蛋白酶产生菌的筛选及酶学性质研究
低温蛋白酶产生菌的筛选及其酶学性质的初步研究
低温蛋白酶产生菌的筛选及其酶学性质的初步研究莫清珊;张会图;田耀;孙同韦;冯士元;孙军;路福平【摘要】从南印度洋深海沉积物中筛选获得1株产低温蛋白酶的嗜冷菌株11815，经16S rDNA鉴定，结合菌株的形态结构特征和生理生化特性分析，确定其为动性球菌属(Planococcus sp.)．该菌株的最适生长温度及最佳产酶温度均为20,℃，经发酵条件初步优化后，48,h内摇瓶水平的蛋白酶产量可达280,U/mL；酶学性质分析结果显示：该菌株所产蛋白酶的最适作用温度为37,℃，最适pH为8.0，30,℃条件下可保持最高催化活力的80%以上，而在25～30,℃仍具有较高的催化活力(保持最高催化活力的50%以上)．该菌株所产蛋白酶属于典型的低温蛋白酶，在常温下具有较好的催化活性，因此在食品加工业及冷水洗涤剂开发等方面具有较高的研究价值．%A psychrophilic bacterium 11815 was isolated from the deep sea mud of southern Indian ocean to produce cold-adapted protease and the product was identified asPlanococcussp. according to its morphological and physiochemical char-acteristics as well as 16S rDNA sequence analysis. The optimal temperature for its growth and protease production was 20,℃and the protease production reached 280 U/mL after 48 h fermentation in shake flask. The optimal pH and temperature for producing protease were 8.0 and 37,℃. At 30,℃,the relative activity reached 80% of the highest activity. Even at lower tem-peratures from 25,℃ to 30,℃,the relative activity still reached more than 50% of the highest activity. These enzymatic prop-erties indicate that the protease producedby the newly isolated psychrophilic strain belongs to the class of cold-adapted pro-teases and possesses a high application potential in food processing and cold-water detergents.【期刊名称】《天津科技大学学报》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】5页(P19-23)【关键词】低温蛋白酶;动性球菌;分子鉴定【作者】莫清珊;张会图;田耀;孙同韦;冯士元;孙军;路福平【作者单位】天津科技大学生物工程学院，天津 300457;天津科技大学生物工程学院，天津 300457;天津科技大学生物工程学院，天津 300457;天津科技大学生物工程学院，天津 300457;天津科技大学生物工程学院，天津 300457;天津科技大学海洋科学与工程学院，天津 300457;天津科技大学生物工程学院，天津300457【正文语种】中文【中图分类】Q786低温蛋白酶是指最适催化温度在40,℃以下，并且在20～30,℃仍能保持较高酶活(50%以上)的一类蛋白水解酶[1].由于其最适催化温度接近自然环境中的温度，因此在应用过程中可省去加热或冷却过程，与中高温蛋白酶相比具有节能、省时等特点，在食品及洗涤行业具有广泛的应用前景.低温蛋白酶多数来源于冰川、极地、高山、深海等低温环境中的嗜低温或耐低温微生物[2–3].这些低温微生物为了适应其所处的低温环境，常可表达分泌一些在低温条件下仍具有较高催化活性的胞外酶或胞内酶，因此从耐低温或嗜低温微生物中筛选获得低温蛋白酶已成为发掘新型工业用低温酶制剂的主要方法[4].目前已发现的产低温蛋白酶菌株有来源于冰川冻土中的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和短小杆菌(Curtobacterium luteum)、来源于南极地区的梭状芽孢杆菌(Clostridium sp.)和嗜冷杆菌(Psychrobacter proteolyticus)、来源于海洋浮冰中的科尔韦尔氏菌属(Colwellia sp.)、来源于寒漠地区的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)以及来源于其他寒冷环境中的沙雷氏菌(Serratia sp.)、弧菌(Vibrio sp.)、黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)、希瓦氏菌属(Shewanella sp.)产黄青霉(Penicillium chrysogenum)等.这些菌株所产低温蛋白酶的最适催化温度大部分均在30～40,℃，只有少数几种的最适催化温度低于20,℃，但稳定性很差.国内对低温蛋白酶及其产生菌的研究起步较晚，研究对象多集中在来源于冰川及冻土中的假单胞菌属 (Pseudomonas)、黄杆菌属(Xanthomonas)、产气单胞菌属(Aeromonas)等.本研究则从深海沉积物中分离到1 株产低温蛋白酶动性球菌(Planococcus sp.)