骨组织脱钙的方法和步骤
EDTA 脱钙液使用说明书
EDTA脱钙液使用说明书储存条件：常温保存，有效期1年。
产品内容：Components SL1500 EDTA脱钙液（pH7.2-7.4）500mL说明书1份产品说明：1.在病理实验制作切片时，我们会经常碰到一些含钙组织，而且钙十分坚硬。
由于组织中的钙和石蜡之间的密度不同，含钙的组织一般不能直接制作切片。
骨组织含钙量最多。
除了骨组织之外其它组织也可发生钙化，在组织中形成钙化区，所以需要经过脱钙过程。
脱钙是制作骨组织切片的重要环节，尤其是要进行免疫组织化学染色的骨组织。
2.为达到骨组织既充分脱钙，又保护骨组织中的抗原不受破坏，需要对含钙的组织固定之后再进行脱钙。
然后再行常规制片。
3.EDTA与羟基磷灰石结晶的外层钙结合，形成可溶性的非离子化合物，同时又促进晶体内层的结合钙向外转移。
借助这种连续性的作用使羟基磷灰石晶体逐渐融解，pH中性时可起螯合作用。
其特点是脱钙时间长，对骨组织的损伤少，酶活性(碱性磷酸酶)和细胞抗原性保存较好，制作的切片可用于组织化学和免疫组化分析。
4.主要用途：用于骨组织、牙齿等脱钙。
使用说明：1.骨组织脱钙时，取材不易过厚，一般大约5mm。
2.组织固定后，用PBS清洗3次，每次20min。
3.组织用蒸馏水洗清洗3次，每次20min。
4.组织转移至20～30倍体积的EDTA脱钙液中，脱钙10～30天或更长时间。
如果想加快脱钙速度，可以置于37℃进行脱钙。
如果必要，更换新的EDTA脱钙液继续脱钙，多数组织脱钙2周～3个月即可，每周更换一次，直至终点。
亦可采用微波快速脱钙法：微波炉设在200W左右的档位，每次加热5min，依据组织厚度和密度重复3～5min，中间间隔3～5min。
5.用蒸馏水冲洗数次。
6.常规脱水、包埋。
注意事项：1．为使脱钙更为充分，每次最好更换新液，这既弃去脱掉的钙盐，增加脱钙强度，又起到降低脱钙的温度。
2．脱钙时间以大头针能刺进骨密质为完成脱钙标准。
3．脱钙温度不要太高，一般以室温(25℃)为宜，高温可加快脱钙速度，但可破坏组织中的核酸而影响染色效果。
骨组织脱钙技术及其应用
骨组织脱钙技术及其应用张绪斌;熊正文;张华东;解放军第【摘要】@@ 骨组织不同于一般的软组织,是一种坚硬的结缔组织,由粘多糖和一些胶原纤维样骨胶纤维构成的骨样组织和沉着于其中的无机盐(骨盐)形成的.【期刊名称】《医学理论与实践》【年(卷),期】2011(024)011【总页数】4页(P1264-1267)【关键词】骨组织;脱钙技术;应用【作者】张绪斌;熊正文;张华东;解放军第【作者单位】解放军第251医院,河北省张家口市,075000;解放军第251医院,河北省张家口市,075000;解放军第251医院,河北省张家口市,075000;解放军第251医院,河北省张家口市,075000【正文语种】中文【中图分类】R954.65;R392.1骨组织不同于一般的软组织,是一种坚硬的结缔组织,由粘多糖和一些胶原纤维样骨胶纤维构成的骨样组织和沉着于其中的无机盐(骨盐)形成的。
无机盐以羟基磷灰石结晶的形式存在,其中绝大部分为水合磷酸钙,此外还包括微量碳酸盐和柠檬酸盐等[1,2],因此骨和其他一些已钙化的组织在脱水、透明等制片前必须将组织中的钙盐用脱钙剂除去,才能制成4～5μm厚的切片。
