DNA甲基化实验操作原理及方法
DNA 甲基化重亚硫酸氢盐修饰法（DNA METHYLATION BISULFITE MODIFICATION）
实验操作原理及方法
一、实验目的：
通过本实验，可以检测特定DNA序列的甲基化状态。
二、实验原理：
DNA 甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基团，在DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下，将CpG 二核苷酸的胞嘧啶（C）甲基化为5-甲基化胞嘧啶（5-m C）的一种化学反应。
DNA 甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表观遗传的修饰方式。
DNA 甲基化主要在转录水平抑制基因的表达。
DNA 甲基化引起基因转录抑制的机制可能主要有以下3 种：（1）DNA甲基化直接干扰特异性转录因子与各基因启动子中识别位置的结合。
（2）序列特异性的甲基化DNA 结合蛋白与启动子区甲基化CpG 岛结合，募集一些蛋白，形成转录抑制复合物，阻止转录因子与启动子区靶序列的结合，从而影响基因的转录。
（3）DNA 甲基化通过改变染色质结构，抑制基因表达。
重亚硫酸氢盐修饰法检测DNA甲基化的基本原理是基于DNA变性后用重亚硫酸氢盐处理，可将未甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶。
此反应的步骤是：1、在C-6位点磺化胞嘧啶残基；
2、在C-4处水解去氨基来产生尿嘧啶磺酸盐；
3、在碱性条件下去硫酸化。
在这个过程中，5-甲基胞嘧啶由于甲基化基团干扰了重亚硫酸氢盐进入到C-6位点而保持着未反应的状态。
在重亚硫酸氢盐处理后，使用针对每个修饰后DNA链的引物进行PCR反应。
在这个PCR产物中，每5-甲基胞嘧啶显示为胞嘧啶，而由未甲基化胞嘧啶转变成的尿嘧啶则在扩增过程中被胸腺嘧啶所取代。
BSP(bisulfate sequencing PCR) ：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，进行PCR扩增。
最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。
三、实验方法及步骤：
1、复苏并培养细胞，当细胞长至一定程度后，收细胞沉淀并提取其DNA。
2、使用EZ DNA METHYLATION-GOLD TM KIT 试剂盒，将DNA进行亚硫酸氢盐修饰，详见附录1。
3、将上一步中已亚硫酸氢盐修饰的DNA模板进行PCR扩增，详见附录2（BSP）。
4、切胶回收。
5、TA-cloning和转化。
6、涂平板进行蓝白斑筛选。
7、当菌落长至一定程度后，挑选白色菌落进行菌落PCR（体系同BSP）。
8、挑选上一步中跑胶出现条带的白色菌落先将其加入约3ml的不含抗性的LB液体培养基中摇过夜，后取其1ml送去测序。
其余的菌液取500ml加入500ml 50%的甘油冻入-80℃冰箱。
9、测序结果分析（详见附录3）。
四、试剂配制：
1、CT Conversion Reagent：（1）、将900 µl 水, 300 µl 的M-Dilution Buffer和 50 µl M-Dissolving Buffer加入一管的 CT Conversion Reagent。
（2）、在室温下震荡或颠倒约10分钟将其混匀。
注意: CT Conversion Reagent中常有少量的不溶试剂，这很正常。
每一管 CT Conversion Reagent 可以处理10个不同的DNA样品。
保存: CT Conversion Reagent 对光敏感, 故要注意避光。
为了得到最好的结果, CT Conversion Reagent最好现配现用。
如果用不完, CT Conversion Reagent 溶液可以室温过夜、4°C保存一周或 -20°C保存一个月。
保存的 CT Conversion Reagent溶液必须现将其热至37°C, 震荡后再使用。
2、M-Wash Buffer：将 24 ml100% 的乙醇加入 6 ml M-Wash Buffer 浓缩液中。
五、注意事项：
1、亚硫酸氢盐修饰的DNA样品的量要在500pg到2ug之间。
2、BSP很容易污染出现阴性条带，故此步骤要注意操作，避免污染。
3、Taq酶是热启动酶。
4、感受态细胞取出后要马上放在冰上解冻，并在刚解冻时马上使用其转化效率最高。
感受态细胞要注意不要反复吹打。
5、步骤6中要使用KANA或Amp抗性的LB平板，在用菌液涂板前要先在每个平板上涂上500mM的IPTG约8ul和40mg/ml的x-gal约40ul，并在37℃预热。
附录1：
1、在PCR单管中加入130ul的CT Conversion Reagent和20ul的DNA样品（如样品少于20ul，用水补齐）。