，并对该菌株的生长特性、产酶特性及其所产蛋白酶的酶学性质进行了研究.1 材料与方法1.1 菌株来源嗜冷菌株由天津科技大学孙军教授提供的南印度洋的深海沉积物中分离得到.1.2 主要试剂和仪器连接酶、Taq DNA 聚合酶、dNTP、T 载体、DNA Marker，宝生物工程(大连)有限公司；酪蛋白、琼脂粉、缓冲液试剂，上海生工生物工程有限公司.PCR 仪、凝胶成像仪、电泳系统，美国Bio-Rad公司；1500–201 型全波长酶标仪，美国热电公司.1.3 培养基酪蛋白筛选培养基：酪蛋白20,g，琼脂15,g，人工海水定容到1,L，调节pH 到7.5～8.0.发酵培养基：ZoBell 2216E 培养基.1.4 产低温蛋白酶菌株的分离与鉴定1.4.1 产低温蛋白酶菌株的分离取深海沉积物样品1,g，加入20,mL 生理盐水，涡旋振荡混匀.按10 倍稀释法稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7 6 个稀释度的稀释液，每个稀释度各取0.2,mL 稀释液涂布于3 个酪蛋白筛选培养基平板上，并分别于4、20、25,℃培养72,h.选取菌落周围有明显蛋白水解圈的菌落于酪蛋白分离培养平板上进行三区划线纯化培养.根据水解圈直径dH与菌落直径dc的比值确定菌株低温条件下产蛋白酶能力的大小.1.4.2 16S,rDNA 的克隆及系统进化分析菌体基因组提取参照文献[5]进行；以上述基因组为模板，以细菌 16S rDNA 通用引物 27,F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，1492,R(5'-AGT AAGGAGGTGATCCAACCGCA-3')对16S rDNA 进行PCR 扩增.PCR 反应条件为：94,℃预变性5,min，然后94,℃ 60,s，55,℃ 90,s，72,℃ 120,s，循环30 次，72,℃ 延伸10,min.扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳回收后克隆至T 载体，并委托北京华大基因公司测序.将所得序列在NCBI 网站进行 Blastn 比对(/BLAST)，确定与其相关的种属特性.1.4.3 菌株形态及生理生化特性鉴定最适生长温度、菌落形态、革兰氏染色、氧化酶活性检测、过氧化氢酶活性检测、明胶液化实验参照文献[6]进行.1.5 蛋白酶粗酶液的制备及酶活测定将种子培养液以2%的体积比接种至50,mL 发酵培养基，分别在不同温度下(15、20、25,℃)，200,r/min振荡培养52,h，定时取样，考察不同培养温度对产酶的影响.收集菌液于4,℃、10,000,r/min 离心30,min，收集上清液.以酪蛋白为底物的酶活的测定方法参照文献[7]进行；根据QB/T 1803—1993《工业酶制剂通用试验方法》，以1,mL 酶液在37,℃、pH 8.0 条件下，每分钟反应产生1,μg 酪氨酸所需要的酶量为1 个酶活力单位(U/mL).粗酶液用缓冲溶液稀释至适当浓度，作为待测酶液.缓冲液配制1%的酪素溶液作为底物并将粗酶液稀释适当的倍数.取1,mL 稀释的酶液，37,℃保温2,min，加入同样温度的底物 1,mL，于37,℃反应10,min，加入2,mL 质量分数10%三氯乙酸终止反应.静置离心，取1,mL 上清液，加入5,mL 0.4,mol/L Na2,CO3溶液、1,mL福林酚试剂，混匀，40,℃保温20,min，测定吸光度A680.以灭活酶液为空白对照.1.6 酶学性质分析1.6.1 温度对蛋白酶酶活的影响分别将1,mL 粗酶液与1,mL 水解酪蛋白溶液(1%，pH 8.0)混匀，分别在4～50,℃ 测定酶活力，以酶活力最高时为100%，计算其他条件下的相对酶活力.1.6.2,pH 对蛋白酶酶活的影响用不同pH 的乳酸钠缓冲液(pH 2.0、3.0、4.0、5.0)、磷酸盐缓冲液(pH 6.0、7.0、7.5、8.0)、硼砂缓冲液(pH 9.0、10.0)将待测酶液进行适当的稀释，在37,℃及相应pH 条件下测定酶活，酶活数值最大者计为100%，所对应的pH 即为待测酶最适反应pH，其他pH 下的酶活与最高酶活的比值即为其相对酶活.1.6.3 蛋白酶的热稳定性检测将粗酶液分别在10、37、45,℃保温30、60、90、120,min 后测定残余酶活，以未进行保温处理的酶活力值作为对照，设定其相对酶活力为100%，得出酶活力随保温时间变化的曲线.1.6.4 不同金属离子及化学试剂对蛋白酶酶活的影响将待测酶液置于不同浓度(5、1,mmol/L)的Ca2+、Mg2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Ba2+缓冲液中，4,℃保温1,h，在pH 10.0、37,℃条件下测定残留的酶活.将待测酶液置于EDTA、PMSF、β-ME 缓冲液中，4,℃保温1,h，在pH 10.0、37,℃条件下测定残留的酶活.2 结果与分析2.1 产低温蛋白酶菌株的筛选低温培养条件下不同菌株的蛋白水解圈形成情况如图1 所示.在低温培养条件下(4～10,℃)，经透明圈筛选以及划线纯化后复筛，共获得3 株具有分泌表达蛋白酶能力的菌株，分别将其编号为11813、11815 以及11816.其中菌株11815 的蛋白酶分泌表达能力较强，在培养温度为10,℃的条件下，24,h 内，其蛋白水解圈直径与菌落直径的比值(dH/dc)最高可达2.77；而在相同条件下，菌株11813 及11816 的dH/dc则分别仅有1.78 和1.60.图1 低温培养条件下不同菌株的蛋白水解圈形成情况Fig.1 Cold protease transparent zone formed by strains在不同培养温度下，分别对上述3 株产蛋白酶菌株进行液体发酵培养，菌株11815 在4～37,℃均可生长，其最适生长温度为20,℃左右，当温度大于等于40,℃时，则生长极为缓慢甚至停止生长；菌株11813及11816 的最适生长温度与菌株11815 相似，因此均属于典型的耐冷菌.