单核细胞增生李斯特氏菌的研究进展资料

单核细胞增生李斯特氏菌的研究进展

摘要:单核细胞增生性李斯特氏菌是人类一种重要的食源性致病菌，单核增生李斯特氏菌的危害近年来引起世界各国食品和卫生部门的广泛关注. 本文主要阐述了单核细胞增生性李斯特氏菌的生长特性，包括生物学特性、流行病学、致病性的一些研究，以及对该菌的传统分离方法、免疫学检测方法、核酸检测等方法的最新进展进行了综述，为进行该菌的准确、快速检测奠定了基础.

关键词：单核细胞增生性李斯特氏菌 , 生物学特性 , 检测方法

Research Advance on Listeria Monocyto--genes

Dong Qian

College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China

Abstract: listeria monocytogenes is one of the important food-derived pathogens for human, and listeria monocytogenes have been paid close attention by public health and food bureaus the world over. The growth characteristic including biological characteristics, epidemiological, pathogenic, epidemiology, and recent advances of listeria monocytogenes detection methods, including traditional detection procedures, immunity detection patterns and nuclear acid assays were reviewed. Thus, a foundation of rapid and accurate detection methods of the bacteria were laid.

Key word: Listeria monocytogenes , Biological characteristics , Detection method

由近年来关于单核增生李斯特氏菌的相关消息可知，李斯特菌病尤其是由单核增生李斯特氏菌引起的各类疾病已日益成为全球性疾病，引起了国际上的高度重视。更是将其列为21 世纪90年代食品中四大致病菌之一【1】。因此对其特性的了解及研究在食品安全方面是十分必要的。现针对单核增生李斯特氏菌的基本特性，检验方法，以及研究前景进行简单阐述。

1 李斯特氏菌属的基本简介

目前国际上公认的李斯特氏菌属共有7个菌种，除单核细胞增生李斯特氏菌外，还有绵羊李斯特氏菌( L. ivanvii) 、英诺克李斯特氏菌( L. innocua) 、威尔斯李斯特氏菌( L.welshimeri)、西尔李斯特氏菌(L. seeligeri) 、格氏李斯特氏菌(L. grayi) 以及墨氏李斯特氏菌(L. murrayi)，只有单核细胞增生李斯特氏菌与人的疾病密切相关。

单核细胞增生李斯特氏菌革兰氏阳性、无芽胞，为较小的杆菌或球杆状菌，生长温度20℃~ 50℃，具周身鞭毛，有动力。在肉汤培养基中生长呈杆状、球杆状、链状等多种形态，该菌为兼性厌氧菌，在普通培养基上生长良好。血琼脂平板上的菌落小而圆，凸起且光滑，直径1~ 2mm，周围有一窄小的B溶血环，卵育48h后更清晰可见。对血琼脂平板的血源( 兔、马、羊或人) 无特殊要求。本菌耐碱不耐酸，对热较为敏感，加热50℃10min可死亡。

单核细胞增生李斯特氏菌可产生一种溶血作用的外毒素，致病性强，但不产生内毒素。该菌为一种胞内菌，侵犯宿主后被巨噬细胞吞噬，并在其中寄生繁殖。单核细胞增生李斯特氏菌可分成16个血清型，4b和1b常见，致病性最强，其中1b与HIV感染有关。

2 生物学特性

2.1 形态与染色

该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх1.0～2.0μm，直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状，在染色过重的玻片上菌体有栅栏状排列的趋势，易误认为白喉菌而错判。兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，无芽胞，但在在营养丰富的环境中如含血清的葡萄糖蛋白胨水中能形成粘多糖荚膜。在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性，该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落【2】。在20～25℃环

