真菌药敏试验简介

真菌体外药物敏感试验简介刘根焰，赵旺胜南京医科大学第一附属医院医学检验科/南京医科大学检验系, 南京 210029 随着移植、肿瘤和免疫缺陷患者的增多，侵袭性真菌感染（Invasive fungal infections ，IFI）病例也明显增加；随着临床真菌耐药性的出现，经验性抗真菌治疗越来越困难；随着新的抗真菌药物不断投入临床，传统的抗真菌药物敏感试验标准已难以覆盖。

诸多因素都要求临床微生物室真菌药物敏感试验能够与时俱进。

然而，当前国内临床微生物室真菌药物敏感试验开展的情况却不容乐观，首先表现在开展这项临床服务的实验室少，多局限于少数教学医院；其次，各个实验室采用的方法参差不齐，相互之间的结果可比性差。

为此，本文将介绍临床真菌药物敏感试验的标准参考方法和市场上关于真菌药物敏感试验的仪器和试剂，希望有助于各级医院临床真菌药物敏感试验的规范化开展。

1.真菌体外药物敏感试验的基本概念1.1 常见抗真菌药物介绍开展真菌药物敏感试验前提是了解抗真菌药物的基本知识，包括分类、作用机制及抗真菌特性，见表1[1]。

对于不能从上述特性中推断出药物敏感性结果的部分进行体外药物敏感试验。

表1 常见抗真菌药物简介分类代表药物作用机制抗真菌作用多烯类两性霉素B 直接和细胞膜上的麦角固醇结合，导致细胞膜对单价和二价阳离子的通透性增加而导致细胞死亡。

对念珠菌、隐球菌、球孢子菌、孢子丝菌、芽生菌、毛霉菌和大部分曲霉敏感，对土曲霉、构巢曲霉、Aspergillus fumigateaffinis 和Aspergillus lentulus天然耐药。

三唑类酮康唑氟康唑伊曲康唑伏立康唑通过抑制真菌细胞色素P450 依赖的-羊毛甾醇14α-去甲基化酶作用，导致麦角固醇合成受阻氟康唑抗菌谱窄,对大多数念珠菌、隐球菌有效，对曲霉无抑制活性,对克柔念珠菌天然耐药；伊曲康唑较氟康唑抗菌谱宽,并对曲1泊沙康唑舍他康唑霉有抑制作用；伏立康唑较氟康唑抗菌谱宽,并对曲霉、镰刀菌和其它透明丝孢霉有抑制作用；泊沙康唑抗菌谱最宽,对念珠菌,曲霉、镰刀菌、接合菌和其它透明丝孢有效；舍他康唑主要对皮肤癣菌和念珠菌抗菌活性较强烯丙胺类特比萘芬萘替芬抑制角鲨烯环氧化酶而干扰麦角固醇的生物合成。

对皮肤癣菌如发癣菌（红色发癣菌、须疮癣菌、断发癣菌、堇色发癣菌）、犬小孢子菌和絮状表皮癣菌有杀菌活性，对念珠菌有抑菌活性。

氟胞嘧啶5-氟胞嘧啶通过真菌细胞的渗透酶系统进入细胞内，转换为氟尿嘧啶，替代尿嘧啶进入真菌的脱氧核糖核酸中，从而阻断核酸的合成。

抗真菌谱窄，仅对酵母菌(新型隐球菌)和酵母样菌(念珠菌属)有较高的活性。

棘白菌素卡泊芬净米卡芬净安尼芬净抑制真菌细胞壁β-(1,3)-D-葡聚糖的合成而干扰细胞壁合成棘白菌素类抗真菌药对于念珠菌，曲霉等均有良好的抑制活性，对于一些双相真菌如组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌等也有抑制作用，但是对于新生隐球菌、镰刀菌、接合菌和白吉利毛孢子菌等无抑制活性。

1.2 MIC：最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）是指按照标准操作规程进行真菌药物敏感试验时，在特定培养时间内，能完全或显著抑制真菌生长的最低药物浓度。

真菌药敏试验的MIC不同于细菌之处在于与无药对照组比较，有些药物MIC要求完全抑制，有部分药物只要求部分抑制即可。

如CLSI M27-A3中规定酵母菌稀释法药物敏感试验结果判读时，唑类药物MIC值判读标准为宏量法达到80%生长抑制，微量法达到50%抑制的最低药物浓度，而对于两性霉素B，则要求达到100%生长抑制。