2、PCR(98℃ 10min 64℃ 60min 64℃ 60min 64℃ 30min 4℃∞)。
3、将600ul的M-Binding Buffer加入Zymo-Spin™ IC Column中，并将其放入收集管中。
4、将步骤2中PCR后产物加入含有M-Binding Buffer的Zymo-Spin™ IC Column中，关上盖子并颠倒混匀。
5、离心（最高速）30s，弃收集管中的液体。
6、加入100ul的M-Wash Buffer，离心（最高速）30s。
7、加入200ul的M-Desulphonation Buffer，在室温下（20℃~30℃）静置15~20分钟，离心（最高速）30s。
8、加入200ul的M-Wash Buffer，离心（最高速）30s。
重复一次。
9、将Zymo-Spin™ IC Column置入 ml离心管中，加入10ul的M-Elution Buffer（尽量靠近柱子中心），离心（最高速）30s。
产物放入-20℃保存。
附录2:
MSP-S体系：
DNA 4ul
10*PCR buffer
dNTPS
p16-s-f （primer，各为 1ul
p16-s-r 10uM) 1ul
Taq
ddH2O
反应条件：
Step 1 1cycle step2 40 cycle step3 1 cycle
附录3：
举例：
上图中P16 exon1是完全未甲基化的对照序列，可见其所有未甲基化的C都转化为T。
其下五个DNA序列为本次测序后回来的序列，它们分别是SCID22-3B-1-tumor细胞的加puer-tea 组、加5-aza-dc组和空白对照组。
正常的SCID22-3B-1-tumor细胞其p16基因由于其启动子CpG岛甲基化是甲基化沉默的，而加puer-tea和5-aza-dc会去甲基化。
由上图可见空白对照组中红色的C为仍然甲基化的C,这些红色的C就是p16基因CpG岛甲基化位点。
而其同一列中黑色的T为去甲基化而转化为T 的C。
tbs甲基化测序流程-概述说明以及解释
tbs甲基化测序流程-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述部分的内容是对tbs甲基化测序流程进行简要介绍和概括。
可以按照以下内容进行撰写：在基因组研究中，甲基化是一种重要的表观遗传修饰形式，它在基因表达、细胞分化和疾病发生发展等生物学过程中起着关键作用。
tbs甲基化测序流程是一种常用的研究甲基化模式的方法，通过高通量测序技术对甲基化的DNA分子进行检测和定量。
tbs甲基化测序流程主要包括DNA提取、甲基化处理、测序文库构建和高通量测序等步骤。
首先，需要从样本中提取出DNA，通常采用化学或机械方法进行破碎和纯化，以获得高质量的DNA。
接下来，对DNA进行甲基化处理，通常使用亚硫酸盐或DNA甲基转移酶来引入甲基基团。
在甲基化处理后，需要构建测序文库。
这一步骤包括DNA片段的末端修复、连接DNA适配体、PCR扩增等，以生成适合于高通量测序的文库。
最后，利用高通量测序技术对文库进行测序，以获取每个DNA分子的甲基化位点信息。
tbs甲基化测序流程的优势在于其高灵敏度和高分辨率。
通过该流程可以实现全基因组范围内的甲基化位点检测，揭示基因组中的甲基化模式，有助于我们理解甲基化在基因调控和疾病发生中的作用机制。
此外，tbs 甲基化测序流程还可以用于甲基化与其他表观遗传修饰形式（如组蛋白修饰）之间的相互作用研究，为进一步揭示细胞的表观遗传调控网络提供重要线索。
总之，tbs甲基化测序流程是一种可靠、准确的研究甲基化特征的方法。
通过该流程可以获得大量的甲基化位点信息，为我们深入理解甲基化在生物学过程中的功能和机制提供了有效手段。
未来，随着测序技术的不断发展和完善，tbs甲基化测序流程将在多个领域中得到广泛应用，并为相关研究提供更深入的认识和启示。
文章结构部分是指对整篇文章的组织和框架进行说明，提供读者对文章内容的整体把握。
下面是对文章1.2文章结构部分的内容的编写。
1.2 文章结构在本文中，将按照以下顺序讨论tbs甲基化测序流程的要点。
(完整版)甲基化检测方法(亚硫酸氢盐修饰后测序法)
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）第一部分基因组DNA的提取。
这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。
DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。
因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。
否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。
