金黄色葡萄球菌检验 ppt课件
金黄色葡萄球菌的分离培养试验
实验 金黄色葡萄球菌的分离培养
一．实验目的；
1． 掌握 Baird-Parker 培养基的配制方法
2． 掌握利用选择性培养基分离金黄色葡萄球菌的检验方法 二．实验内容
1 原理；
Baird-Parker 培养基在含有氮源的基础上，补充了促进细菌生长的丙酮酸钠，又含有 抑制剂：亚碲酸钾， 故有较好的选择性。 但对于金葡萄球菌没有抑制， 其能将亚碲酸钾还原 为碲在菌落中心呈黑色， 易于观察； 加入卵黄，由于卵磷酯酶阳性特征，其菌落周围可出现 明显的沉淀环。
利用选择性培养基进行常见致病菌的分离是致病菌检测中的重要部分。
2 仪器与试剂
250ml 三角瓶 灭菌锅 量筒
Baird-Parker 氏培养基、亚碲酸盐卵黄增菌液、 7.5%氯化钠肉汤
3 操作步骤
3.1 培养基配制
Baird-Parker琼脂培养板：称取58克干粉，加热溶解于950ml蒸馏水中,分装每瓶 95ml,
121 C高压灭菌15分钟,冷至50C左右,于每95 ml加入常温解冻的卵黄亚碲 酸钾增菌剂
5 ml ，摇匀后倾入无菌平皿。
7.5% 氯化钠肉汤 （蛋白胨 10g 牛肉膏 5g 氯化钠 75g 蒸馏水 1000mlph7.4 ）将上述成分加热 溶解，调节pH,分装，每瓶225 mL, 121 C高压灭菌15 min。
3.2 增菌及分离培养
3.2.1挑取金黄色葡萄球菌接种于 7.5%NaCI肉汤培养基内，置于（37C）恒温箱中培养6-8h.
3.2.2将上述培养物，分别划线接种到 Baird-Parker 平板，于36 C± 1 C培养18 h〜24
h 或 45 h 〜48 h。
3.3 观察菌落形态
4、结果判定 根据菌落形态，鉴别检样中细菌种类
三、实验结果实验 金黄色葡萄球菌的染色镜检
一．实验目的 ; 掌握细菌革兰氏染色方法；在显微镜下观察金黄色葡萄球菌的形态。 二．实验内容
1 原理 ; 革兰氏阳性菌经结晶紫染色乙醇脱色后，仍为紫色，而革兰氏阴性菌被复染为其 他颜色。
金黄色葡萄球菌检验步骤
.
金黄色葡萄球菌检验步骤
一.设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃ 。
2 冰箱：2 ℃ ~5 ℃ 。
3 恒温水浴箱：37 ℃±1 ℃ 。
4 天平：感量0.19 。
5 均质器。
6 振荡器。
7 无菌吸管：1 mL （具0.01mL 刻度）、10mL （具0.lmL 刻度）或微量移液器及吸头。
8 无菌锥形瓶：容量100 mL 、500 mL 。
9 无菌培养皿：直径90 mm 。
10 注射器：0.5 mL 。
11 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
二、培养基和试剂
1 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤
2、7.5%氯化钠肉汤
3 血琼脂平板
4 Baird - Parker 琼脂平板
5 脑心浸出液（BHI）肉汤
6 兔血浆
7 磷酸盐缓冲液
8 营养琼脂斜面
9 革兰氏染色液
10 无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中，121 ℃ 高压灭菌15 min 。
11 1 mol/L 氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠（NaOH ）溶于1 000 mL 蒸馏水中。 12 1 mol/L 盐酸（HCL ) : 37 ％浓盐酸90 mL ，加蒸馏水到1 000 mL 。 .