由于菌株11815 的产蛋白酶能力较强，因此作为下一步重点研究对象.2.2 菌株11815的分析鉴定菌株11815 属革兰氏阳性菌，呈球形或卵圆形，直径约1.0～1.2,μm，呈双球状或连珠状排列；菌落形态圆形，颜色橙黄色，表面光滑、边缘齐整.该菌属好氧性或兼性厌氧菌，可较好利用葡萄糖、果糖、淀粉等碳源，能够利用硫酸铵、蛋白胨、水解酪蛋白等氮源；具有氧化酶、过氧化氢酶活性，明胶液化实验呈阳性.该菌16S rDNA 全长序列为1,450,bp，与动性球菌(Planococcus antarcticus) DSM 14505 的相似度为99%，结合形态特征和生理生化特性，将其鉴定为动性球菌属.2.3 温度和pH对菌株11815产酶的影响在摇瓶发酵条件下，研究不同培养温度(15、20、25,℃)对菌株11815 产酶的影响，结果如图2 所示.结果表明：该菌株的最佳生长温度与最适产酶温度相一致，均为20,℃，发酵培养48,h 可达到产酶高峰，产酶量约为280,U/mL.在菌体培养的初级阶段，菌体的生长量与产酶量呈正比；当菌体生长达到平衡期后，菌体量不再增加，而粗酶液中的蛋白酶活性则开始下降，这可能与蛋白酶的自身降解有关.从上述实验结果推断：该蛋白酶的表达应为组成型表达，只与菌体量有关，而与其他诱导因素无关.因此在发酵过程中设法提高菌体浓度，同时在发酵液中加入适量蛋白酶抑制剂，可有效提高蛋白酶产量.图2 培养温度对产酶的影响Fig.2 Effect of culture temperature on enzyme productionpH 对菌株产酶的影响较小，初始pH 在6～8 之间，菌株11815 均可稳定生长并产酶.2.4 酶学性质分析2.4.1 酶的最适作用温度及热稳定性检测在不同温度下分别对菌株11815 发酵液中的蛋白酶活性进行了检测，结果如图3 所示.该菌株所产蛋白酶的最适作用温度为37,℃左右，并且在25～30,℃均有较好的催化活性(最高催化酶活的50%以上)，与其他低温蛋白比较发现，蛋白酶SKPB5 以及焦曲霉(Aspergillus ustus)、假单胞菌(Pseudomonas)strain DY-A分泌的蛋白酶等，最适温度在 40～42,℃[8–10]，11815 分泌的蛋白酶的最适作用温度更低.因此，该菌株所产蛋白酶的最适作用温度与自然环境中的温度基本一致，在使用过程中可以省去加热及冷却的过程，具有节能环保等应用属性.图3 蛋白酶的作用温度与相对酶活的关系Fig.3 The relationship between protease temperature and the relative enzyme activity酶的热稳定性实验结果如图4 所示.该菌株所产蛋白酶的热稳定性较低，37,℃保温20,min 或45,℃保温60,min 后，酶活仅剩原来的10%；50,℃保温10,min 后，则催化活性完全丧失；该蛋白酶只有在10,℃以下才能保存较长的时间；这一特性与大多数低温蛋白酶[7–9]相似，主要与低温蛋白酶本身较为松散的蛋白结构及其较高的分子柔性有关.图4 蛋白酶的热稳定性Fig.4 Effects of temperature on the stability of protease activity2.4.2 酶的最适作用pH分别在不同pH 条件下测定菌株11815 所产蛋白酶活力，酶活力随pH 变化的曲线如图5 所示.该酶在pH 4.0～10.0 均具有催化活力，其最适作用pH为8.0 左右；当pH 升至9.0 时，其酶活约为最高酶活的70%左右，当pH 升至10.0 时，酶活大幅下降，仅为最高酶活的25%；当pH 降至7.0 时，酶活力约为最高活力的82%.因此，该菌株所产蛋白酶为低温蛋白酶.图5 蛋白酶的作用pH与相对酶活的关系Fig.5 The relationship between pH of protease and the relative enzyme activity2.4.3 不同金属离子及化学试剂对蛋白酶酶活的影响不同金属离子及化学试剂对蛋白酶酶活的影响见表1.表1 不同的金属离子、抑制剂对蛋白酶酶活的影响Tab.1 Effect of various metal ions and inhibitors on protease activity注：空白为最适pH 和最适温度下未添加金属离子及化学试剂情况下的酶活.金属离子Ca2+对该菌株所产蛋白酶有激活作用，Mn2+对其基本没有影响；Mg2+、Ba2+、Fe3+、Zn2+、Co2+、Ni2+则对其有一定的抑制作用，Ni2+对其抑制作用最强，浓度为1.0,mmol/L 的Ni2+可抑制90%以上的酶活，因此组氨酸可能是该酶的活性中心之一；EDTA 对该酶有一定抑制作用，某些金属离子可能对维持酶分子的三维结构有重要作用；另外，该酶被PMSF 强烈抑制，因此该菌株所产蛋白酶的活性位点应包括His、Ser 以及羧基氨基酸.3 结语从南印度洋深海沉积物中分离得到1 株产低温蛋白酶菌株，经菌种鉴定为动性球菌(Planococcus sp.).该菌株的最适生长温度为20,℃左右，可在10～25,℃进行快速生长代谢；并在20,℃以下具有表达分泌低温蛋白酶的能力，最适的培养温度为20,℃，摇瓶发酵条件下，48,h 内的蛋白酶产量可达280,U/mL.酶学性质分析结果显示：该菌株所产蛋白酶的最适作用pH 为8.0，最适作用温度为37,℃，当催化温度降至30,℃时，酶活可保持在80%以上，并且在4,℃条件下仍具有水解蛋白的能力.EDTA 对该酶有一定抑制作用，PMSF 对该酶具有强烈抑制作用，因此该菌株所产蛋白酶的活性位点应包括His、Ser 以及羧基氨基酸.该酶热稳定性较差，50,℃仅保温1.0,min，则酶活完全丧失.由该菌株所产蛋白酶的上述特性表明，该酶属于典型的低温蛋白酶，具有一定的研究及开发价值.