目前,常用的脱钙剂主要有单纯酸类、混合酸类、螯合剂、离子交换树脂和电解脱钙等方法[3～6],尤其是近年来应用微波技术辅助脱钙明显缩短了脱钙时间,改善了HE、组织化学、免疫组织化学染色和原位杂交[7～11]。
现将骨组织的脱钙技术及应用等有关内容简介如下。
1 骨组织的组织学特点[1,2]骨组织由骨基质和骨细胞组成,骨基质是由有机物质和无机物质紧密结合而成,主要成分有:(1)胶原纤维:为Ⅰ型胶原;(2)粘蛋白:为胶原纤维间的无定型物质;(3)骨盐:主要是羟基磷灰石;(4)酶:包括碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和胶原酶等。
软骨基质是由软骨母细胞分泌丰富的蛋白多糖组成的,HE染色呈淡蓝色,A lcian蓝染色阳性(蓝色),甲苯胺蓝呈异染性反应(紫红色),软骨的胶原属Ⅱ型胶原。
三种脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响
三种脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响目的探讨三种脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响。
方法选择12例骨组织，随机分为3组。
A组用14%硝酸脱钙液进行处理，B、C组分别用EDTA 脱钙液、PLANK脱钙液进行处理，同时对CD3、CD68、Ki—67 和TTF—1染色。
结果室温条件下，硝酸脱钙液的脱钙时间最短，但对组织损伤最大。
PLANK 脱钙液和EDTA脱钙液脱钙效果较好，组织结构完整，形态清晰，免疫组化染色较好。
结论室温条件下，三种脱钙液中PLANK脱钙液和EDTA脱钙液对骨组织脱钙及免疫组化染色效果较好。
但由于EDTA脱钙液脱钙时间过长，PLANK 脱钙液脱钙均匀，速度快，更适合用于临床病理检查。
硝酸脱钙液脱钙最快，但是免疫组化染色效果较差。
标签：脱钙液；骨组织；免疫组化染色骨组织内含有大量无机钙盐，结缔组织坚硬，难以直接制片[1]。
如果强制切片，在蓝色钙盐背景下，往往无法看清细胞结构，所以需要选择一种能保持骨组织形态结构和染色后有利于保持细胞结构清晰度和对比度的脱钙液。
本文研究14%（体积分数）硝酸脱钙液、EDTA脱钙液、PLANK脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响，以期寻找一种效果比较理想的脱钙液，对病理诊断工作提供帮助。
1 材料与方法1.1 标本选择12例骨组织标本均来源于我院，切成1 cm×1 cm×0.3 cm的骨块，在福尔马林中性液内固定24 h，用于脱钙及免疫组化染色实验。
1.2 三种脱钙液①脱钙液Ⅰ：14%（体积分数）硝酸脱钙液，配制方法为14 mL浓硝酸加入86 mL蒸馏水；②脱钙液Ⅱ：EDTA脱钙液，配制方法为EDTA10 g，蒸馏水100 mL，加NaOH充分搅拌溶解，在用10 mol/L的HCl调pH为8.0，最后加入4%甲醛15 mL。
③脱钙液Ⅲ：PLANK脱钙液，配制方法为氯化铝10 g，甲酸50 mL，10%福尔马林10 mL，冰乙酸1.5 mL，加蒸馏水至总体积100 mL。
脱钙液
脱钙液（一）酸性溶液脱钙法1．硝酸-间苯三酚液：浓硝酸10ml，间苯三酚1g，通风橱内混合。