两者均于-20度保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二：1：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。
第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；3：42℃水浴30min；水浴期间配制：4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。
这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。
PH一定要准确为5.0。
加520ul至上述水浴后溶液中。
6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。
7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。
8：50℃避光水浴16h。
一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am 以后收，时间上很合适。
甲基化
主要药品、试剂及其试剂的配制1)1mol/L Tris-HCl（pH 8.0）：将121.1g Tris溶于800mlddH2O中，加浓盐酸调pH到8.0定容至1L。
2)0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）：用800ml ddH2O溶解186.1g EDTA-Na2·2H2O，剧烈搅拌。
用NaOH调pH到8.0，约20g。
定容至1L。
3)2% CTAB：1mol/L Tris-HCl（pH 8.0）50ml，NaCl40.908g,，0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）20ml，β-ME 2ml，PVP1g，2%CTAB10g，定容至500ml，装入棕色瓶，高压灭菌（注意：β-ME不可高压灭菌）。
4)氯仿/异戊醇（24:1）：480ml氯仿+20ml异戊醇。
5)0.1×TE（pH 8.0）：1mol/L Tris-HCl（pH8.0）100μl，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）20μl定容至100ml。
6)5×TBE：54g Tris碱，27.5g硼酸，先加ddH2O溶解，再加40ml 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），定容至1L。
7)3M 乙酸钠（pH 5.2）：50ml ddH2O水中溶解40.8g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5.2，加水定容至100ml，高压灭菌。
8)40%丙烯酰胺（19:1）：190g丙烯酰胺，10g N’,N’-亚甲基双丙烯酰胺，加ddH2O定容至500ml，4℃保存。
9)10%过硫酸铵（APS）：0.5g APS，加水至5ml，4℃保存。
10)变性PAGE胶Loading buffer：47.5ml甲酰胺，2ml of 0.5M EDTA，溴酚蓝0.125g，二甲苯菁0.125g，定容至50ml。
O中加入用于细菌培养的胰化蛋白胨l0g，细菌培养11)LB培养基：在950ml ddH2用酵母提取物5g，NaCl 10g，摇动容器直至完全溶解，用5mol/LNaOH(约0.2mL)O至总体积1L，在1.034x105Pa高压下蒸汽灭菌调节PH值至7.0，加入ddH220min。
甲基化芯片标准流程
甲基化芯片标准流程全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：甲基化芯片是一种用于测量DNA甲基化水平的工具，通过芯片上的探针与被测样本中的DNA相互作用，可以快速而准确地获得DNA 甲基化信息。
甲基化芯片标准流程是指在进行甲基化芯片实验时需要遵循的一系列标准步骤，以确保实验的可靠性和重复性。
本文将介绍甲基化芯片标准流程，并详细解释每个步骤的操作方法和注意事项。
甲基化芯片标准流程主要包括样本准备、DNA提取、DNA甲基化反应、芯片杂交、芯片扫描和数据分析等步骤。
下面将逐步介绍这些步骤的具体操作流程。
第一步：样本准备在进行甲基化芯片实验之前，首先需要准备样本。
样本可以是从组织、血液、细胞等来源提取的DNA。
在提取样本之前，需要注意样本的保存和处理条件，避免DNA降解或受污染。
还需根据实验设计确定所需样本量，确保实验的顺利进行。
第二步：DNA提取DNA提取是甲基化芯片实验的关键步骤，它直接影响后续实验结果的准确性和可靠性。
DNA提取方法有很多种，常用的包括酚-氯仿提取法、离心柱法等。
在进行DNA提取时，需要注意避免污染和降解，确保提取的DNA质量和浓度符合实验要求。
