酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
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酵母单Байду номын сангаас交
酵母双杂交.三杂交
其中第一个融合蛋白由两部分组成，一部分为能 结合lexA启动子的DNA结合结构域，另一部分为噬菌 体衣壳蛋白MS2。第二个融合蛋白也由两部分组成， 一部分为能激活lexA启动子的转录激活结构域，另一 部分为有待研究的RNA结合蛋白“Y”。
这两个融合蛋白通过第三个融合的RNA分子相连，其一 端为含有噬菌体衣壳蛋白MS2结合位点的MS2RNA，另 一端为有待研究的RNA“X”。一旦“X”和“Y”能有相互 作用就使得这个复合物形成一个功能性的转录激活因 子，从而使得下游的LacZ基因和His3基因得以表达。 LacZ基因的表达水平能够通过在体外检测β半乳糖苷酶 的活性来确定,His3基因的表达赋予了酵母细胞在缺乏 组氨酸的培养基上生存的能力。通过缺陷培养基及β半 乳糖苷酶的活性的测定就能判断在酵母菌内是否发生 了RNA“X”和蛋白质“Y”的相互作用。
negative selection by adding FOA)
酵母双杂交操作主要流程
1. 分别构建BD和AD融合蛋白载体
BD
2. 分别将重组载体转化酵母菌细胞
BD
3. 对酵母转化子进行自激活检测
AD AD
酵母单、双杂交PPT
Amp抗 评 价及 鉴定分装 及冻存诱饵质粒构建流程
目 的 基 因 合 成
载目
重
体的
组
的片
鉴
连段
定
接与
重 组 质 粒 纯 化
诱饵质粒 自激活 及细胞质 定位检测
自激活检测 （排除bait蛋白可 与myristlyation
signal结合）
细胞质定位检测 （用于验证Sos-bait
信号(Myr) ，加入galactose可诱导表达
Sos蛋白介导的双杂交系统原理
人类Sos蛋白和所研究的基因融合而成诱饵蛋白。靶蛋白上连有一 个十四烷基化（Myristylation）膜定位信号，它使靶蛋白锚定到细 胞膜上。诱饵和靶蛋白的相互作用使人类Sos蛋白在酵母细胞膜上定 位，从而激活Ras信号转导级联反应（cascade）。
细胞信号传导研究
通过细胞内一系列蛋白 质间的相互作用或蛋白质与 其它分子间的相互作用完成 的
5 Part
赛尔生物酵母单、双杂交技术服务
酵母单、双杂交验证实验
基因克隆的获得
及DNA测序检验
1
每个基因克隆的酵母
双杂交自激活检验
3
赛尔 生物
基因的酵母单、双杂交
2
载体构建及其DNA测序
检验
酵母细胞内的蛋白-蛋
酵母菌株标志性表型的鉴定
确
定
酵 母 菌 表 型
营养缺陷 型筛选
Trp(-)、Leu (-) 、 His (-) 、Ura (-) 不能生长，在 YPDA上可以生长
检测 回复 突变
接种于YPDA 培养基， 25℃有菌生长， 37 ℃无菌生长构建流程ds cDNA ＋
连接并转化 XL1-blue 感受态细菌
研究蛋白质之间相互作用的实验方法
研究蛋白质之间相互作用的实验方法一、酵母双杂交系统酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。
其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。
将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。
在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。
Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。
可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。
此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。
二、噬茵体展示技术在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。
此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。
目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。
三、等离子共振技术表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。
它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。
SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。
测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。
四、荧光能量转移技术荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。
酵母三杂交原理
酵母三杂交原理一、引言酵母三杂交是一种常用的实验方法，用于分析酵母菌中基因之间的相互作用和调控关系。
通过将不同株系的酵母菌进行杂交，可以获得新的杂种菌株，从而实现对基因的重组和重构。
本文将详细探讨酵母三杂交的原理、实验步骤以及应用。
二、酵母三杂交的原理2.1 酵母三杂交的基本概念酵母菌是一种单细胞真核生物，其遗传实验相对简单，常用于研究基因的功能和相互作用。
酵母三杂交是一种利用酵母菌进行基因互补和空白突变分析的方法。
通过将三个不同的酵母菌株进行杂交，可以将它们的基因组合到一个单个细胞中，从而观察不同基因之间的相互作用及其对细胞表型的影响。
2.2 酵母三杂交的原理酵母三杂交的原理是基于酵母菌的性接合和染色体重组。
一般来说，酵母菌有两种基本的生殖方式：有丝分裂和无丝分裂。
性接合是无丝分裂的一种方式，通过两个异性酵母细胞的融合，将两个细胞的核融合成一个新的细胞，形成杂交菌株。