操作步骤
5.1 样品的稀释
5.1.1 固体和半固体样品：称取25g 样品至盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min~10 000r/min 均质1 min~2 min ，或放人盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min ~2 min ，制成1 : 10 的样品匀液。
5.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品至盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1 : 10 的样品匀液。
GB 4789.10-2010金黄色葡萄球菌定性检验
GB 4789.10-2010金黄色葡萄球菌定性检验
环凯针对GB 4789.10-2010标准的修改，扩充完善了微生物检测试剂，推出了成套的金黄色葡萄球菌定性检验解决方案，为生产企业提供方便。
GB 4789.10-2010 金黄色葡萄球菌定性检验流程图
功能阶段 实验序号 产品序号 产品名称 规格 类别
增菌 1 024052 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤 250g 瓶（干粉）
CP0690G 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤 10mL×20支 盒（管装）
CP0690 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤 225mL×10袋 盒（袋装）
2 024010 7.5%氯化钠肉汤 250g 瓶（干粉）
CP0700 7.5%氯化钠肉汤 225mL×10袋 盒（袋装）
平板分离 3 024060 血琼脂基础 250g 瓶（干粉）
024070 血平板（成品培养基） 90mm×20 盒（平板）
4 024040 Baird-Parker琼脂基础 250g 瓶（干粉）
029190 卵黄亚碲酸钾增菌液
每支添加47.5 ml基础培养基中 10支/盒 盒（西林瓶）
024040A Baird-Parker琼脂平板 90mm×20 盒（平板）
生理生化 5 024053 脑浸出液肉汤（BHI） 100g 瓶（干粉）
6 029180 冻干血浆 10支/盒 盒（西林瓶）
7 022020 营养琼脂 250g 瓶（干粉）
CP0150 营养琼脂（斜面） 20支/盒 盒（管装）
8 029010 革兰氏染色液 10mL×4支 盒
金黄色葡萄球菌检测方法
金黄色葡萄球菌检测方法
一．材料与方法
1、材料
①培养基：7.5%NaCl肉汤培养基，血琼脂平板培养基（按常规方法制作）
②试剂：7.5%NaCl肉汤培养基，革兰氏染色，血琼脂平板，Baird-Parker琼脂平板，生理盐水，兔血浆（1：4），
③器材：温箱，显微镜，天平，均质器，载玻片，L型涂片棒，三角瓶，刻度吸管，平皿，试管及试管架，研磨，1ml注射器，
④实验动物：健康的小白鼠
2、方法
待检样品25g+225ml灭菌生理盐水
│
┌─────┴─────┐
直接计数法 增菌培养方法
↓ ↓
Baird-Parker琼脂平板 7.5%NaCl肉汤培养基
↓ ↓
血平板 血平板
└─────┰─────┘
↓
┌─────┰─────┰──────┐
↓ ↓ ↓ ↓
涂片染色镜 溶血观察 动物接种试验 血浆凝固试验
└─────┴──┯──┴──────┘
↓
报告
1、样品的采集
称取25g火腿肠，切碎搅匀（用灭菌研钵研磨），置于250ml锥形瓶中，加入225ml灭菌生理盐水，制成1：10样品混悬液，混匀后作用20分钟，随机取10ml离心。
2、增菌及分离培养
①增菌培养方法：吸取5ml上清液，接种于7.5%NaCl肉汤培养基内，置于（37±1℃）恒温箱中培养24h，划线接种入血平板，（37±1℃）恒温箱中培养24h。
②直接计数方法：吸取上述悬液，进行10倍递增稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液各1ml，分别加入3个Baird-Parker琼脂平板，每个平板的接种量分别为0.3ml、0.3ml、0.4ml。用灭菌L型涂布棒涂布整个平板，置于（37±1℃）恒温箱中培养24h。之后分别对3个平板上生长的周围有浑浊带的黑色菌落进行计数。转接入血平板，（37±1℃）恒温箱中培养24h。
金黄色葡萄球菌的测定
金黄色葡萄球菌的测定
1 卫生学意义
金黄色葡萄球菌定性检验（增菌培养法）：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。
2 检验方法
2.1 术语与定义
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为一种革兰氏染色阳性球形细菌。显微镜下排列成葡萄串状，金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜。是常见的引起食物中毒的致病菌。常见于皮肤表面及上呼吸道黏膜。