第三步：DNA甲基化反应DNA甲基化反应是将DNA中的甲基化位点与甲基化标记物结合的过程。
在进行DNA甲基化反应时，需要选择适当的甲基化反应试剂和条件，确保反应的有效性和特异性。
还需对反应体系进行控制，避免非特异性反应的发生。
第四步：芯片杂交芯片杂交是将经甲基化的DNA样本与甲基化芯片上的探针相互作用的过程。
在进行芯片杂交时，需要注意控制温度、时间和杂交液的成分，以确保探针和样本之间的特异性结合。
还需避免芯片的污染和损坏，确保实验的顺利进行。
第五步：芯片扫描芯片扫描是将杂交后的芯片放入扫描仪中进行扫描，获取甲基化信号的过程。
在进行芯片扫描时，需要注意设置扫描仪的参数和检查芯片的扫描质量，确保获取准确的甲基化数据。
还需避免芯片的移位和损坏，以保证数据的可靠性和重复性。
表观遗传学 DNA主动去甲基化的Science之路
表观遗传学DNA主动去甲基化的Science之路(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海 200031)5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)被认为是哺乳动物基因组中除腺嘌呤(adenine)、胸腺嘧啶(thymine)、胞嘧啶(cytosine)及鸟嘌呤(guanine)之外的第五种碱基。
它与染色质的另外一种重要组分组蛋白及其翻译后修饰的组合决定了特定基因组区域染色质的结构及基因转录活性，从而形成了一层叠加于碱基序列上的表观遗传信息。
胞嘧啶甲基化，也称为DNA甲基化，参与了诸多生物学过程，包括基因印迹、X染色体的失活、基因组稳定性的维持、转座子及逆转录转座子的沉默及组织特异性基因的沉默等[1-2]。
在哺乳动物的个体发育中，DNA甲基化谱式主要经历了两次大规模的重编程过程，一次发生在从受精至着床的早期胚胎发育时期，另一次发生在配子发生过程中[3-4]。
这两次重编程都涉及了基因组范围的主动去甲基化反应(global demethylation)。
相对于基因组范围内的大规模主动去甲基化，在体细胞中会发生局部的、高度位点特异性的主动去甲基化[5-6]。
DNA的去甲基化与DNA甲基化这两个过程相互平衡，维持了DNA甲基化谱式的稳定。
任何一方的失调都会导致DNA甲基化谱式的紊乱，进而引起多种神经退行性疾病、免疫系统疾病以及癌症[7-8]。
特别是两次基因组范围的主动去甲基化事件对于生命的起始以及生命的传承具有非常重要的意义。
DNA甲基化是由DNA甲基转移酶(DNA methyl-transferase)催化完成，那DNA去甲基化是如何完成的呢？也存在类似于DNA甲基转移酶的DNA去甲基化酶(DNA demethylase)，抑或是其他的机制呢？就此，著名的华人生物学家、美国科学院院士朱健康教授在一篇综述中提出以下几种DNA去甲基化的可能方式(图1) [5]。
(1)存在特异性识别并切除5mC的糖苷酶(glycosylase)，切除5mC产生AP 位点(apurinic/apyrimidinic site)，进而启动碱基切除修复途径(base excision repair, BER)，用没有修饰的胞嘧啶取代原有的甲基胞嘧啶，最终完成DNA的去甲基化。
甲基化酶转化法-概述说明以及解释
甲基化酶转化法-概述说明以及解释1.引言1.1 概述：甲基化酶转化法是一种利用甲基化酶对DNA进行特定的化学修饰的技术。
甲基化酶是一种特殊的酶，其主要功能是在DNA的碱基上添加甲基基团，从而改变DNA的甲基化状态。
通过控制甲基化酶的活性和特异性，可以实现对DNA序列的定向修饰，为生物技术领域的研究和应用提供了新的可能性。
本文将详细介绍甲基化酶的作用机制、甲基化酶转化法的原理以及其在生物技术中的应用。
通过对这些内容的探讨，我们可以深入了解甲基化酶转化法的重要性和应用前景，为进一步研究和应用该技术提供指导和参考。
1.2 文章结构本文主要分为引言、正文和结论三个部分。
在引言部分，我们将介绍甲基化酶转化法的概念和意义，并对文章展开说明。
在正文部分，我们将详细探讨甲基化酶的作用、甲基化酶转化法的原理以及其在生物技术中的应用。
最后在结论部分，我们将总结甲基化酶转化法的优势，展望其未来发展，并给出最终的结论。
通过这样的结构安排，读者可以逐步了解甲基化酶转化法的相关知识，全面认识其在生物领域的应用与前景。
1.3 目的本文的主要目的是探讨甲基化酶转化法在生物技术领域的应用及其优势。
通过对甲基化酶的作用、转化法的原理以及在生物技术中的具体应用进行深入分析和讨论，旨在为读者提供关于该技术的全面了解，并展望其未来发展方向。
同时, 本文旨在呼吁更多的科研工作者关注和研究甲基化酶转化法，推动该领域的进一步发展，为生物技术领域的发展做出贡献。
2.正文2.1 甲基化酶的作用甲基化酶是一类能够催化DNA甲基化反应的酶类。
DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，通过在DNA分子中添加甲基基团来改变基因的表达水平和细胞功能。
甲基化酶在这一过程中扮演着至关重要的角色。
它们能够选择性地将甲基基团添加到DNA的特定位置，从而调控基因的表达。
甲基化酶的作用不仅限于DNA甲基化，还包括RNA和蛋白质的甲基化修饰，进一步调节基因表达和细胞功能。
Illumina_HiSeq_2000-BGI
Illumina HiSeq 2000Illumina Hiseq 2000测序系统是一种高通量测序技术，其测序原理和Illumina Genome Analyzer II 测序系统相似，仍然是采用可逆终止法的边合成边测序技术。
这种测序技术通过将基因组DNA的随机片断附着到光学透明的表面，这些DNA片断通过延长和桥梁扩增，形成了具有数以亿计cluster的Flowcell，每个cluster具有约1000拷贝的相同DNA模板，然后用4种末端被封闭的不同荧光标记的碱基进行边合成边测序。
这种新方法确保了高精确度和真实的一个碱基接一个碱基的测序，排除了序列方面的特殊错误，能够测序同聚物和重复序列。
这种技术避免了像传统测序技术那样耗费大量人力、物力进行片段克隆、转化、质粒抽提等繁琐的操作。
而且多种样品制备方法使此技术有一系列的广泛应用，包括基因表达、小RNA的发现，蛋白质核酸相互作用等。
HiSeq 2000测序系统是前所未有的高通量测序系统，不仅提高测序通量，降低了成本，而且具有创新的用户体验。
预先配置、即插即用的试剂，简单的流动槽上样，简单的触摸屏用户界面，这种人机交互设计特征以及轻松的测序流程，使操作更简单，更方便。
HIseq 2000 cBotFlowcell Cluster Image测序实验流程：•基因组DNA打断；• DNA 末端修复；•连接接头；• DNA片段杂交到 Flowcell上；• DNA模板延伸，桥式扩增；• Flowcell制备；• SBS（synthesis-based-sequenceing）边合成边测序；• Hiseq上自动化测序；•图片处理，实时分析，碱基识别；•图片实时分析；•变异分析；•总结报告；技术特点：•每个run平均达到200G的数据通量，读长为2 x 100bp；•每个run可同时运行2张Flow cell, 且每张Flow cell 可进行上下两面扫描；•采用TDI 线性扫描技术，4个相机同时扫描；•预先配置、即插即用的试剂，简单的流动槽上样，触摸屏式的用户界面；•低成本：单次运行即可以～30倍的覆盖度同时对两个人类基因组样品进行测序，或同时绘制200个基因表达谱。
甲基化干扰
甲基化干扰法鉴定与蛋白结合的DNA位点放射性标记DNA探针的制备●聚丙烯酰胺凝胶的制备1．按照（三）中操作流程灌制非变性聚丙烯酰胺凝胶。
将10×TBE稀释成0.5×的工作浓度。
聚丙烯酰胺的工作浓度取决于待测DNA片段的大小，200bp左右的片段需要4～5％的凝胶，小于100bp的片段应灌制6～8％的凝胶。
●DNA的标记1．用两种限制性内切酶从10μg质粒上将待测DNA片段切下。
注意务必使至少一种酶酶切后产生5’凸出末端。
酶切体系终体积50μl，在适宜的酶反应缓冲液条件下反应1小时。
2．向酶切反应混合液中加入[α－32P]dATP（约10μCi/μl）(若5’凸末端含T残基) 10μldCTP(2mmol/L) 1μldGTP(2mmol/L) 1μldTTP(2mmol/L) 1μlDNA聚合酶（Klenow片段）（5单位/μl） 1μl室温温育反应体系30分钟。
3．加入7μl 10×上样缓冲液终止反应。
●标记探针的分离1．将反应混合物上样于非变性凝胶。
2．10～15V/cm条件下，用0.5×TBE缓冲液电泳2～3小时。
3．将玻璃板从电泳槽中取出，分开，并使凝胶粘附于其中任一块板上。
用保鲜膜将凝胶覆盖起来。
4．将凝胶室温下对X光片曝光1分钟。
小心操作使得显像后的X光片与凝胶能以曝光时方位复原。
5．用保鲜膜覆盖在放射性自显影照片上。
再将带凝胶的玻璃板放在其上，以照片为模板，用刀片切下含标记DNA片段的凝胶片。
将该凝胶片切成小片（约1mm2）后，放入微量离心管中。
6．向管中加入1ml洗脱缓冲液，37℃连续振荡，温育过夜。
7．将洗脱液转入两个干净微量离心管中（每管500μl），然后各加入1ml 100％乙醇，－80℃放置10分钟。
室温离心15分钟沉淀DNA。
8．弃上清，用80％乙醇洗沉淀，室温离心5分钟，用长颈巴斯德吸管移去上清，再用真空离心蒸发浓缩器或干燥器干燥沉淀。
质粒DNA的转化实验原理、仪器试剂和操作步骤
质粒DNA的转化实验原理、仪器试剂和操作步骤【原理】转化是将外源 DNA 分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。