本课题组还将对该低温蛋白酶的编码基因进行分离与克隆，并进一步尝试在其他宿主菌中实现其高效异源表达.参考文献：［1］Joshi S，Satyanarayana T.Biotechnology of cold-activeproteases[J].Biology，2013，2(2)：755–783.［2］Pawar R，Zambare V，Barve S，et al.Application of protease isolated from Bacillus sp.158 in enzymatic cleansing of contactlenses[J].Biotechnology，2009，8(2)：276–280.［3］Kuddus M，Ramteke P W.Recent developments in production and biotechnological applications of cold-active microbial proteases[J].Critical Reviews in 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酸性蛋白酶高产菌株选育及酶学性质的研究
酸性蛋白酶高产菌株选育及酶学性质的研究张秀江;胡虹;范国歌;郜峰;谷立峰【摘要】The mutant strain Y06 capable of producing high-yield acid protease was obtained through ultraviolet light and nitrosoguanidine mutation of Aspergillus niger. The protease activity of strain Y06 was 36 134 U/g, which increased 46 times compared with wild-type strain of 768 U/g. The optimal pH value .temperature .water content , adding amount of nutrients and fermentation time of cultivation were detected for high yield of producing high-yield acid protease. The acid protease activity and stability in various conditions were also determined. This study provides important experiment basis of the production and use of acid protease.%采用紫外线和亚硝基胍联合诱变,得到酸性蛋白酶高产的黑曲霉菌株Y06,提高了其产酸性蛋白酶能力.结果表明,诱变后菌株的酶活由768 U/g提高到36 134 U/g,相对于出发菌株提高了46倍.为优化高产酸性蛋白酶的固体培养条件,检测了培养菌株最适pH值、温度、含水量、营养物质添加量及发酵时间等,并对所产酸性蛋白酶在各种条件下的酶活力和稳定性进行测定,为生产和利用酸性蛋白酶提供重要的实验基础.【期刊名称】《河南科学》【年(卷),期】2012(030)003【总页数】6页(P327-332)【关键词】酸性蛋白酶;黑曲霉;菌株选育;紫外线;亚硝基胍【作者】张秀江;胡虹;范国歌;郜峰;谷立峰【作者单位】河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州450008;河南省瑞特利生物技术有限公司,郑州450008;河南省瑞特利生物技术有限公司,郑州450008;河南心连心化肥有限公司,河南新乡453731;河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州450008【正文语种】中文【中图分类】Q939.96酸性蛋白酶是一种能在酸性（pH值2～5）条件下将大分子蛋白质迅速水解成肽类和部分游离氨基酸的酶类.它具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于酿造、食品、医药、皮革工艺以及胶原纤维工业中[1-4].酸性蛋白酶的来源主要通过微生物发酵，产酸性蛋白酶的微生物菌种有很多，如米曲霉、黑曲霉、芽孢杆菌等[5-7].在微生物发酵工业中，菌种性能对产量起决定作用.由于我国蛋白质饲料资源严重缺乏，需要寻求非常规蛋白资源，而动物对非常规蛋白饲料的利用效率很低.随着集约化畜禽生产的发展，提高饲料中蛋白类营养物质的利用效率，显得尤为重要.因此，酸性蛋白酶被作为一种新型的生物饲料添加剂，在饲料工业中表现出巨大的潜在价值，越来越受到饲料、养殖和动物营养界的高度重视[8-9].本实验以黑曲霉为出发菌株，采用紫外线（UV）与亚硝基胍（NTG）联合诱变，筛选出酸性蛋白酶高产菌株——黑曲霉（Aspergillus niger-Y06），该菌株产酶能力得到显著提高，进一步节约了成本，推进酸性蛋白酶工业的发展.另外，发酵生产酸性蛋白酶采用固体发酵法的浅盘式发酵和厚层通风式发酵相结合的生产工艺，通过对黑曲霉产酸性蛋白酶生产工艺生产条件的试验研究，确定了酸性蛋白酶发酵生产的技术工艺，并对相关的技术参数进行了优化.1.1 试验材料1.1.1 出发菌株黑曲霉（Aspergillus niger）由中国工业微生物菌种保藏中心保藏的原始菌种，CICC编号：3.430 9.1.1.2 分离及斜面培养基斜面培养基为PDA培养基和察氏培养基（硝酸钠3 g、磷酸氢二钾1 g、七水硫酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、蔗糖30 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L，加热溶解，自然pH，分装后121℃灭菌20 min），分离培养基是在察氏培养基中加入1%的酪蛋白.2.1 菌种的分离和纯化采用常规稀释分离法.2.2 发酵培养方法按要求配制发酵基质，调节初始含水量和pH后，取150 g分装于1 L三角瓶中，在0.1 MPa压力条件下灭菌30 min后，冷却接种，接种量为0.3%，于不同条件下发酵84 h，干燥后，进行酶活力的测定.2.3 紫外线诱变处理取0.1 mL稀释的孢子悬液涂布初筛平板，30℃培养4 h，紫外灯预热30 min后，将平皿置于距15 W紫外灯 30 cm 处分别照射 0 s（对照）、4 min、6 min、8 min、10 min、12 min，每个处理各做 2组.