境中形成4根鞭毛，故在25％肉汤培养液中运动活泼，用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。

2.2 培养特性

该菌营养要求不高，在20～25℃培养24h可形成4根小鞭毛，有动力，36℃培养时无鞭毛，动力消失。穿刺培养2～5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。该菌的生长范围为2～42℃，最适培养温度为35～37℃，在pH中性至弱碱性（pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高条件下该菌生长良好，在pH3.8能缓慢生长，在6.5% NaCl 肉汤中生长好。在普通营养琼脂平板上36 培养24 h呈细小、半透明、微带珠光的露水样菌落，直径约0．2m m～0．4ram，在斜射光下，菌落呈典型的蓝绿色光泽。在固体培养基上菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。在5～7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良McBride(MMA)琼脂上，用450角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色【3】。

2.3 生化特性

2.3.1 生化特性结果总结

该菌触酶阳性，氧化酶阴性，能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖，不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性【4】。

2.3.2 具体生化鉴定方法

(1)过氧化氢酶试验

挑取TSA-YE平板上的菌落于洁净的载玻片上，滴加1滴3％的过氧化氢溶液，30s 内产生气泡者为阳性。

(2) 三糖铁试验

将TSB-YE 肉汤培养物分别接种于三糖铁琼脂（TSI，35℃培养5d变黄为阳性，变黑为产硫化氢（H2S）。

(3) MR-VP试验

将TSB-YE肉汤培养物接种于MR-VP肉汤中，35 ℃培养48h。移取1ml，培养物于洁净的试管中，加5%萘酚溶液6ml，再加40% 的氢氧化钾溶液0.2ml，轻轻摇动试管约1min，静置约20min，出现红色为VP 阳性反应；将剩余培养物35℃继续培养48h，加甲基红指示剂5 滴于试管中，出现红色为MR 阳性反应。

(4)尿素酶试验

用TSB-YE肉汤培养物穿刺接种于尿素琼脂斜面上，35℃培养5d 逐日观察。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。

(5)硝酸盐还原试验

用TSB-YE肉汤培养物接种于硝酸盐肉汤中，35℃培养5d后加入0.2ml甲液（0.8g ∕ml对氨基苯磺酸乙酸溶液，再加入乙液（0.5g∕ml 甲萘胺乙酸溶液），轻轻摇动混合。如在1～2min 内出现红色，判断为阳性反应；如果没有颜色反应，在含有甲液和乙液的试管中再加入少量锌粉，放置1h如出现红色，表示仍有硝酸盐存在，未被细菌还原，判断为阴性。

(6)糖发酵试验

将TSB-YE肉汤培养物分别接种于含有0.5% 七叶苷、甘露醇、鼠李糖、木糖的发酵管中，35℃培养24～48h ，阳性者由于发酵糖类产酸使培养基变黄；阴性者继续培养到第5天。

(7) 动力试验

将TSB-YE 肉汤培养物垂直中心穿刺接种于半固体动力培养基，室温（20～25℃）培养2～5d，逐日观察。李斯特氏菌，如在半固体培养基中呈典型的倒伞状生长，底部为弯月牙形，则表明有动力。

(8)溶血试验

将7% 羊血平板底面划分为20～25个小格，每格刺种1 个菌落。从每个TSB-YE 平板上至少挑取2个菌落刺种血平板，并刺种阳性对照菌和阴性对照菌，355℃培养

24～48h。于明亮处观察，单核增生李斯特氏菌和西尔李斯特氏菌在刺种点周围产生狭窄透明的β-溶血环；绵羊李斯特氏菌有大的透明β-溶血环；而其他李斯特氏菌不产生溶血环，为阴性。

2.4 血清学特征

根据菌体(O)抗原和鞭毛(H)抗原，将单增李氏菌分成13个血清型，分别是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e 和“7”13 个血清型。致病菌株的血清型一般为1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b，后两型尤多【5】。