混合时会产生浓的棕黄色双硫磷烟雾。
然后加10%硝酸100ml。
骨组织块5mm 厚脱钙时间12-24 小时。
优点：该液脱钙速度非常快，大概是所有脱钙液中速度最快的一种脱钙液。
缺点：（1）细胞核染色很差。
（2）如果脱钙时间太长对组织有较大的损害。
（3）用5%硫酸钠液中和，然后充分流水冲洗至少24小时。
（4）用化学方法测试不能确定脱钙的终点。
2．硝酸水溶液：浓硝酸5-10ml，蒸馏水加至100ml。
厚度5mm 骨组织块脱钙12-24 小时。
优点：（1）硝酸水溶液是一种迅速的脱钙液。
（2）对组织损害较少，细胞核着色比福尔马林-硝酸液要好。
（3）组织可直接通过70%乙醇去除酸。
缺点：脱钙时间必需仔细控制防止过度脱钙损害组织。
3．福尔马林-硝酸液：40%甲醛5ml，浓硝酸10ml，蒸馏水85ml。
5mm 厚的骨组织块脱钙时间需要1-3 天。
优点（1）福尔马林-硝酸液是一种迅速的脱钙液。
（2）该液脱钙的组织比间苯三酚-硝酸液细胞核染色好。
（3）可作为紧急活检脱钙用。
（4）该液和5-10%硝酸水溶液一样对组织几乎没有损害。
缺点：（1）该液对细胞核作用较慢，使细胞核着色较差。
（2）用5%硫酸钠液中和，然后充分流水冲洗至少12小时。
4．Perenyi’s 液：10%硝酸4 份，0.5%铬酸3 份，无水乙醇3 份。
5mm 厚的骨组织块脱钙时间需要2-7 天。
优点：（1）该液是一种温和的脱钙液，可能由于铬酸和乙醇的存在可以抑制组织泡软。
（2）细胞核和细胞浆细微结构着色均好。
（3）推荐该液作为常规脱钙使用。
（4）组织脱钙后不需要碱性液中和和流水冲洗。
脱钙组织直接移到90% 乙醇中。
缺点：（1）脱钙较慢，因此，紧急情况下不能使用。
（2）用化学方法测试不能确定脱钙的终点。
5．Von Ebener’s 液：饱和水溶液氯化钠50ml，蒸馏水50 ml，浓盐酸8 ml。
同种异体脱钙骨基质
同种异体脱钙骨基质同种异体脱钙骨基质是一种用于骨组织工程和骨再生的生物材料，具有广泛的应用前景。
本文将从同种异体脱钙骨基质的定义、制备方法、特点及应用等方面进行阐述。
一、同种异体脱钙骨基质的定义同种异体脱钙骨基质是指从同种动物体内提取的骨组织经过脱钙处理后得到的一种生物材料。
它具有保留了骨组织的基本成分和结构，但去除了骨钙化物质，从而降低了免疫原性和抗原性，减少了排异反应的可能性。
同种异体脱钙骨基质的制备过程主要包括以下几个步骤：首先，从同种动物的骨组织中获取骨材料，并进行初步处理，如去除软组织和骨髓。
然后，将骨材料进行脱钙处理，通常采用酸性溶液或酶解法来去除骨钙化物质。
最后，对脱钙后的骨基质进行杀菌处理，并冷冻保存，以备后续使用。
三、同种异体脱钙骨基质的特点1. 保留了骨组织的基本成分和结构：同种异体脱钙骨基质在脱钙过程中能够较好地保留骨基质的胶原蛋白、糖胺聚糖等成分，以及骨小梁、骨小室等基本结构，使其具有良好的生物相容性和生物活性。
2. 降低了免疫原性和抗原性：脱钙处理能够显著降低同种异体脱钙骨基质的免疫原性和抗原性，减少了异体移植时的排异反应和免疫排斥反应的发生。
3. 促进骨再生和修复：同种异体脱钙骨基质具有良好的生物活性，能够提供一个良好的细胞外基质环境，促进骨细胞的黏附、增殖和分化，从而促进骨再生和修复。