在酵母三杂交中，将三个不同的酵母细胞进行融合，得到一个新的三杂交菌株。
在酵母三杂交中，通常会选择一个带有“杂交质粒”的酵母菌株A作为交叉突变型（crossing strain），分别选择两个突变株B和C作为配子型（mater and father strain）。
杂交质粒中含有可以与配子细胞融合的片段DNA，从而达到将三个酵母菌细胞核融合在一起的目的。
2.3 酵母三杂交的基本步骤酵母三杂交的基本步骤包括：酵母菌的预处理、杂交过程和杂交菌株的筛选。
2.3.1 酵母菌的预处理•培养酵母菌株A、B和C，使其处于活跃生长期。
•收集适量的酵母细胞，并进行适当的稀释。
2.3.2 杂交过程1.将等量的A、B和C菌液混合在一起。
2.在杂交液中，通过震荡或低速离心等方式促使酵母细胞发生融合。
3.融合后，定量地分别取适量的杂交液涂布于含有适当培养基的培养皿上。
2.3.3 杂交菌株的筛选1.在杂交菌株的培养皿上，筛选出带有杂交特征的菌落。
2.通过进一步的筛选和分析，确定杂交菌株是否满足实验需求。
验证蛋白互作的方法
验证蛋白互作的方法生物学研究中，蛋白质互作是一个重要的研究领域，因为它关系到生命体的许多生物学过程如细胞周期、细胞信号转导、细胞凋亡等。
蛋白质互作研究的目的是了解蛋白质之间的相互作用，以及这些作用对于生物体内功能的影响。
为了获得这些信息，科学家们需要开发一些工具和技术来研究蛋白质之间的相互作用。
本文讲述了几种常用的蛋白互作验证方法。
一、酵母双杂交（Y2H）法酵母双杂交法是最常用的蛋白质互作验证方法之一。
由于其名称中含有“双杂交”，因此可以理解为将两个蛋白质“杂交”在一起，然后观察它们是否相互作用。
首先，将两个蛋白质分别构建成两个不同的来源的表达向量。
然后，在酵母细胞中，将这两个表达向量分别与GAL4激活子和GAL4结合蛋白相连，形成一个杂交蛋白。
如果这两个蛋白质发生相互作用，它们将结合并形成GAL4转录激活子，从而激活报告基因进行表达。
最终，研究人员可以通过观察转录活性的变化来判断这些蛋白质之间是否存在相互作用。
虽然酵母双杂交法是一种比较简单的技术，但有一些潜在问题需要研究人员注意。
首先，该方法只能检测蛋白质之间的直接相互作用，无法检测多个蛋白质之间的复杂相互作用。
其次，酵母细胞内的反应条件与活性可能与真实环境中相差很大，这可能导致结果的误判。
二、共免疫沉淀法（Co-IP）共免疫沉淀法是一种可以定量检测蛋白质相互作用的技术。
它的原理是将两个蛋白质在细胞内共同表达，并通过特异的抗体沉淀来寻找这两个蛋白质之间的相互作用。
具体来说，将目标蛋白质和其交替作用的伴侣蛋白质在细胞内共同表达。
然后，通过特异的抗体与其中一个蛋白质发生特异性结合，可以选择性地沉淀出另一个蛋白质。
最后，通过Western blot等技术检测被沉淀下来的伙伴蛋白的数量。
如果目标蛋白质和其伴侣蛋白相互作用，那么其它蛋白质沉淀下来时就会被一同检测到。
这种方法可以用来研究多个蛋白质相互作用的情况，还能够定量地衡量它们之间的相互作用强度。
不过该方法对于选择适当的抗体是非常准确的，因此需要仔细设计和验证实验条件来确保免疫沉淀过程的特异性和有效性。
酵母三杂交原理
酵母三杂交原理
酵母三杂交原理
酵母三杂交是一种常用的遗传学实验方法，用于研究基因互作关系和基因功能。
其原理主要涉及到酵母菌的杂交、选择和分析等方面。
1. 酵母菌的杂交
酵母菌的杂交是指将两种不同的酵母菌株进行配对，使它们在一起进行生殖过程，从而形成新的细胞。
这个过程需要满足以下条件：
（1）两个亲本细胞必须处于相同的生长状态，如都处于对数生长期。
（2）两个亲本细胞必须具有不同的配型，如一个为MATa型，另一个为MATα型。
（3）两个亲本细胞必须能够形成接触并融合成一个新细胞。
经过这样的杂交过程，可以得到一个新的酵母菌细胞，其中包含了来自父本和母本的染色体片段和基因序列。
2. 选择
在进行酵母三杂交时，需要通过选择筛选出满足条件的重组子代。
通
常采用营养缺失法进行选择。
即将培养基中某种营养成分去除，使只
有满足条件的重组子代才能生长。
例如，如果将亮氨酸去除，则只有
合成亮氨酸的重组子代才能生长。
3. 分析
在选择出满足条件的重组子代后，需要对其进行分析，以确定基因型
和表型等信息。
常用的方法包括：
（1）分离单倍体：将重组子代进行孢子化处理，得到单倍体细胞，并通过交配实验进一步确定基因型。
（2）PCR检测：采用特定引物对目标基因进行扩增，从而确定其存在与否。
（3）表型分析：观察重组子代在不同条件下的表现形态和功能特征等。
总之，酵母三杂交是一种常用的遗传学实验方法，通过杂交、选择和
分析等步骤揭示了基因互作关系和基因功能。
酵母双杂交的原理
酵母双杂交的原理
酵母双杂交(YeastTwo-hybridSystem，Y2H)是一种具有实验性方法的蛋白质相互作用实验，它可以用来验证和确定两个蛋白在体内及体外之间存在相互作用。
这种蛋白质相互作用可以发生在体内，也可以发生在体外。
在这种实验中，使用的物质是由两个融合的蛋白质组成的双融合蛋白，一个蛋白是结合调控区或结合位点，另一个蛋白质是响应元件，它可以检测到调控区里结合的物质的存在，从而启动一系列的反应，其结果是显示双杂交蛋白中调控区是否与响应元件相结合。
二、酵母双杂交的原理
酵母双杂交的基本原理源于酵母菌的基因调控机制。
它的基本原理是，将一个结合调控区的蛋白（称为“结合蛋白”）与一个响应元件（称为“受体蛋白”）结合起来，当结合蛋白结合到调控区并激活响应元件时，酵母细胞就会对外在的细胞因子做出反应。
当结合蛋白结合调控区并激活响应元件时，酵母细胞就会产生一种光变化，从而表明蛋白质之间存在相互作用。
简单地说，酵母双杂交的原理是利用双融合蛋白将一个结合调控区的蛋白和一个响应元件结合在一起，当结合调控区的蛋白结合到结合调控区时，响应元件就会激活，酵母细胞就会产生一些外在细胞因子，如光变化。
从而可以检测到蛋白质之间发生相互作用。
三、酵母双杂交的应用
酵母双杂交技术的应用非常广泛，可以用来验证和确定蛋白质之
间的相互作用，也可以用来研究蛋白的结构和功能，并有助于发现新的药物靶标。