随后在暗光条件下，用5 mL无菌生理盐水对平皿上的菌进行洗脱，适当稀释后，涂布于分离培养基，以黑布包裹30℃下避光培养3～4 d，根据长出菌落与其水解圈直径比的大小及菌落形态的变化，挑选所需菌种，编号并保存，同时根据平皿菌落数计算致死率，从而求得成活率. 式中：A为对照组平皿上的菌落数；B为诱变处理后平皿上的菌落数.2.4 亚硝基胍诱变处理取3 mL稀释的孢子悬液，加入等体积的亚硝基胍溶液，充分混合，于30℃振荡处理1 h（做2组），取出稀释涂分离培养基，30℃培养5 d，挑取透明圈大的菌落分别进行发酵试验，并编号保存.挑取一接种环生长在PDA斜面上的新鲜孢子接入装有50 g培养基的500 mL三角瓶中，培养温度为30℃，培养时间5 d，测定酶活.2.5 酶活测定1 g酶粉在40℃，pH值为3.0反应条件下，1 min内水解酪素产生1 μg酪氨酸为一个酶活力单位（U/g）.3.1 菌株选育结果3.1.1 紫外线诱变紫外线诱变的机理是能作用于嘧啶，形成嘧啶二聚体（主要是TT），影响DNA正常解链与碱基配对，从而引起基因突变，提高酶产量[10].为了改良生产菌，本试验采用紫外诱变的方法照射原菌，稀释分离后涂布在分离平皿.紫外照射孢子成活率结果如表1所示.为了筛选在固体培养条件下产酶高的菌株，经紫外线诱变处理后，得到100余株突变株.这些菌株在形态上有一定的差异，依照其菌落的形态、菌落大小、孢子颜色和孢子丰满程度以及水解圈的大小，从中挑选出20株先经三角瓶液体发酵产酶测定，获得10个高产菌株再经三角瓶固体发酵培养复选，菌株产酸性蛋白酶活力如表2所示.其中z－10的酶活最高为9284 U/g（干基），比出发菌株（CK）提高了11.1倍.3.1.2 亚硝基胍诱变选择经紫外线诱变产酶最高的z－10菌株用亚硝基胍进行进一步诱变处理，由酪蛋白平板初筛得到菌株36株，经摇瓶复筛得到菌株10株，此10株再经三角瓶固体发酵复筛.酶活力超过2.5万U/g（干基）的菌株有4株，基中Y06株产酶，其最高酶活力为36 134 U/g，相对于出发菌株（CK）提高了46倍.经亚硝基胍诱变，选择酶活最高的菌株进行酸性蛋白酶生产性试验，结果如表3所示.3.2 影响酸性蛋白酶菌株（Aspergillus niger－Y06）产酶因子的研究3.2.1 固体培养条件对酸性蛋白酶菌株产酶的影响1）温度温度是固态发酵一个重要的可调节参数，它是影响微生物生长和繁殖的重要条件之一，另一方面由于固态发酵传热性差，如果不能迅速将发酵热移出，将会使发酵温度急剧上升，导致温度失控，进而使发酵反应无法进行.为寻求合适的发酵温度，本研究以酸性蛋白酶发酵培养基含水量为68%、pH值为6.5的条件下培养84 h，分别在27℃、30℃、33℃、36℃和39℃不同温度下进行发酵培养，并测定酶活力，图1证明了酸性蛋白酶菌株产酶最适温度发酵为33℃，结果见图1. 2）水分含量对于固态发酵来说，控制培养基的水分是固态发酵过程中的重要环节之一.适宜的含水量，使得培养基有合适的疏松度，颗粒间存在一定空隙，有助于菌体从培养基获得营养物质和氧的传递，从而促进生长繁殖.过高的含水量会导致培养基粘结成团，多孔性降低，影响氧的传递；含水量过低，则使基质膨胀程度降低，水的活度低，从而抑制菌体生长.含水量过高过低都对黑曲霉生长繁殖及孢子的形成不利，从而影响酸性蛋白酶活性.本研究将黑曲霉分别接种到初始pH值为6.5，含水量分别为60%、64%、68%、72%、76%和80%的固态发酵培养基上，在33℃下进行发酵培养试验，图2结果表明含水量68%时酸性蛋白酶高产菌株产酶达最高值.3）pH值为了研究发酵培养基的pH值对酸性蛋白酶菌株产酶活性的影响，根据固体培养基难以调节pH特点，我们利用缓冲溶液对培养基用水的pH值进行调整.本研究在培养基初始含水量为68%，温度为33℃条件下发酵84 h，观察发酵培养基pH值对酸性蛋白酶菌株产酶的影响，黑曲霉固态发酵最适pH值为6.5，结果见图3.4）玉米粉添加量本研究按不同比例将玉米粉添加到基础培养基（由麸皮、豆粕和玉米淀粉组成）中，以补充碳源，于30℃、初始pH值为6.5和含水量为68%条件下发酵，观察添加玉米粉对酸性蛋白酶活性的影响，由图1可知，当添加玉米粉质量分数为2%时，酸性蛋白酶菌株产酶最大时，随着玉米淀粉添加量的增加，基质易结团而影响氧的传递，酸性蛋白酶活力急剧下降.5）豆粕添加量为了使菌株生长更好，并对菌株产酶进行诱导，本研究在培养基中添加豆粕粉作为补充氮源，于33℃、初始pH为6.5和含水量为68%条件下发酵，考察其对酶活产生的影响，从图2可以看出，在培养基中添加不同比例的豆粕粉，对酶活的产生都有促进作用，随着豆粕粉含量的增加，产品的酶活力有上升的趋势，在质量分数的9%时酶活力达到最高.6）不同浓度铵盐铵盐作为重要的无机氮源对酸性蛋白酶菌株产酶的生产有很重要的作用，生产中常常加入一些铵盐来促进黑曲霉菌的产酶，本研究分别加入不同浓度的氯化铵、硫酸铵、碳酸氢铵进行发酵试验，由图6可以看出少量的硫酸铵对产酶有促进作用，但随着浓度的增加产酶量有下降的趋势，另外，氯化铵的浓度对产酶基本没影响，碳酸氢铵随着浓度的增加对产酶有很大的阻遏作用.7）不同磷酸盐磷酸盐在酸性蛋白酶的生产很重要，在使用麸皮，米糠等有机磷含量丰富的原料时，添加一定的磷酸盐时会出现明显的促进效果.本研究对磷酸氢二铵、磷酸氢二钾进行实验.