2.2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
（1）恒温培养箱：36℃±1℃。
（2）冰箱：2℃～5℃。
（3）恒温水浴箱：37℃～65℃。
（4）天平：感量0.1g。
（5）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
（6）无菌锥形瓶：容量100mL、500mL。
（7）无菌培养皿：直径90mm。
（8）pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2.3 培养基和试剂
（1）7.5%氯化钠肉汤
1）成分：蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0g；氯化钠：75g；蒸馏水：1000mL；pH：7.4；
2）制法：将上述成分加热溶解，调节pH，分装，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。
（2）B－P琼脂平板
1）成分：胰蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0 g；酵母膏：1.0g；丙酮酸钠：10.0g；甘氨酸：12.0g；氯化锂（LiCl·6H2O）：5.0g；琼脂：20.0g；蒸馏水：950mL；pH：7.0±0.2
2）增菌剂的配法：30%卵黄盐水50mL与经过除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL
混合，保存于冰箱内。
3）制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH。分装每瓶95mL，121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，每95mL加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h。
金黄色葡萄球菌检验原理
金黄色葡萄球菌检验原理
金黄色葡萄球菌检验的原理是通过培养和鉴定来确定细菌是否为金黄色葡萄球菌。具体步骤如下：
1. 培养：将样本在含有富含营养物质的培养基上进行培养。金黄色葡萄球菌在常见的琼脂培养基上能够快速生长并形成典型的黄色菌落。
2. 鉴定：通过一系列的生化反应和特征性实验来确认细菌的身份。金黄色葡萄球菌一般具有以下特征：
- 革兰氏染色：呈阳性，即菌体呈紫色。
- 非运动性：无鞭毛或鞭毛不活跃。
- 产生黄色色素：金黄色葡萄球菌能够产生一种特殊的黄色色素，使得菌落呈现金黄色。
3. 确认：通过进一步的检测，如凝胶酶试验和DNA鉴定等，来进一步确认菌株是否为金黄色葡萄球菌。
金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌，可以引起多种感染，如皮肤感染、呼吸道感染和食物中毒等。通过对其进行准确快速的检验可以帮助医生进行针对性治疗和控制传播。
金黄色葡萄球菌
葡萄球菌（ staphlococcus）是常见的化脓性球菌，寄生在大多数人的皮肤上，常引起皮肤、软组织感染，细菌可侵入淋巴管及血液，引起危及生命的败血症及严重的转移性感染如心内膜炎、关节炎、骨髓炎、肺炎、脑膜炎等。某些金葡菌可产生毒素，引起皮疹或多系统功能障碍，如中毒性休克综合征。凝固酶阴性的葡萄球菌，特别是表皮葡萄球菌，是院内感染的重要致病菌，腐生葡萄球菌是泌尿道感染的常见致病细菌。
【病原学】
葡萄球菌属微球菌属，革兰阳性球菌，呈葡萄状排列，故名为葡萄球菌。已知葡萄球菌属有20余种，造成人群感染者有10多种，其中金葡菌、表葡菌及腐生性葡萄球菌（腐葡菌）为常见致病菌。此外溶血性葡萄球菌、糖发酵葡萄球菌、人葡萄球菌等也可致病，但很少见。葡萄球菌可用噬菌体、血清、生化反应、对抗生素的敏感性及质粒指纹图谱等方法分型。大多数金葡菌可为噬菌体裂解，表葡菌对噬菌体不敏感，故噬菌体分型仅用于金葡菌。此种分型对流行病学调查，追踪传染源、研究型别与感染种类及耐药性等有重要价值。金葡菌的致病性最强，主要因其产生多种毒素和酶有关。
【流行病学】
葡萄球菌为院内感染的重要致病菌。金葡菌感染多为散发，但金葡菌和表葡菌均可在有大面积皮肤损伤病人居住区如烧伤病房、新生儿病房造成流行。
1.传染源病人和带菌者为传染源。人群带菌情况相当普遍。凝固酶阴性葡萄球菌是皮肤粘膜和下段肠道正常菌群中的一部分，以表葡菌最常见。约70%以上的人鼻腔有金葡菌的短期存在，其中20%～30%的人需长时间才能清除。当局部皮肤屏障破坏时，金葡菌便能在皮肤上寄生并可繁殖。
2.传播途径主要途径是通过污染的手造成人间传播。金葡菌主要经破损的皮肤和粘膜（包括口咽部、肠道、阴道粘膜裂隙）侵入人体；也可因吸入染菌尘埃而致病。
3.易感人群主要是有创口的外科病人、严重烧伤患者、新生儿、老年人、免疫缺陷者、血液病、恶性肿瘤及糖尿病患者，或患流感、麻疹伴肺部病变者。病后免疫力不强，可反复感染。
金黄色葡萄球菌 (牛肉膏蛋白胨培养基)
金黄色葡萄球菌 （牛肉膏蛋白胨培养基）
一、生物学特性
典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。
二.流行病学