此外，它也可以用于研究基因调控机制，研究染色体的结构，以及研究蛋白质和核酸之间的相互作用等。
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综上：酵母双杂交系统通过两个杂交
蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基 因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致
步骤为: 1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵 (bait)，将其与DNA结合域融合，构建成
诱饵质粒。 2、将待筛选蛋白原理用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因
子。研究表明GAL4 的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构
，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)；而转录激活结构域
可与RNA 聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA 聚合酶的活性
。在这一过程中，DNA 结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发
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The End
Thankyou
表达载体上,在酵母中表
达两者的融合蛋白。
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如果诱饵蛋白和靶蛋白能够相互作用，那
么GAL4 DNA 结合结构域和GAL4激活 结构域就会相互作用，从而激活lacZ报 道基因的表达。所以我们可以通过转化
的酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白是 否有相互作用。
道株 具有许多优点: 〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒。 〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特
征性报道基因。 〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳
动物的蛋白结合
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根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与
已知蛋白质Bait protein的基因构建在 同一个表达载体上，在酵母中表达两者
的BD-Bait protein融合蛋白。将
激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启 动子，使启动子下游基因得到转录。
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酵母双杂交
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酵母双杂交系统的另一个重要的元件
报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)
的重组质粒的宿主细胞。 最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报
基因之间功能相关的主要方法。
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2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用
利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是 利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相 互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质 与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应 则可以通过酵母双杂交进行检测。
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•
在酵母双杂交的基础上，又发展出了 酵 母单杂交、酵母三杂交和酵研究 和两种蛋白相互作用的结构和位点。
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•
酵母单杂交技术最早是从酵母双杂交技术发展
而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行 检测以实现对蛋白质间相互作用的研究，而酵母单 杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA、 蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表 达调控。
挥作用。
•
据此，我们可将GAL4 的A结合结构域置换为其他蛋白，只要他
能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活
结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。
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•
正是基于这一理论，酵母单杂交系游报告基因的报告质粒.