转化所用的受体细胞一般是限制 - 修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（ R- ，M- ）。
将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞。
进入受体细胞的 DNA 分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。
将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源 DNA 分子的细胞）。
本实验采用 CaCl2 法制备感受态细胞。
其原理是细胞处于 0 ～4 ℃， CaCl2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。
转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 得合物。
将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（ Amp r ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。
本实验是将人 Bcl-2 重组质粒转化 DH5 α扩增菌，转化后在含 Amp 的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。
含人 Bcl-2 重组质粒的 DH5 α菌用于质粒 DNA 的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物 DNA 。
【试剂与器材】1 ． LB 液体培养基 10g 胰蛋白胨、 5g 酵母提取物、 10gNaCl 加水至 1L ，高压灭菌消毒。
2 ． LB 固体培养基 LB 液体培养基中加 1.5% 琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。
3 ． 0.1mol/L CaCl2 高压灭菌消毒或过滤除菌。
4 ．氨苄青霉素用无菌水或生理盐水配制成 100mg/ml 溶液，置 -20 ℃保存。
甲基化实验步骤
一． 重亚硫酸盐修饰基因组DNA 的制备采用EZ DNA Mehtylation-Gold Kit TM D5005试剂盒，按照操作说明书分别对提取的Blank 、Cya 基因组DNA 进行重亚硫酸盐修饰。
进行重亚硫酸盐修饰。
1. 分别吸取10μL Blank 和Cya DNA 样品到PCR 管中，加入10μL 水补足20μL ，每个样品加130μL CT conversion reagent 。
轻弹管子或者用枪吹打混匀，离心使液体沉到管底。
底。
2. 将管子放到热循环仪中，运行以下步骤：将管子放到热循环仪中，运行以下步骤：1. 98℃ 10min2. 6464℃℃ 2.5h 2.5h3. 4℃保存可至20h 20h3. 加600μL M-Binding Buffer 到Zymo-Spin TM IC Column, 柱子放在提供的收集管中。
柱子放在提供的收集管中。
4. 把样品（来自步骤2）加到装M-Binding Buffer 的Zymo-Spin TM IC Column 中。
盖上盖子，颠倒混匀。
颠倒混匀。
5. 全速离心（≥10000g ）30s 。
倒掉流穿液。
倒掉流穿液。
6.加100μL M-Wash Buffer 到柱子上。
全速离心30s 。
7. 加200μL M-Desulphonation Buffer 到柱子上，室温（到柱子上，室温（20℃-30-30℃）静置℃）静置15-20min 。
孵育完成后，全速离心30s 。
8. 加200μL M-Wash Buffer 到柱子上。
全速离心30s 。
另加200μL M-Wash Buffer ，再离，再离心30s 。
9. 把柱子放到1.5mL 离心管。
垂直加10μL L M-Elution M-Elution M-Elution buffer buffer 到柱子基质。
全速离心30s 洗脱DNA 。
二． PCR 扩增反应模板：重亚硫酸盐修饰的Blank 、Cya 基因组DNA 引物引物上游：CTCAAGCTTCGAA TTTTTTTA TAAGAAGAAGA TA TAG 下游：TAGA TCCGGTGGA TCAAAACTCCACCACAAACCACTT 目的片段长度：476bp 1. 操作步骤：操作步骤：反应体系反应体系模板模板 0.5μL 10×KOD plus buffer 5μL dNTPS Mixture （2.5mM each ） 5μL Mg 2+ 4μL 上游引物上游引物 3μL 下游引物下游引物 3μLDMSO 4μL KOD plus 酶 2μL ddH 2O 23.5μL Total 50μL 反应条件：反应条件：1）95℃ 3min2）95℃ 25s ；48℃ 15s ；72℃ 45s 。