金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：
季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品：
食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。
肠毒素形成条件：
存放温度，在37°C内，温度越高，产毒时间越短；
金黄色葡萄球菌 2
1.血浆凝固酶试验：
原理:金黄色葡萄球菌能产生结合型血浆凝固酶，可使血浆中可溶性的纤维蛋白原变为不溶性的纤维蛋白，附着于细菌表面，在玻片上形成凝集颗粒；游离型的血浆凝固酶则可使试管中血浆发生凝固。
大多数致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，而非致病株一般不产生。因此，血浆凝固酶试验是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标之一。葡萄球菌产生的血浆凝固酶有两种，一种是结合凝固酶（用玻片法测试），另一种是游离凝固酶（用试管法检测）。
方法：（1）玻片法：在1张洁净玻片中央加1滴9g／L氯化钠(生理盐水)溶液，用接种环取待检培养物与其混合（设阳性和阴性对照）制成菌悬液，若经10～20s内无自凝现象发生，则加入兔新鲜血浆1环，与菌悬液混合，观察结果。
（如出现颗粒状凝集现象即为阳性。如不立即发生凝集，可稍待一，二分钟，并轻轻摇动玻片，加速反应，若无凝集时则为阴性。）
（2）试管法：用生理盐水将新鲜兔血浆4倍稀释，取0．5ml于试管再加0.5ml待测菌浓菌悬液（需做阳性对照及阴性对照。），混匀后置37℃水浴中，每30min观察1次结果。若3小时内试验管和阳性对照管出现凝固，阴性对照管（即浓菌液管）不凝固，为阳性；若阴性，继续观察到24小时，不凝固者为阴性。
（观察结果，将试管微微倾斜，血浆成冻胶样凝块者为阳性，血浆仍为液状者为阴性。 ）
【结果判断】（1）玻片法：5～10s内出现凝集者为阳性。（2）试管法：如有凝块或整管凝集出现为阳性。4h后无上述现象出现，则放置过夜后再观察。
【注意事项】（1）最好使用EDTA抗凝的兔血浆，因为如果使用枸缘酸盐抗凝血浆会产生假阳性结果（2）玻片法：10秒内观察结果，如超过10 秒可出现假阳性，因此必须用试管法验证凝聚因子试验。
2. 耐热核酸酶试验
原理：致病性葡萄球菌能产生一种耐热核酸酶，它能分解DNA，使含甲苯胺蓝核酸琼脂显示粉红色
玻片法：取融化好的甲苯胺蓝DNA琼脂3ml均匀浇在载玻片上，待琼脂凝固后打上6-8个孔径为2-5mm的小孔，各孔分别加一滴经沸水浴3分钟处理过的待检葡萄球菌和阳性阴性对照葡萄球菌培养物，35℃大气环境孵育3小时，观察有无粉红色圈及其大小。
金黄色葡萄球菌的检验
金黄色葡萄球菌的检验(定性检测)
一．金黄色葡萄球菌的生物学特性
金黄色葡萄球菌革兰氏阳性球菌，直径为0.8-1.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群；无芽孢，无鞭毛、无荚膜、不运动；兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好；大多数菌株产生类胡萝卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，故称金黄色葡萄球菌，营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃，最适生长pH 7.4。普通平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。主要存在于主要为淀粉类(如剩饭、米面、粥等)、牛乳及乳制品，以及鱼、肉、蛋类等。
二、培养基
7.5%的氯化钠（三角瓶135mL）；BP平板培养基；血平板培养基；BHI肉浸液肉汤培养基（试管5个）。
三、金黄色葡萄球菌的定性检测
主要包含四个步骤：样品处理；增殖培养；平板分离培养；鉴定（染色镜检和血浆凝固酶实验）。
1.样品的处理和增殖培养：
样品为冷冻鱼丸，每组称量15g，放于研钵中，用研磨棒捣碎，放于135mL 7.5%的氯化钠肉汤中进行增菌培养，36℃±1℃培养18h～24h后，可观察到金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。
2.血平板划线培养：将样品增菌培养物，用接种环取一环划线接种于血平板上，36℃±1℃培养18h～24h。（每组2个血平板接种增殖样品，1个平板划线接种金黄色葡萄球菌，每组共3个血平板）。
金黄色葡萄球菌在血平板上的菌落特征：菌落较大，圆形，光滑突起，湿润，金黄色（有时为白色），菌落周围为完全透明溶血圈。
3.BP平板划线培养：将样品增菌培养物，用接种环取一环划线接种于BP平板上，36℃±1℃培养18h～24h。（每组2个BP平板接种增殖样品，1个平板划线接种金黄色葡萄球菌，每组共3个BP平板）。
金黄色葡萄球菌在BP平板上的菌落特征：菌落直径2-3mm，颜色从灰色到黑色，边缘为淡色，周围有一浑浊带，其外层有一透明圈，用接种针触碰有奶油树脂的硬度。 3.革兰氏染色镜检(鉴定)：采用革兰氏染色的方法初步判断可疑的菌落是否为金黄色葡萄球菌，每组至少鉴定5个可疑菌落。