通过改变无机磷的种类和含量，在33℃、初始pH值为6.5和含水量为68%条件下发酵，研究不同浓度磷酸盐对酸性蛋白酶菌株产酶的影响，结果见图7.添加磷酸盐有利于促进酸性蛋白酶菌株的产酶，且添加质量分数的0.2%的磷酸氢二钾对酸性蛋白酶菌株的产酶促进最大.3.2.2 酸性蛋白酶菌株发酵进程曲线固体发酵采用基础培养基、含水量68%、初始pH值为6.5、添加质量分数的0.2%的磷酸氢二钾和硫酸铵在33℃进行发酵培养，研究发酵进程曲线，结果如图8所示.由酸性蛋白酶菌株发酵进程曲线可以看出，0～24 h发酵产酶速度较缓；24～60 h酸性蛋白酶产酶迅速增加，发酵时间达到72 h后，进程曲线趋于平缓，84 h酶活力最高，其酸性蛋白酶活力（干基）达到36 500 U/g，为了缩短发酵周期，发酵最适时间为72 h.3.3 酸性蛋白酶酶活力稳定性研究黑曲霉产的酸性蛋白酶因其最佳反应pH较低，与畜禽体内消化系统基本一致，用于饲料添加剂中，可以有效的弥补畜禽肠道内源蛋白酶分泌不足，提高蛋白质消化率，降低畜禽代谢性腹泻的发生.酸性蛋白酶作为饲料添加剂，它不仅要经受饲料加工过程中的高温处理、动物胃肠道胃酸的影响，而且还受饲料中部分金属离子的影响，而这些过程中酶活极易受损，从而影响其作为饲料添加剂的效果.本项研究对黑曲霉菌株所产酸性蛋白酶在不同条件下的稳定性进行了研究.3.3.1 pH值对酸性蛋白酶稳定性的影响酸性蛋白酶在一定pH范围内酶活力比较稳定（如图9）.当反应环境pH为3.5，酸性蛋白酶相对酶活力可以达到85%，在pH为4.0时，相对酶活力最高达90%，可以确定酸性蛋白酶最适反应pH值为4.0.pH值过高或过低明显影响酶活力，在pH为5.0时，相对酶活力只有65%，在pH为2.5时，相对酶活力也只有70%.3.3.2 温度对酸性蛋白酶酶活力和稳定性的影响酸性蛋白酶在不同反应温度下酶活力有很大差异（如图10）.一方面是当温度升高时，酸性蛋白酶反应速率加快，另一方面由于随着温度的升高使酸性蛋白酶逐渐变性而失去活性，引起酶反应速率下降.酸性蛋白酶适宜的反应温度为35～40℃，在40℃相对酶活力表现出最高，在低于30℃或者高于45℃时，相对酶活力明显下降.因此认为40℃是酸性蛋白酶最适宜的温度.酶本身就是一种具有生物活性的蛋白质，一定温度必然引起蛋白质的变性从而使酶失活，随着温度的升高变性的时间越快，酶失活也就越迅速.如图11所示，酸性蛋白酶在70℃时，随着时间的延长酶活力开始下降.固体酶在烘箱中70℃保温至5 min保留有90%的相对酶活力，当时间延长至10 min时，剩余酶活有80%，30 min时，剩余酶活仍有19.8%.3.3.3 不同金属离子对酸性蛋白酶稳定性的影响金属离子对酸性蛋白酶活力影响较大，金属离子对酸性蛋白酶的调节作用是相对的，一种金属离子对其具有激活作用，而另一种则可能呈现抑制作用.离子浓度对酶活性也有着不同的影响，往往是低浓度起激活作用，而高浓度起抑制作用.图12表明，在5.0 mmol/L的浓度下，Mn2+和Cu2+对黑曲霉所产酸性蛋白酶有强烈的激活作用，分别达到对照酶活力的150%和120%，Fe3+对该酶表现出明显的抑制作用，处理后的酶活力为对照的58%，而Fe2+、Ag+、Zn2+、Ca2+、K+和Mg2+对酸性蛋白酶有一定的抑制作用.采用紫外线和亚硝基胍联合诱变筛选得到一株稳定、高产酸性蛋白酶的变异菌株Y06，结果表明，诱变后菌株的酶活由768 U/g提高到了36 134 U/g，相对于出发菌株提高了46倍.在研究酶的粗酶酶学性质中发现，该酸性蛋白酶的最适作用pH值为6.5，最适作用温度为33℃，最适含水量为68%，玉米粉最适添加量为2%，豆粕粉最适添加量在9%，发酵最适时间为72 h.菌株产酶稳定性试验结果表明该菌株产酶能力较稳定.【相关文献】［1］刘鑫，李佳，刘克武，等.黑曲霉酸性蛋白酶在食醋酿造中的催化效应［J］.化学研究与应用，2004，16（4）：482－484.［2］张学峰，刘达玉，夏兵兵，等.酒用酸性蛋白酶在甜酒酿生产中的应用［J］.中国酿造，2009（3）：122－124.［3］俞从正，董新宽，王全杰，等.酸性蛋白酶537处理绵羊蓝湿革对皮革延伸性能影响的研究［J］.中国皮革，2006，35（9）：16－20.［4］王祥观，张爱琴，于丽萍，等.酸性蛋白酶在酱油酿造中的应用研究［J］.生物技术，1993，3（4）：26－29.［5］卢燕云，林建国，李明，等.复合诱变选育酸性蛋白酶高产菌株［J］.中国酿造，2009（1）：49－51.［6］罗跃中，李忠英，温拥军.黑曲霉固体发酵产酸性蛋白酶条件优化［J］.湖北农业科学，2010，49（1）：59－62.［7］沈玉洁，张明春，向苇，等.高产酸性蛋白酶菌株的筛选及发酵条件研究［J］.食品与发酵科技，2010，46（6）：32－35.［8］唐宝英，曹建民.酸性蛋白酶高产菌株的选育［J］.食品与发酵工业，1998，24（3）：16-19.［9］刘然，张淑芬.动物蛋白酶化技术［J］.饲料研究，1991（6）：7-9.［10］周德庆.微生物学教程［M］.北京：高等教育出版社，2002：212－217.。
蛋白酶产生菌的分离、鉴定及发酵条件研究
实验方案设计人：陈龙1．蛋白酶产生菌的分离1. 1 实验材料菌源：酱香型大曲1. 2 培养基的配制细菌培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15-25g、水1000ml；称量：分别准确称取上述蛋白胨和NaCl量置于烧杯中，然后加入所需水量的2/3左右的蒸馏水；牛肉膏用玻璃棒挑取置于小烧杯或是表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯中。
溶化：在上述烧杯中先加少许所需要的水量，将烧杯置于石棉网上加热，用玻棒搅拌，让药品完全融化，补充水到所需的总体积。
调PH：在未调PH前，先用PH试纸预测培养基原来的PH，若偏酸用1 mol/L NaOH调节边加变搅拌，并随时用PH试纸检测至PH到7.2。
