甲壳动物抗菌肽研究现状及前景

http://www.paper.edu.cn - 1 - 甲壳动物抗菌肽研究现状及前景1 赵大显，张浩，吴萍，陈立侨 华东师范大学生命科学学院，上海 （200062） E-mail：Lqchen@bio.ecnu.edu.cn 摘 要：抗菌肽是一种具有抗菌活性的生物短肽，广泛存在于生物界中，是动物非特异性免疫系统的重要组成部分。本文主要介绍了甲壳动物抗菌肽的来源和种类、基因克隆和表达调控等方面的研究概况，并分析了其在水产养殖中的应用前景及存在的问题。 关键词：抗菌肽；甲壳动物；免疫系统

甲壳动物养殖在全世界水产养殖业中占有极其重要的地位，2004年，在世界水产品生产总值中，甲壳动物总重量虽仅占6.19 %（约3.68 百万吨），但总价值中却占到了20.4 %（约1.44 百亿美元）[1]。伴随着养殖业的迅猛发展，甲壳动物的病害也呈上升趋势，由细菌、病毒等引起

的病害往往造成严重的经济损失[2-5]，甲壳动物的病害防治，至今仍是水产界面临的难题之一。使用抗生素虽可部分地解决这一问题，但大量使用抗生素，会破坏养殖水环境和甲壳动物体内的微生态平衡，导致某些病原体产生耐药性，进而对人类的健康构成潜在性威胁[6]。因此，寻

求高效、环保的甲壳动物病害防治方法及防治药物，一直是人们努力的方向。近年来，随着甲壳动物防卫机制研究的不断深人，采用免疫学方法防治甲壳动物病害不仅成为了可能，而且已取得了初步的成效。 甲壳动物缺乏特异性的免疫系统，它们的免疫防御主要由细胞和体液免疫系统所组成，通过血细胞或淋巴细胞的吞噬、包囊作用排除异己的微生物和病原体。抗菌肽(antimicrobial peptide，AMP)作为其中一种免疫因子在生物中广泛存在，它是在外界条件刺激下，生物免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的具有免疫活性的多肽物质，是脊椎动物、无脊椎动物和植物先天性免疫的关键因子，原核生物、动物、植物都可以产生由体内基因编码，在特定细胞中合成的抗菌肽[7]。自Steiner等[8]在天蚕(Hyaophora cecropia)中发现可诱导的抗菌肽至

今，已发现的抗菌肽种类超过700种[9]。近年来，甲壳动物的抗菌肽已成为人们研究的又一热点。已有研究结果表明，甲壳动物抗菌肽具有广谱抗细菌和抗真菌功能及独特的作用机理[10-13]，在医学和农业上具有潜在的应用价值，极有可能成为抗菌、抗病毒及抗肿瘤药物的新来源。本文就其来源和种类、基因克隆和表达、分子文库建立等方面进行概要的综述，以期为甲壳动物免疫学研究和甲壳动物病害防治提供参考。

1 甲壳动物抗菌肽的来源和种类 甲壳动物的抗菌肽大部分属于小分子肽，种类繁多，结构和组成也复杂多样。其来源主要是甲壳纲的虾、蟹等。蟹类中，目前的研究大多集中在海水种类，但已报道的种类不多，研究

1本课题得到高等学校博士点专项基金(20040269011)；上海市科委基础重大专项(06DJ14003)；浙江省重大科技

攻关项目(2005C12006－01，2006C12005)；国家自然科学基金（30771670）部分的资助。 http://www.paper.edu.cn - 2 - 的也不是很深入，而在淡水种类如中华绒螯蟹中还未见相关报道。Schnapp等[14]从青园蟹(Carcinus maenas)的血细胞中分离到3种具有杀菌作用的肽，属于crustins家族；Jayasankar等[15]

从锯缘青蟹[Scylla serrata (Forska1)]精液分离到一种能抑制常见海洋细菌，分子量为20 ku的抗菌肽。首次报道了无脊椎动物精液中含有抗菌肽。遗憾的是，没有进行序列测定的研究工作报道。Khoo等[16]从蓝蟹（Callinectes sapidus）血细胞中分离到3.7ku，抗E.coli活性的抗菌肽—

Callinectin，并测定其部分氨基酸序列，发现其氨基末端富含脯氨酸。然而其脯氨酸的排列与其他富含脯氨酸的抗菌肽不同，与已知抗菌肽同源性弱。与蟹类相比，虾类中已研究的种类相对就比较多，研究的也比较的深入，可以为蟹类的相关研究提供很好的参考。Song等[17]发现罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)受感染或受伤后体内也会产生类似杀菌肽的物质；南美白对虾(Penaeus vannamei)的抗菌肽Penaeidins是目前研究得比较清楚的，1997年Destoumieux等[18]从养殖的南美白对虾的血细胞和血浆中分离出3种抗菌肽类， 分别命名为Pen-1、Pen-2和Pen-3，Mr为(5.48-6.62)×103，成熟肽含有58-62个氨基酸残基，与大多数抗菌肽一样，分子结构中有较多

的阳离子，N-端富含脯氨酸，C-端由3个分子内二硫键来维持稳定，并对其编码基因进行了cDNA克隆和测序,首次报道了甲壳动物抗菌肽氨基酸全序列。自Destoumieux等发现Penaeidins以来，研究者通过表达序列标签(EST)分析和序列同源性研究，还在大西洋白对虾(Litopenaeus setiferus)[19，20]、斑节对虾(Penaeus monodon)[21] 、中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)[22] 和日本