1.3 MFC: 最低杀真菌浓度（minimum fungicidal concentration，MFC) 是指与无药对照组比较，抗真菌药物能杀死99%到99.5% 受试菌量的最低药物浓度；MFC测定通常以培养72小时后，从微量试验孔和无药对照孔中各吸取20 µl 菌悬液，倾注沙保罗葡萄糖琼脂平2板，培养48h 后进行活菌计数，小于 3 CFU的最低药物浓度即MFC。

更多研究认为，MFC相比较MIC更能准确反映抗真菌药物的体内疗效。

1.4 MEC: 最低有效浓度（minimum effective concentration，MEC) 是指曲霉菌在含系列浓度的棘白菌素类抗真菌药物的培养基中培养时，显微镜下开始观察到菌丝变短、变粗和高度分叉改变的最低药物浓度。

现有研究认为由于拖尾生长现象，曲霉菌对棘白菌素类药物MIC值波动很大，MEC比MIC更能反映药物的体内疗效，建议体外药物敏感试验以MEC取代MIC，CLSI M38-A2文件首次定义了MEC的基本概念并附有棘白菌素类药物MIC和MEC结果判读的比较和指控菌株的MEC范围[2]。

1.4 S-DD：剂量依赖性敏感（Susceptible-Dose Dependent ，S-DD）是指提高给药剂量后，血液及组织中的药物浓度仍可高于MIC浓度，即体内敏感；S-DD反映药物剂量和生物利用度的最大化对治疗成功至关重要。

其次，S-DD也是一个浓度缓冲区间，尤其是对于毒副作用大的药物，可以避免因实验误差导致的小的乃至失控性的损伤。

1.5 拖尾现象：拖尾现象（trailing endpoints phenomenon）是指氟胞嘧啶和唑类药物对酵母菌体外药物敏感试验时，因为部分生长受抑制现象，使得该类药物（尤其是氟康唑）48 h判读MIC结果受到影响，即24 h无拖尾现象时MIC低，而48 h因为拖尾生长，MIC值显著升高[3]。

这种拖尾生长导致的MIC升高经体内研究证实其实际仍属敏感，探讨拖尾现象的原因及影响因素的研究也不断出现，包括培养基pH值、葡萄糖含量、微孔板底的形状及培养基中添加美兰等均可改变拖尾现象[4-5]。

2 真菌体外药物敏感试验标准化溯源自上世纪80年代NCCLS成立真菌药敏试验专业委员会，到1997年，NCCLS发布第一个真菌药物敏感试验的标准化文件M27-A，真菌药物敏感试验开始朝专业化、标准化发展，目前，国内外广泛认可的真菌药物敏感试验标准化方法主要有美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）发布的最新方法和欧洲抗生素3药物敏感试验委员会（The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）发布的最新真菌药物敏感试验方法（见表2）[6-9]。

表2 真菌药物敏感试验的标准化文件溯源时间简称中文全名CLSI有关真菌药物敏感试验的标准化文件：2008 M27-A3酵母菌稀释法药物敏感试验的参考方法-第三版2008 M27-S3酵母菌稀释法药物敏感试验的参考方法-第三版信息补充2009 M44-A2 酵母菌纸片扩散法药物敏感试验-第二版2009 M44-S3 酵母菌纸片扩散法药物敏感试验判读标准和质量控制-信息补充2008 M38-A2 丝状真菌稀释法药物敏感试验的参考方法-第二版2010 M51-A 非皮肤来源的丝状真菌纸片扩散法药物敏感试验方法2010 M51-S1 丝状真菌纸片扩散法药物敏感试验判读标准和质量控制-信息补充EUCAST有关真菌药物敏感试验的标准化文件：2008 E.DEF.7.1糖发酵型酵母菌稀释法MIC检测参考方法2008 E.DEF.9.1 丝状真菌稀释法药物敏感试验的参考方法3 真菌体外药物敏感试验方法真菌体外药物敏感试验方法主要有稀释法、琼脂扩散法和这些参考方法衍生出来的真菌药物敏感试验的仪器和相应试剂。