反之，用0.1 mol/LHCL进行调节。
分装、包扎、灭菌。
霉菌培养基（察氏培养基）：蔗糖30g、NaNO3 2g、K2HPO4 1g、KCL 0.5g、MgSO4.7H2O 0.5g、FeSO4 0.01g、琼脂15-25g、蒸馏水1000ml；量取所需水量约2/3左右加到烧杯中，分别称取上述物品依次逐一加入水中溶解，方法同细菌培养基。
分装、包扎、灭菌。
产蛋白酶发酵培养基：葡萄糖20g，酵母粉15g，K2HPO4 1.0g，Na2CO3 0.1g，自来水100ml PH 9.0（灭菌前）。
pH7．0。
配制方法：称取葡萄糖20g，酵母膏15g置于洁净干燥500ml锥形瓶轻轻摇动，使物料混匀，按上述配方用自来水配制无机盐溶液50ml，调节Ph 9.0,倒入装有物料的锥形瓶中混匀，在0.1Mpa压力灭菌30min。
选择培养基：豆粕粉10．0 g，琼脂15．0 g，蒸馏水1000 mL，pH7．2～7．4，112℃，灭菌30 min。
固体斜面培养基：250mL三角瓶装料12.5g麦麸，麦麸：水=1：1.2，pH自然，121℃灭菌30min。
筛选平板：牛肉膏蛋白胨培养基（配法同上）。
1. 3 试剂和溶液1.3.1 配制生理盐水：分装于250ml锥形瓶，每瓶内装99ml，并装10粒玻璃珠。
一株蛋白酶产生菌的筛选及酶学性质研究
２０ ０ ６年 第 ３期
一
株 蛋 白酶产 生 茵 的 筛 选 及 酶 学 性 质 研 究
李林 珂 ， 高玉 千 ， 崔 锦 ， 向东 马
（ 河南农业 大学生命科学 学院 ， 河南 郑州 ４ ０ ０ ） ５ ０ ２
摘要 ： 从牛奶场采集的土壤样品 中筛选得到 １ 株蛋白酶的高产菌株 ， 经鉴定为枯草 芽孢杆 菌， 其蛋
１ ６， ７ ． ４ １ １
本研究 显示 ， 真空渗入浸染 比普通浸染提高 了 烟草转化率 ， 分化芽多 、 健壮 ； 而获得较高转化率 的 关键是 ： 控制合适 的真空恢 复常压 时 。真空恢复 常压 时 问 为 １０ 。 化 率 最 高 ； 于 １０ 时 ， ８ｓ时 转 少 ８ ｓ 进
３ 结论
［］ 杨成丽 ， １ 刘树楠 ， 吉源 ， 高效 烟草遗传转化体系的建 周 等． 立及甜蛋白基因的导入 ［］生物技术 。 Ｏ 。 （）９ １ Ｊ． ２ ４１ ２ －—１ ． Ｏ ４ ｒ］ 々 郭丽红 ， 陈善 娜 ， 明． 龚 根癌农 杆菌 法转化 烟草 的条件 … 探索 ［］云南大学学报 ，０ ３ ２ （ ）１ ８ ５ ． Ｊ． ２ ０ ，５ ２ ：４ —１ ２ 刘艳军 ， 杨静慧 ， 杨恩芹 。 ． 等 提高农杆 菌基 因转化率 方 法的研究 ［］ 西南农 业 大学学 报 ， ０ ３ ２ （ ） １４— Ｊ． ２ ０ ，５ ２ ：４
曹传增 ， 刘凡， 赵泓， 影响不结球 白菜真空渗入转基 因 等． 频率的几个 因素［］华北农学报 ，０３１（）３ —３ ． Ｊ． ２０ ，８３：５ ８
张广辉， 巩振辉， 薛万新， 大白菜和油菜真空渗入遗传 等．
转化法初报 ［］西北农业大学学报 ， ９ ，６４ ： — ． Ｊ． １ ８２ （）１ ４ ９ 闰新甫 ． 转基 因植物 ［ ．北京 ： Ｍ］ 科学 出版社 ，０ ３ ８ ２ ０ ．７
蛋白酶产生菌的筛选及活力的测定
蛋白酶产生菌的筛选及活力的测定作者刘艳芝指导教师张玲秀（忻州师范学院生物系 1201班 034000）摘要：采用忻州师范学院校园附近土壤、农田土壤及体育场土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。
通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃ 。
关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化蛋白酶蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。
目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株。
我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。
本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。
对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。
研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。
1、材料及方法：1.1 实验材料与仪器实验仪器：高压灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台，电子分析天平，pH测量仪，水浴锅，微波炉，紫外光可见分光光度计，摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。
1.2 实验材料：样品：取自忻州师范学院附近的土壤。
试剂：无菌水（带玻璃珠）、100ug/ml 酪氨酸溶液、PH8.0硼酸缓冲液、0.4mol/L三氯乙酸、牛肉膏蛋白胨培养基、酪蛋白培养基、产蛋白酶发酵培养基二、操作步骤（一）配制所需培养基按照以下配方配制所需的培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2，配制200mL酪蛋白培养基：牛肉膏0.3g，酪素 1g，NaCl 0.5g，琼脂2g ，定容于100ml产蛋白酶发酵培养基：玉米粉6g，豆粉4g，磷酸二氢钾0.03g，碳酸钠0.1g，磷酸氢二钠0.4g，定容于100ml（二）分离1.洗涤培养皿、试管等实验器具，与121℃高压灭菌20min2.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。
酸性蛋白酶产生菌的筛选及其部分性质研究