2.5 抵抗力

该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和干草内能长期存活，对碱和盐抵抗力强，在含1％～4％NaC1的TSB2YE肉汤中生长良好；在含有8％～12％NaC1的TSB2YE肉汤中生长停滞；在含16％～20％NaC1的TSB2YE肉汤中菌数有所下降，但仍有部分残存。但对热的抵抗力较弱，60℃30 rain、80℃1 rain即可全部灭活。60～70℃经5～20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌。对庆大霉素、万古霉素、卡那霉素、头孢噻吩、头饱唑啉、诺氟沙星、氧氟沙星、红霉素、四环素、氯霉素敏感；对依诺沙星和呋喃妥因耐药嗍。

3 流行病学

单核细胞增生李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。据报道，健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0. 6～16%，有70%的人可短期带菌，4～8%的水产品、5～10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约占85～90%的病例是由被污染的食品引起的【6】。

该菌可通过眼及破损皮肤、粘膜进入体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿，栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是本病传播的可能途径，且有上升趋势【7】。

近十几年来，单核细胞增生李斯特氏菌引起的发病率日趋上升，国外有报道巴氏消毒奶和墨西哥式奶酪曾引起单核细胞增生李斯特氏菌暴发性食物中毒分别感染了49人

和142人，病死率为28.16%~ 33%【8】。在美国和加拿大曾多次引起食物中毒，并确认该菌和许多其他细菌一样，是病死率较高的暴发性食物中毒的重要原因之一【9】。

4 致病性

4.1 致病物质

4.1.1 溶血素O

目前已知溶血素O与单核细胞增生李斯特氏菌毒力有关，由hly基因编码，为单核细胞增生李斯特氏菌的一种基本毒力因子，其最主要的作用为介导细菌溶解。溶血是单核细胞增生李斯特氏菌致病的一个重要标志，临床分离的单核细胞增生李斯特氏菌全部溶血，不溶血的无毒性【10】。

4.1.2 ActA蛋白

系由ActA基因编码的表面蛋白，通过诱导细胞肌动蛋白分子的聚合作用促使细菌在细胞与细胞之间的传递，同时也与细菌被宿主细胞内化有关【11】。

4.1.3 P60蛋白

P60蛋白是一种胞壁质水解酶，由iap基因编码。通常P60蛋白于细胞表面产生，并大量分泌到生长介质中，对于细胞的分裂是必不可少的。分析P60蛋白编码基因的突变体显示，对于单核细胞增生李斯特氏菌的吞噬细胞溶解作用以及对机体的感染过程，P60蛋白是一个重要的因素【12～13】。

4.1.4 磷脂酶C

由plcB基因编码，具有锌依赖性，分为性质不同的两类，即磷脂酰肌醇磷脂酶C(PI —PLC)和磷脂酰胆碱磷脂酶(PC—PLC)。PI—PLC系以活化的形式合成，而PC—PLC 则先以非活化的前肽被分泌出来，然后在胞外由mp l的基因产物Mp l蛋白酶加工。Pl —PLC可辅助细菌逸出初级吞噬体，而细菌在细胞与细胞之间的扩散过程中，Pc—PLC 则表现出一定的活性作用【14】。Angelika Grund1．

ing等通过利用诱导PC—PLC表达系统证明，缺乏LLO的LM，PC—PLC的活性不仅对在人类上皮细胞中初级吞噬体的溶解是必需的，而且对细胞与细胞之间的扩散也是必需的【15】。

4.1.5 PrfA蛋白

系由P rfA基因编码，是一种转录因子，是李斯特菌所有基因簇(包括P rfA本身)转录激活所必需，是迄今鉴定出的李斯特菌的唯一毒力调节蛋白【16】；在感染宿主细胞的过程中，对许多毒力因子的等位表达起到关键调控因子的作用【17】。

4.2 致病力与致病机理

单核细胞增生李斯特氏菌的抗原结构与毒力无关，寄生物介导的细胞内增生，使它附着及进入肠细胞与巨噬细胞；抗活化的巨噬细胞，单增李氏菌有细菌性过氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬细胞内的过氧物（为杀菌的毒性游离基团）分解；溶血素，即李氏杆菌素O，可以从培养物上清液中获得，为SH；活化的细胞溶素，有α和β两种，为毒力因子【18】。