四、同种异体脱钙骨基质的应用同种异体脱钙骨基质在骨组织工程和骨再生领域具有广泛的应用前景。
它可以作为骨修复植入物用于骨折的治疗和骨缺损的修复，能够提供一个良好的支架结构，促进新骨的生成和骨缺损的愈合。
此外，同种异体脱钙骨基质还可以应用于种植体的固定和牙槽骨增量等领域。
总结：同种异体脱钙骨基质作为一种生物材料，在骨组织工程和骨再生中具有重要的应用价值。
通过去除骨钙化物质，同种异体脱钙骨基质降低了免疫原性和抗原性，保留了骨组织的基本成分和结构，具有良好的生物相容性和生物活性。
它可以促进骨细胞的黏附、增殖和分化，促进骨再生和修复。
同种异体脱钙骨基质
同种异体脱钙骨基质同种异体脱钙骨基质是一种用于骨组织再生的生物材料，具有广泛的应用价值。
本文将从不同角度介绍同种异体脱钙骨基质的特点、制备方法以及其在临床应用中的作用和前景。
一、同种异体脱钙骨基质的特点同种异体脱钙骨基质是从同种异体的骨组织中提取的，经过一系列的处理和脱钙工艺制备而成。
相比于人造材料，同种异体脱钙骨基质具有以下特点：1. 生物相容性好：同种异体脱钙骨基质不会引起明显的免疫排斥反应，可以与宿主组织良好地结合，促进骨组织再生。
2. 生物活性高：同种异体脱钙骨基质中富含丰富的生物活性成分，如生长因子、细胞外基质等，能够促进骨细胞增殖和分化，加速骨再生过程。
3. 结构完整：同种异体脱钙骨基质保持了原有骨组织的微观结构，具有良好的孔隙结构和导向性，有利于细胞迁移和新生血管的形成。
同种异体脱钙骨基质的制备主要包括以下几个步骤：1. 采集骨组织：选择同种异体的健康骨组织，如骨头、骨骼等，进行无菌采集和处理。
2. 清洁处理：将采集到的骨组织进行清洗和消毒处理，去除外源性污染物和微生物。
3. 脱钙处理：采用脱钙剂将骨组织中的钙离子去除，保留骨基质的完整性。
4. 切割和粉碎：将脱钙后的骨组织进行切割和粉碎，得到适当大小的同种异体脱钙骨基质颗粒或片状材料。
5. 杀菌处理：对脱钙骨基质进行高温高压杀菌处理，确保其无菌性。
三、同种异体脱钙骨基质的临床应用同种异体脱钙骨基质在临床应用中具有广泛的应用前景，主要应用于以下方面：1. 骨缺损修复：同种异体脱钙骨基质可以用于修复各种骨缺损，如骨折、骨肿瘤切除后的骨缺损等。
将脱钙骨基质插入缺损部位，能够提供支撑和导向作用，促进新骨的生长和再生。
2. 骨植入物辅助修复：同种异体脱钙骨基质可以与人工植入物结合使用，提高植入物的稳定性和生物相容性。
通过植入同种异体脱钙骨基质，可以改善植入物周围的骨环境，促进骨愈合和整合。
3. 骨重建和整形：同种异体脱钙骨基质可以用于骨重建和整形手术中，如颌骨重建、骨盆修复等。
大鼠关节组织硝酸＼EDTA脱钙对石蜡制片的影响及比较
大鼠关节组织硝酸＼EDTA脱钙对石蜡制片的影响及比较标签：大鼠关节组织;硝酸脱钙;EDTA脱钙;石蜡制片骨组织脱钙技术是病理实验室常用技术之一。
它的应用,使难以切片或不能完整制片的骨或软骨组织达到完整制片的目的。
适用组织化学、免疫组化等技术的染色。
大鼠关节组织制片的关键步骤是脱钙,其直接影响到制片的成败。
现在大鼠关节组织石蜡制片实验中,分别用10%硝酸和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)复合液进行脱钙处理后,石蜡包埋、制片、染色。