•
首先将报告质粒整合入酵母基因组,产生带有目
的对报告基因的表达将蛋白的基因筛选出来.精品课件
•
酵母三杂交系统的原理与酵母双杂交相似
，利用了酵母细胞的GAL4蛋白调节目的基因(半乳糖 苷酶基因及His3基因)转录的特点。GAL4蛋白具有两 个可分离的功能区，N端是DNA结合结构域，C端为转 录激活结构域。只要这两个相对独立的结构域能够 通过一定的方式在空间上足够的靠近(如借助其他分 子的相互结合使其足够靠近)，即使它们之间没有共 价结合也可激活转录，这为研究蛋白质与其他分子 的相互作用提供了可能。
酵母双杂交
• 是在真核模式生物酵母中进行的，研究活 细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微 弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的 表达产物敏感地检测得到，它是一种具有 很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术 。
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酵母双杂交系统的建立是基于对真核 生物调控转录起始过程的认识。细胞
起始基因转录需要有反式转录 激活因子的参与
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3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白 质之间相互作用的影响
酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋 白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可 以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗 疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾 病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（ NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETAimportin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术 找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到 相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻 止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。
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•
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这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4， 又不能合成ADE、 HIS 、LEU、TRP，因此，酵母在 缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两 种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重 建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基 因ADE、 HIS、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和 显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株 中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中
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•反式转录激活因子 结构上是
组件式的， 即这些因子往往由两个或
两个以上相互独立的结构域构成， 其
中有DNA结合结构域(DNA binding
domain， 简称为BD)和转录激活结构
域(activation domain， 简称为AD)
。
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• 这两个结合域将它们分开时仍分别具有功 能，但不能激活转录，只有当被分开的两 者通过适当的途径在空间上较为接近时， 才能重新呈现完整的转录因子活性，并可
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3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转 录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能 与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用， 则可激活报告基因的转录；反之，则不能 。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到
新的蛋白质。
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• 酵母双杂交系统的应用
• 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能
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这两个融合蛋白通过第三个融合的RNA分子相连，其一端为 含有噬菌体衣壳蛋白MS2结合位点的MS2RNA，另一端为有待 研究的RNA“X”。一旦“X”和“Y”能有相互作用就使得 这个复合物形成一个功能性的转录激活因子，从而使得下 游的LacZ基因和His3基因得以表达。LacZ基因的表达水平 能够通过在体外检测β半乳糖苷酶的活性来确定,His3基因 的表达赋予了酵母细胞在缺乏组氨酸的培养基上生存的能 力。通过缺陷培养基及β半乳糖苷酶的活性的测定就能判 断在酵母菌内是否发生了RNA“X”和蛋白质“Y”的相互作 用。
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•
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上图显示了酵母三杂交系统的原理。在酵母三杂交 •系统，lexA启动子调控下游LacZ基因和His3基因的 表达，而lexA启动子的激活取决于DNA结合结构域 和转录激活结构域能否在空间上相互靠近。
其中第一个融合蛋白由两部分组成，一部分为 能结合lexA启动子的DNA结合结构域，另一部分为 噬菌体衣壳蛋白MS2。第二个融合蛋白也由两部分 组成，一部分为能激活lexA启动子的转录激活结构 域，另一部分为有待研究的RNA结合蛋白“Y”。
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4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图
众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此 协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着 功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多 新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将因之间的联系，建立基因组蛋 白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、 代谢途径等有重要意义
•
当从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-
LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并
对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物
学功能上的联系。
•
另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知