4.3 不同人群的临床症状

单核细胞增生李斯特氏菌进入人体是否得病与菌的毒力和宿主的年龄免疫状态有关，因为该菌是一种细胞内寄生菌，宿主对它的清除主要靠细胞免疫功能，因此，易感者为新生儿、孕妇、40岁以上的成人，免疫功能缺陷者。已知在下述条件下容易诱发成人李斯特氏菌病，而且发病的死亡率极高：患肿瘤、艾滋病、酒精中毒、糖尿病（尤其是Ⅰ型）、心血管疾病、肾脏移植者和可的松皮质激素治疗者【19】。

健康成人可出现轻微类似流感症状，有患病嫌疑的成人，群殴主要症状是，发热，呼吸急促，出血性皮疹，化脓性结膜炎，抽搐，昏迷，宫颈炎，常规淋巴结炎，脓血症，剧烈头痛、恶心、呕吐、腹泻、败血症、脑膜炎甚至死亡。其中，脑膜炎和脓血症是最常见的症状【20】。

感染此病的孕妇（她们胎儿常被天生感染）可能不会呈现任何症状，即使呈现症状时，其症状也比较温和，与流感的症状类似，其结果常有流产、早产或死胎。

出生时被感染的新生儿患此病的典型症状是脑膜炎，典型发病时间是在出生后1~4周【21】。

5 防治措施

食品中分离到的单核细胞增生李斯特氏菌均具有毒力基因，对人体健康有潜在威胁及出现暴发感染危险，应引起卫生部门的高度警惕。冷冻食品、生鲜奶、生畜禽肉和蔬菜类是主要的危险食品，应加强监测与管理。生鲜奶是细菌繁殖的良好基质，其挤奶、运输环节的冷链条件无法有效抑制李斯特菌的繁殖，故其带李斯特菌及单核细胞增生李斯特氏菌的比率较高。单核细胞增生李斯特氏菌具有一定的热抵抗能力，耐受巴氏消毒，在6O℃下需2O min或70℃下需5 min才能杀死，一旦生鲜奶巴氏杀菌不彻底，就有食源性单核细胞增生李斯特氏菌病暴发的危险。冷藏肉类产品单核细胞增生李斯特氏菌带菌率明显高于其它产品，可能是由于单核细胞增生李斯特氏菌有嗜冷特性，在冷藏条件下可生长繁殖，因此家庭贮藏于冰箱的食品不应存放太久，且在食用前应煮熟煮透。超

市等食品生产企业应定期对冷藏柜进行消毒。

除此之外，美国CDC对一般人群推荐了降低李斯特氏菌病危险性的5条措施，即：生的动物性食品，如牛肉、猪肉和家禽，要彻底加热；生食蔬菜食用前要彻底清洗；未加工的肉类与蔬菜、已加工的食品和即食食品分开；不吃生奶(未经巴氏消毒的) 或用生奶加工的食品；加工生食品后的手、刀和砧板要清洗。

6 检测方法及对比讨论

6.1 检测方法

6.1.1 传统检测方法

传统检测单核增生李斯特氏菌的方法是先需增菌培养，再经过分离及纯化培养，然后进行血清和生化方面的鉴定。

6.1.2 免疫学方法

(1) 单克隆抗体检测法

该法是利用抗单核增生李斯特氏菌的特异单克隆抗体与菌特异表位抗原反应的原

理来进行检测的。

(2) 自动酶联荧光免疫分析系统(VIDAS)法

该方法【22～23】是将免疫夹心法与荧光检测法结合起来，即通过固定相吸附已知抗体，已知抗体在捕捉目标生物体后与带荧光的酶联抗体再次结合，经充分洗脱，再通过激发光源检测，从而能自动读出发光的阳性样品。