对用两种方法脱钙处理的大鼠关节组织石蜡制片后染色,镜下观察形态及着色效果。
1 材料与方法1.1 材料大鼠30只、出生10周,平均体质量400 g(购自中山大学动物实验)。
雌雄不限,随机分组。
在麻醉状态下经心脏注射生理盐水及1%多聚甲醛处死动物,取关节组织、标本置10%甲醛固定液中固定24 h。
10%的硝酸脱钙液。
EDTA脱钙液,微波炉。
1.2 方法10%硝酸脱钙液的配制及脱钙方法将1份的硝酸溶液加入到9份的蒸馏水中搅拌均匀即可。
将大鼠关节组织放入是组织体积20倍量的10%硝酸溶液中,浸泡16～18 h,浸泡中无需更换脱钙液,用针能刺入即可。
取出组织置流水中冲洗碱化2 h。
取材,入脱水机石蜡包埋、切片、染色。
1.3 EDTA脱钙液的配制及脱钙方法用PBS缓冲液(pH7.2)100 ml、加NaOH 搅拌溶解至饱合状态,再加入EDTA10 g溶解后用1 mol/L Hcl调节pH值至7.2,加甲醛15 ml即可。
把脱钙液装入小烧杯中,将大鼠关节组织放置其中,脱钙液需充足。
放入微波炉中调节微波功率50℃,微波照射50 s即可达到脱钙的目的。
取出无需流水冲洗、直接取材、入脱水机、石蜡包埋、切片、染色。
2 结果10%硝酸脱钙处理的大鼠关节组织切片组织结构尚完整,组织块也能顺利连续切片,镜下:细胞形态、结构尚清,HE着色较淡,有时细胞核仁及膜边界不太清晰,分界不清,对比度不强。
在特殊染色和免疫组化染色中,着色较困难,效果欠佳。
三种脱钙液对骨组织脱钙后切片染色效果分析
顺利制 出一张质量较好的组织切片并非 易事 ， 本要 求是切 基
片 完整 ， 色后 各 种 骨 细 胞 的 细 胞 核 及胞 浆 清 晰 ， 胞 外 胶 染 细
原对 比度好 。 目前使用的脱钙方法有很 多种 ， 以分 为酸类 可 脱钙液 、 螯合剂脱钙液、 电解法脱钙液等 。
右， 辐射 ５ｍｎ测量脱钙液的温度（ （ ， ｉ， ＜６℃）间隙 ３ｍｎ ） ｉ 。用同
钙的效果 （ ２ 。 表 ）
表 ２ 三种 脱 钙 液 不 同 时 间效 果分 析
ＬｉＡ Ｐ０ ｅ ａＳ ３（ 自动脱水机 ；４ Ｌ ＩＡ全 自动包埋机 ；５ 东 ｃ ￣全 （ ）ＥＣ （） 方 一Ａ型恒温干燥箱 ；６ Ｏｙ ｐｓ （ ） ｌ ａ 显微 镜及 Ｃ ＩＳ图像 分析 ｍ ＭＡ 仪 ；７Ｒ ｎｓｅｇＣ （） ｏｇｈｎＢ Ｄ一１５ ６０冰箱 ；８ Ｎ一６０ （） ８３自动 温度控 制漂 片烤片仪。
２０ｍ ， ０ ｌ盐酸 ８ ５｜ ， ． Ｔ 甲酸 ５ｎ Ｉ ２ １％ 甲醛 ＋５ １ ｌ ｄ （ ）０ ％硝 酸液 ：
４ ％ 甲醛 ，５ ０ ６ ％硝 酸 ，０ ｌ 馏 水 ；３ Ｅ Ｔ 中性 液 ： Ｄ Ａ １０ｍ 蒸 （ ）Ｄ Ａ ＥＴ １ ， 馏 水 １０ｍ ， Ｎ Ｏ ０ｇ蒸 ０ ｌ加 ａ Ｈ搅 拌 溶 解 后 ， １ ｏ Ｌ的 Ｈ Ｉ 用 ０ｍ ｌ ／ Ｃ 调ｐ Ｈ为 ７ ０ 然后 加 ４ 甲醛 ｌ ｒ 。 ．， ％ ５ｎ ｌ １ １３ 仪 器 ．． （ ）ｉ ０微 波 炉 ；２ Ｌｉ Ｒ ２３ 片 机 ；３ １ｒ ２ ｐ （ ）ｅ ａ Ｍ １５切 ｃ （）
３ 讨 论
１２２ 脱钙方法 ．．
见表 １ 。
骨组 织分别按 以下方 法脱钙 ， 脱钙 时间
表 １ 三种 脱 钙 方 法 脱 钙 时 间表