种子 培 养 液 ： １ ９ ／ ５ 蛋 白胨 ， ０ ． ３ 牛 肉膏 ， ０ ． ５
Ｎａ Ｃ１ ．
及 水产 加工 等多个 行业 ， 对 国民经济 的发 展起着 重 要 的作用 ［ １ ］ ． 酸性 蛋 白酶 在 白酒 大 曲 中的含量 较 高 ， 一般 在
ｐ Ｈ值为 ２ ． ０ ～５ ． ０的 酸 性 条 件 下 活 力 最 强 ］ 萄糖 ， ０ ． ６
Ｎａ ２ ＨＰ Ｏ ・２ Ｈ２ Ｏ， ０ ． ２ 酵母提取物 ， ０ ． １ ＫＣ １ ，
０ ．０ １ Ｍ ｇＳ Ｏ４・７ Ｈ２ Ｏ．
酸性 蛋 白酶属 于水 解酶 类 ， 能够在 酸性 条件 下 将 蛋 白质 水解 成 多肽类 物质 和 游离 的氨基 酸． 酸 性 蛋 白酶是 最 重要 的工业 用酶 之一 ， 其应 用 已经深 入 到食 品 、 酿造、 医药 、 纺织、 皮革、 日用 化 工 、 饲 料 以
０ ． ０ ５ Ｋ２ ＨＰ Ｏ ， ０ ． ０ ５ ＫＨ２ Ｐ Ｏ ４ ， １ 酪蛋 白， ２
酸性蛋白酶与固体曲的制备窖泥培养及其白酒中散发的醇香味有着密切的联系在发酵白酒的过程中高级醇实际上主要是从酸性蛋白酶所分解产生的氨基酸得来的
第 ３ Ｏ卷 第 ２期
Ｖｏ １ ． ３ Ｏ Ｎ ｏ． ２
周 口师范 学院 学报
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｚ ｈ ｏ ｕ ｋ ｏ ｕ Ｎｏ ｒ ｍａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ
生化 性 质 进 行 了研 究． 结果表明 ： 筛选 得 到 的 菌株 Ｄ Ｂ Ｍ２初 步 鉴 定 为 芽孢 杆 菌 ， 其 最适 温度 为 ３ ０口 ｃ， 最适 ｐ Ｈ
值为５ ， 为 酸性 蛋 白 酶 产 生 菌 ． 关键词 ： 酸 性 蛋 白酶 ； 菌株 ； 性 质 中图 分 类 号 ：Ｔ Ｓ ２ ０ ２ ． ３ 文 献标 志 码 ：Ａ 文章编号 ： ｌ ６ ７ １ — ９ ４ ７ ６ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ２— ０ ０ ７ ０ — ０ ３
一株耐盐蛋白酶高产菌的筛选与初步鉴定
一株耐盐蛋白酶高产菌的筛选与初步鉴定随着全球气候变化和人类活动的影响，盐碱化和荒漠化的问题日益严重。
盐碱土壤中的高盐浓度不但对植物生长带来影响，也对微生物生长带来极大的压力。
而在这样的环境中，若能筛选出一些耐盐菌株，对维护土壤生态平衡和提高农业生产力都有着积极的意义。
本研究采用土壤样品培养菌株与测序分析相结合的方法，筛选出一株耐盐蛋白酶高产菌，并对其进行初步鉴定和评价。
1、筛选菌株从渭南市半夏沟盐碱土壤中挖取样品，使用平板法选取耐盐菌。
筛选条件为：15%NaCl、pH=8.0、温度为37°C。
经过3个孔眼培养基的筛选后，获得了一株能够在高盐高碱环境下生长的菌株。
2、16S rRNA测序分析使用菌落PCR方法提取该菌株的基因组DNA，将其16S rDNA片段扩增并纯化，测序结果表明该菌株属于葡萄球菌属。
经过BLAST比对分析，其与NCBI数据库中的Staphylococcus arlettae的同源性可达到99.67%。
3、蛋白酶高产能力评价培养该菌株于含有1.5%NaCl的LB培养基中，经过48小时后采集细胞沉淀并测定其蛋白酶活性水平。
结果表明，该菌株可产生100U/mL的蛋白酶活性，具有良好的蛋白酶高产能力。
4、耐盐性评价在不同浓度的NaCl中对该菌株进行耐盐性评价。
结果表明该菌株最大耐盐浓度为18%NaCl，具有较强的耐盐能力。
5、蛋白酶酶学性质研究将该菌株的蛋白酶纯化并研究其酶学性质。
结果表明，该蛋白酶在pH=9.0~10.0和温度为50℃时具有最高酶活性，属于碱性蛋白酶。
综合上述结果可知，本研究筛选出一株具有较强耐盐能力和蛋白酶高产能力的Staphylococcus arlettae，对于盐碱土壤的改良和农业生产都具有重要的潜在应用前景。
熏马肠中产蛋白酶菌株的筛选及酶学特性测定
1 研究概述1.1 熏马肠简介熏马肠是新疆传统马肉制品。
马驹宰杀后，取其肠子用水洗净，将马的肋条切成条肉，撒上盐和其他佐料，再将马肉切成碎肉和块肉，用调料拌匀，塞入1 m 多长韧性较好的马肠内，两头用竹签扎牢，熏制20 d 左右便成熏马肠，且久存不变质[1]。
在新疆伊犁，熏马肠以其卓越的营养价值和独特的风味，深受各族doi:10.16736/41-1434/ts.2023.18.061基金项目：伊犁师范大学微生物资源保护与开发利用重点实验室项目（YLUKLM2023005）。
作者简介：张雪梅（1984—），女，硕士，助理研究员，研究方向为食品科学。
熏马肠中产蛋白酶菌株的筛选及酶学特性测定Screening of Protease Producing Strains from Smoked Horse Intestines and Determinationof Its Enzymatic Characteristics◎ 张雪梅1,2（1.伊犁师范大学生物与地理科学学院，新疆 伊犁 835000；2.伊犁师范大学微生物资源保护与开发利用重点实验室，新疆 伊犁 835000）ZHANG Xuemei 1,2(1.College of Biological and Geographical Sciences, Yili Normal University, Yili 835000, China;2.Key Laboratory of Microbial Resources Protection, Development and Utilization of Yili Normal University, Yili 835000, China)摘 要：本研究利用微生物选择培养分离方法，从伊犁哈萨克自治州熏马肠中获取优势菌种产蛋白酶乳酸菌，并研究其在不同温度、不同pH、不同金属离子等条件下的蛋白酶活力。