3.1 稀释法稀释法分为酵母菌稀释法和丝状真菌稀释法药物敏感试验，酵母菌稀释法药物敏感试验的基本步骤和参数见表3，主要溯源于CLSI M27-A3和CLSI M27-S3文件。

表 3 酵母菌稀释法药物敏感试验主要参数详细内容培养基培养基：含谷氨酰胺和酸碱指示剂的RPMI-1640溶液。

缓冲液：0.164 M (34.53 g/l)浓度的丙磺酸吗啉缓冲液（morpholinepropanesulfouic acid, MOPS)。

pH值范围：6.9–7.1。

4配制方法：10.4g RPMI-1640+18g葡萄糖+34.53g MOPS 溶解于900ml无菌水，定容到1000ml，然后用0.22μm的滤膜过滤，4 ℃贮存备用。

适应症念珠菌属和隐球菌属药物贮存液一般用无菌水或相应溶剂将原料药配成100倍初始应用浓度的溶液。

稀释方案用RPMI 1640培养基进行2倍系列稀释，水溶性药物采用1:5稀释到初始浓度，非水溶性药物采用1:50稀释到初始应用浓度。

氟康唑和氟胞嘧啶的浓度范围： 64–0.06 µg/ml；两性霉素B、安尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净、伊曲康唑、泊沙康唑、伏立康唑、雷夫康唑和酮康唑的浓度范围: 16–0.03 µg/ml。

加药方案宏量稀释法采用12×75 mm的试管，每管加0.1ml；微量法采用U 型底的96孔培养板，每孔加0.1ml，加好药的试管或培养板－80℃可保存6个月，－20℃可保存2个月。

培养物准备取新鲜培养的沙氏培养基上的酵母菌（培养24h）或新生隐球菌（培养48h）的菌落3-5个，无菌生理盐水调节菌悬液浊度为0.5麦氏浊度。

受试菌浓度0.5 麦氏浊度相当于1×106 到 5×106 CFU/ml的数量。

宏量稀释法用RPMI-1640培养基将菌悬液进行1:2000倍稀释，微量稀释法用RPMI-1640培养基将菌悬液进行1:1000倍稀释。

宏量法每管加0.9ml菌液（最终体积为1ml），微量法每孔加0.1 ml菌液（最终体积为0.2ml），相当于受试菌终浓度为0.5×103到2.5×103 CFU/ml之间；如果是新生隐球菌，受试菌终浓度应调节为1×104CFU/ml。

孵育温度35℃普通培养孵育时间念珠菌属对棘白菌素类药物培养24h，其他药物培养48h新生隐球菌对于唑类、氟胞嘧啶和两性霉素B均培养72h结果判读唑类和5-氟胞嘧啶，MIC值判读采用和培养48h后的无药对照管（孔）比较，宏量法达到80%生长抑制，微量法达到50%抑制的最低药物浓度；对于两性霉素B，培养48h后，要求达到100%生长抑制，即肉眼澄清的标准；对于棘白菌素类药物，培养24h后至少达到50%生长抑制。

敏感折点(mg ⁄ L)氟康唑: S ≤ 8, SDD = 16–32; R ≥ 64伊曲康唑: S ≤ 0.125, SDD = 0.25–0.5; R ≥ 1 (只适用于粘膜感染) 伏立康唑: S ≤ 1, S DD = 2; R ≥ 4氟胞嘧啶: S ≤ 4; I = 8–16; R ≥ 32棘白菌素类: S ≤ 2 (只有敏感折点)质控菌株克柔念珠菌（Candida krusei ATCC 6258）近平滑念珠菌（Candida parapsilosis ATCC 22019）质控范围ATCC 6258 ATCC 220195(mg ⁄ L) 两性霉素B 0.12–1.0 0.12–1.0氟胞嘧啶 1.0–4.0 0.12–0.5氟康唑16.0–64.0 0.5–2.0伊曲康唑0.03–0.12 0.03–0.12伏立康唑0.03–0.25 0.015–0.06泊沙康唑0.015–0.06 0.015–0.06欧洲抗生素药物敏感试验委员会真菌专业委员会（EUCAST-AFST）文件EUCAST-EDEF7.1所描述的酵母菌稀释法药物敏感试验的主要操作步骤和CLSI的M27-A3文件相同，略有不同之处见表4。