ，／ｍｌ，低浓度５０ｔ，．ｇ／ｍｌ；链霉素高浓度１００ｔ，．ｇ／ｍｌ，低浓
度１０ｔａｇ／ｍｌ；乙胺丁醇高浓度５０ｔ，ｅ，／ｍｌ，低浓度５ｔ，ｅ，／ｍｌ。严
格按ＷＨＯ／ＩＵＡＴＬＤ耐药检测指南［ 】进行。
３耐药判定标准含高、低浓度药物培养基均不生长，对
照管生长＞１０个菌落为敏感（ｓ），含高浓度药物培养基不
生长（菌落数为零）、低浓度培养其生长（菌落数≥Ｉ）为
中介（工）；含高、低浓度药物培养基均生长为耐药（Ｒ）。
Ｈ、Ｒ、Ｓ、Ｅ用同一标准。耐药基因实时ＰＥＲ检测试剂购自
结核分枝杆菌耐异烟肼相关基因及其突变的研究进展
结核分枝杆菌耐异烟肼相关基因及其突变的研究进展
摘要】 本文就报道的结核分枝杆菌耐异烟肼相关基因katG、inhA、ahpC、kasA、ndh、OxyR-ahpC、mabA-inhA、furA-katG、fabG-inhA、efpA、ini (A,B,C)及其突变位点进行综述。
【关键词】结核分枝杆菌 异烟肼 耐药 基因 突变
结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的慢性传染病。随着耐药结核病，尤其是耐多药和广泛耐药结核病的出现，给结核病的防控工作带来了严峻挑战。异烟肼是治疗结核病主要药物之一，但MTB耐异烟肼率已达17.6%，其耐药机制尚不明确，大多认为与MTB相关基因突变有关[1]。本文综述目前国内外报道的MTB耐异烟肼相关基因及其常见突变位点，以进一步了解MTB耐异烟肼的发生机制。
1 katG基因
异烟肼经MTB katG基因编码的过氧化氢-过氧化物酶活化后产生杀菌作用，katG突变使过氧化氢-过氧化物酶失活，导致MTB对异烟肼耐药。KatG最常见突变位点是Ser315Thr。Khadka JB等研究尼泊尔地区107例耐异烟肼菌株中，Ser315Thr及Ser315Ile突变率分别为77.6%及17.1%。 陈玲等研究显示Ser315Thr突变频率为66.7%[2]。315位点还有Ser→Asn、Ser→Thr、Ser→Arg和Ser→Gly突变形式。此外，还存在Val230Met、Pro232Gln、Gly237Glu、Gly309Cys、Asp304Glu、Asp357His、Asp357Asn、Arg463Leu、His276Met、Gln295His、Glu454Arg等突变[2-5]。
2 inhA基因
inhA基因编码NADH依赖的enoyl-Acp还原酶，该酶催化α-不饱和脂肪酸转化为饱和脂肪酸，产生的长链脂肪酸是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分。异烟肼与分枝菌酸合成途径中的NADH依赖的enoyl-Acp复合体结合，阻断90%以上长链脂肪酸合成，从而抑制MTB生长。inhA基因常见突变位点C-15T，该位点与katG联合突变占76%。除C-15T外，还有Gly5Ser、Glu7Ala、Gly8Ala、Arg16Gly、Gly23Arg、C-34T、G-47T和Cys15Thr等突变[2][3]。研究显示inhA启动子突变与广泛耐药结核病的发生有关[4]。
分枝杆菌属及检验考点总结
分枝杆菌属及检验考点总结
一、结核分枝杆菌
引起人和动物结核病的病原菌。
目前已知在我国引起人类结核病的主要有人型和牛型结核分枝杆菌。
（一）生物学特性
1.形态与染色
G+，细长或略带弯曲的杆菌，在培养基中可呈球状或丝状，陈旧培养物或干酪化的淋巴结中可见到分枝状。
抗酸菌。
既往在组织中曾发现革兰阳性的非抗酸颗粒，接种动物可产生典型的结核病变，后被称为Much颗粒。
2.培养特性
◆专性需氧，在无氧条件下迅速死亡，在5%～10%C02环境中可刺激其生长。需适当的湿度。本菌生长缓慢，最快的分裂速度为18h一代。
◆固体培养基：2～6周才能长出菌落，呈干燥颗粒状，不透明，乳白色或米黄色，表面呈皱纹状，形似菜花。
◆液体培养基中生长较快，多为表面生长，形成菌膜，且干燥易碎而沉于管底。有毒力菌株在液体培养基中可呈索状生长，无毒株则无此现象。
◆营养要求较高，必须在血清、卵黄、马铃薯、甘油以及某些无机盐类的特殊培养基上才能生长。
3.生化反应
◆不发酵糖类，能产生过氧化氢酶，耐热触酶试验、聚山梨酯-80水解试验和耐热磷酸酶试验均为阴性，脲酶试验和中性红试验均为阳性。
◆人型结核分枝杆菌：烟酸试验、硝酸盐还原和烟酰胺酶试验均为阳性；牛型结核分枝杆菌均阴性。
4.抵抗力：对酒精敏感。
5.变异性：形态、菌落、毒力、免疫原性和耐药性等变异。
毒力变异：卡介苗（BCG）——将有毒的牛型结核分枝杆菌培养。
于含有甘油、胆汁、马铃薯的培养基中经13年传种230代，获得减毒菌株，再接种动物，不能致病而使其获得免疫力。用于预防结核病。
（二）临床意义
1.致病性
◆不产生内毒素和外毒素，也无荚膜和侵袭性酶。
◆主要致病物质：脂质。
索状因子（破坏细胞，引起肉芽肿）、磷脂（形成结核结节）、硫酸脑苷脂（抑制吞噬体与溶酶体结合）、蜡质D（引起迟发性过敏反应）。