(3) 试剂盒法

Reveal试剂盒【24】是一种利用侧流式免疫色谱分析技术快速定性检测李斯特氏菌的方法。原理是特异性的抗单核增生李斯特氏菌抗原的抗体被束缚在色原载体上，样品中存在的抗原与蓝色胶乳颗粒上的抗体结合形成抗原、抗体、色原复合物，此复合物穿过侧面流动膜时被固定在测试区的抗单核增生李斯特氏菌的硝酸纤维素膜捕获并聚集，出现一条可见带因而呈现阳性。

6.1.3 分子生物学技术检测法

(1) 基因探针法

利用人工合成单核增生李斯特氏菌的某个基因(如溶血素O基因)的探针，并以32P 标记该探针，然后进行斑点杂交实验进行检测【25】。

(2) PCR技术检测法

利用PCR技术检测单核增生李斯特氏菌的某个特异基因的方法，如编码单核增生李斯特氏菌溶血素0的hly基因、编码肌动蛋白聚集因子的actA基因、编码内化素B 的inlB基因等【26】。目前也有一些改进的PCR检测技术，如IMS．PCR检测技术【27】，该方法是将免疫磁分离技术(Immuno．magneticSeparation，IMS)与PCR技术相结合后来进行检测的。

6.2 方法对比

经比较发现单增李斯特菌存在的问题是传统方法耗时，工作量大，不适应当前对卫生微生物快速、准确、灵敏、特异检测的要求。但在暴发流行病的检测和污染源的追踪方面仍然不可替代，将作为黄金标准长期存在。

免疫学方法检测单增李斯特菌，也存在不少问题。制备针对单增李斯特菌单克隆抗体很困难，需要专门的技术；商品化的单克隆抗体种类少，价格也较贵，使得免疫学检测成本相应增高。

分子检测与传统方法相比，能大大减少工作量，一定程度上实现了灵敏、快速、特异的检测。但是分子检测的阳性样本仍然要以传统方法为参照，不能完全代替传统的方法，但可用于致病菌的快速排查。

就PCR来说，需对样品进行前处理，样品前处理的好坏很大程度上影响PCR检测的结果。一方面是除去对PCR扩增有抑制的物质，另一方面要抑制杂菌，使目的菌达到一定的量，因为每个PCR体系都有一定的检测限。PCR和探针杂交都无法排除死菌和活菌，尽管通过增菌可使死菌比例减少，相对地减少了假阳性，但并不能完全杜绝。以mRNA为目标分子进行检测，有望解决这一问题。此外，单增李斯特菌属致病菌，毒力基因易发生丢失，当以其作为目标基因检测时，易造成假阴性的结果。

6.3 检测方法和技术及对未来的展望

随着学科的交叉，食源性致病菌的检测一方面向综合的方向发展，即集多种技术于一体的多功能、全自动化大型检测仪器不断出现；另一方面，针对单个菌种和菌属的新型培养基、免疫试剂盒和分子试剂盒也会不断推向市场。从技术角度来说，对于单增李斯特菌的快速检测，新型鉴定培养基、免疫学检测和分子检测仍然是3条主线。无论是从那个角度，未来检测的方向都是向着更快捷、更精确、更灵敏的方向发展。相信随着对单增李斯特菌的全方位深入了解和认识，更完美的检测工具会不断出现。

小结：

食品中存在的单增李斯特菌对人类的安全具有较大威胁，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。近几年来，因食品污染单增李斯特菌而引起的食物中毒暴发事件日见增多，引起不少国家卫生部门的广泛关注。随着生活质量的提高，对食品的卫生与安全越来越关注，所以对单核增生李斯特氏菌的关注是必不可少的。因为单核增生李斯特氏菌所引起的后果十分严重，死亡率为20～30%。因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。所以，本文就单增李斯特菌的生物学特性，流行病学，致病性，检测方法及其当前存在的问题等做简要介绍。从而进一步深刻认识到，对单核增生李斯特菌的了解以及进一步的研究是十分必要的。