对虾(Penaeus japonicus) [23]等甲壳动物中发现有Penaeidins存在。其他几种甲壳类抗菌肽也具有

与Penaeidins相似的性质。由于家族成员的不断增加，目前已有专门的Penaeidins数据库（PenBase）来收录不同虾类的Penaeidins[24]，不但可以对Penaeidins的研究进行统一的规范,而且可以为其他类型的抗菌肽研究提供很好的参考。

2 甲壳动物抗菌肽的基因克隆和重组表达 尽管抗菌肽功能显著，应用前景广阔，但天然抗菌肽产量很低，无法从动植物体内大量提取；而化学合成肽价格昂贵。因此，利用基因工程技术生产抗菌肽就成为必然选择。目前的研究主要集中在抗菌肽基因的克隆和表达，利用蛋白操作技术平台进行收集和提纯。 迄今，国内外已分离鉴定了100多种抗菌肽，并对许多抗菌肽进行了cDNA克隆测序， 多种抗菌肽已获得了原核和真核表达。Pikul等[25]应用EST技术克隆了淡水小龙虾Pacifastacus

leniusculus 三种不同甲壳素（crustin）基因的cDNA序列。Hauton等[26]应用简并PCR和RACE技

术克隆了欧洲龙虾 Homarus gammarus crustin-like 基因的cDNA序列。Chiou 等[27]应用简并PCR和RACE技术克隆了斑节对虾（Penaeus monodon） panaeidin-like基因的cDNA序列。Kang等[28]

应用简并PCR和RACE技术克隆了中国对虾 Fenneropenaeus chinensis Ch-penaeidin基因的cDNA序列。Pierce等[29]采用融合蛋白方法， 在大肠杆菌中表达了鲎血细胞抗菌肽Polyphemusin的类

似物rLiml，rLiml具有与天然抗菌肽相似的活性，在8-12 µg／mL的浓度条件下可以对牡蛎的一种寄生原虫Perkinsus marinus产生明显的抑制作用；Destoumieux等[30]将南美白对虾抗菌肽Panaeidins的编码基因克隆到酿酒酵母中进行表达，产物浓度可达到1 mg／L，尽管与天然抗菌肽在结构上有一些差异，但具有相似的杀菌活性。Brockton等[31]对青园蟹（Carcinus maenas）抗菌肽carcinin基因的特性，异构和重组表达进行了研究，应用RACE技术克隆cDNA全长，发现其与无脊椎动物的防御素基因结构相似，在融合细菌系统表达产生的重组蛋白具有抗菌活性。http://www.paper.edu.cn - 3 - Li等[32]采用甲醇酵母系统对Ch-Penaeidin进行了表达，获得一种6.1kDa的重组肽rCHP。在最适表达条件下，rCHP的分泌量为108 mg／L，比啤酒酵母表达系统的产量(几个mg／L)高十几倍。 除了基因克隆，近年的研究重点正在向建立水生动物免疫特异性cDNA文库和表达序列标签(EST)方面转移，这将有助于发现更多的抗菌肽基因。Gross等[33]从2种白对虾的EST库中发现了

44个免疫功能相关基因，全部免疫EST中，属于抗菌肽的EST数量占总量的60％以上。Bartlett等[34]对南美白对虾和大西洋白对虾血细胞的cDNA文库的EST进行了分析，发现crustin cDNA序列编码一种带有一个信号肽、N-端为富含疏水性氨基酸重复区、C-端类似青园蟹crustin的蛋白质。Vargas等[35]从南美白对虾血细胞cDNA文库中分离到6个crustin编码克隆，它们均编码一种

由163个氨基酸残基组成的蛋白，N-端为4个六肽重复的富含甘氨酸区域，之前含有一个由18个氨基酸组成的信号肽，之后为C-端区域，C-端区域中含有l2个半胱氨酸残基和一个WAP结构域。Supungul等[36]应用EST方法在斑节对虾中发现了一类crustins的同系物，它们在各种组织中均表

达，但血细胞是它们的主要表达场所。Rattanaehai等[37]在日本对虾血细胞的cDNA文库和PCR扩

增中观察到5种crustin样肽的cDNA，以crustin-1的含量最丰富，其cDNA由679个核苷组成，ORF由573个碱基对组成，编码一个由191个氨基酸残基组成的肽。由此可见抗菌肽的种类数目非常庞大，在甲壳动物中的分布也十分广泛。可以预期，随着将来与水生动物抗菌肽相关的组织文库和蛋白表达谱的建立，加上基因工程技术的发展，表达和利用抗菌肽基因将是十分方便的事情。

3 甲壳动物抗菌肽合成和储存部位 甲壳动物抗菌肽主要存在于血浆或血细胞中。Destoumieux等[38]用Northern blot分析方法和免疫组织化学等方法，系统研究了凡纳对虾抗菌肽合成和储存的部位，结果表明penaeidin在血细胞中是以组成型合成，并贮存于颗粒细胞或半颗粒细胞的细胞质中，不存在于透明细胞中。同时研究微生物刺激对penaeidin表达的影响，结果发现细菌免疫3 h后，循环血细胞中penaeidin mRNA水平明显下降，12 h后恢复到起始水平，24 h后有轻微上升，但未达到统计学显著水平，这清楚表明微生物免疫刺激不会增强血细胞中penaeidin合成水平。而血浆penaeidin mRNA在免疫刺激后3 h显著增高，6 h达到最高，24 h后血浆中penaeidin mRNA含量与起始相近，这种变化可能免疫刺激后血细胞被吸引到免疫感染部位有关。由此可以得出，penaeidin在血细胞中合成，并贮存于颗粒细胞中，当受到刺激后，释放到血浆中。这些研究奠定了penaeidin在对虾防御系统中的地位，同时也为研究甲壳动物其他抗菌肽提供了一条思路。