2011心血管教案-钙的转运及其测定
1．细胞内钙的分布和相对的恒定
细胞内钙的分布极不均匀，
（1）50％存在于细胞核，
（2）线粒体占30％，
（3）内质网占14％，
（4）质膜占5％
（5）细胞溶质中仅占总钙的0.5％(结合态)或0.005％(离子态)。
细胞在静止(非激活)状态时，细胞溶质Ca2+浓度约为10-7-10-8moI/L，其代表性取值约为0．1 μmo1/L。
内容（基本点、重点、难点）：
基本点：
1.钙在体内的分布、体内钙的来源与去路；
2.钙代谢的研究方法；
3.影响血钙的器官和因素。
重点：
细胞钙的转运及其调节
难点：
细胞膜及细胞内钙泵的转运机制
授课方式（讲授、讨论、实验、演示等）：
讲授，讨论，信息化教学为主
教材、参考书或资料：
参考书：朱妙章，《心血管生理学与临床》，高等教育出版社。
1.心肌细胞呈杆状，横纹清楚且对台盼蓝拒染；
2.在静息状态下，心肌细胞不发生自发性收缩现象；在电刺激作用下，心肌细胞可随电刺激的频率而产生收缩；
3.细胞收缩的方向与细胞的长轴一致或平行；
4.细胞放入实验小室后，立即下沉并与小室低部很快粘附，灌流液的常规速度不能将其冲走。
（四）荧光测定仪的使用
（五）定标
2.影响血钙的器官和因素
（1）影响血钙的器官：
3个主要的靶器官：肾、肠骨
（2）影响因素：性别、年龄、运动、妊娠、激素水平甚至血浆pH或蛋白浓度的改变等均可影响血钙
（3）激素：最重要的激素为PTH, l，25(OH)2D3, CT
此外生长激素、甲状腺素、性激素、前列腺素等也有调节血浆Ca2+的作用。
三、细胞钙的转运及其调节
2．细胞膜及细胞内钙泵的转运体系
Ca2+进入细胞浆内有5条路径：
外钙内流3条
内钙释放2条
（1）外钙内流
1)通过Ca2+通道进入细胞内
2)通过细胞膜进入细胞(Ca2+漏)
3)反向钠-钙交换
（2）内钙释放
1IP3途径
Ryanodine途径
Ca2+离开细胞浆内的路径
Ca2+流出径路主要靠细胞质膜、内质网和线粒体膜等钙转运系统。
第四军医大学研究生课程教案
心血管生理学
课程负责人：裴建明教授
基础部生理学教研室
二○一一年九月
研究生课程教案
课程名称
钙的转运及其机制
课程类型
公共选修课
学时
3
授课时间
2011年9月28日
授课地点
研究生院教学馆第三教室
教员姓名
裴建明
职称
教授
教研室
生理学教研室
教学目的：
1.阐述血钙的转运及其调节；
2.阐述细胞内钙及其转运方式。
（二）指示剂的负载
指示剂的终浓度：如Fura 2-AM为5mol/L，
负载温度：在250C的常温下孵育
负载时间：30-35 min。
负载数量：数量太多浪费指示剂，数量少实验中寻找理想细胞的机会减少另外，若数量过少，细胞可能会发生染料中毒。
负载后：离心并冲洗3遍，以尽可能减少细胞外液中的背景污染。
（三）实验细胞的选择
教 学 内 容
教学设计
钙的转运及其测定
一、概述
1．钙的重要性与体内分布
（1）骨骼、牙齿的主要组成原料
（2）降低毛细血管及细胞膜的通透性，是膜稳定剂
（3）参与肌肉收缩、纤毛运动、白细胞吞噬、细胞分裂、受精、电兴奋、激素分泌和代谢等过程。
钙广泛的分布于体内各组织器官中
2．体内钙的来源与去路
体内的钙主要来源于食物。
A.电刺激引起的钙瞬变
B.咖啡因引起的钙瞬变
C.其他指标
测量静息钙和钙瞬变的步骤及注意事项
（一）细胞样本的准备
在Langendorff装置上进行心脏逆行灌流：
①心肌细胞易在偏酸的环境中存活，这一点对细胞的分离和培养都十分重要；
②移取心脏要迅速；
③灌流液的温度控制在37℃；
④复钙后至少在室温下保存和稳定2 h以上再进行有关实验。
钙经粪便排出）血清钙的5种测定方法：
滴定法、比色法、火焰法、离子选择电极法、活化分析法。
（2）细胞内钙的研究方法
（3）光谱荧光法
二、血钙的转运及其调节
1.血浆钙浓度
正常情况下维持在8.5 - l1.1 mg％之间，其中46％与血浆蛋白特别是白蛋白结合，47.5％为游离钙(Ca2+)，仅有6.5％的钙以磷酸钙、柠檬酸钙、重碳酸钙、酒石酸钙、棕榈酸钙等复合物形式存在。只有血浆离子钙才具有生理活性。
10分钟
5分钟
5分钟
5分钟
课堂讨论
5分钟
图片
5分钟
图片
课堂讨论
15分钟
5分钟
10分钟
5分钟
1细胞质膜的钙泵
2内质网膜的钙泵占90%以上
3正向钠-钙交换占7%
3．细胞内钙转运的指标
（1）钙瞬变（calcium transient)
心肌细胞膜去极化（窦房结起搏或电刺激引起）引起膜L-型钙通道开放，钙离子内流，内流的钙离子触发细胞内肌浆网中（SR）内钙释放（CICR机制），细胞浆中钙浓度变化的时间效应形成了钙瞬变，进而触发心肌收缩。在正常条件下，钙瞬变与心肌收缩直接相关。
小结：
授课人（签字）：
课堂讨论：低钙是否为引起腿抽筋的原因？
10分钟
5分钟
5分钟
提问：为什么老年人应该少喝茶？
正常人的血浆Ca2+不是固定的，每日可有0.1 mg／dl的变化范围。
5分钟
10分钟
从影响血钙浓度的因素说起，谈钙对孕妇的重要性。15分钟
课堂讨论
用简明的图片说明三种重要的激素如何调节血钙水平
最新2008研究生循环生理2：心肌细胞钙信号和ECC-PPT文档
11
（3）转运模式
正向/前向Na/Ca交换
（钙外排模式）
3
反向Na/Ca交换
（钙内流模式）
3
12
决定Na/Ca交换方向 的主要是膜两侧 Na+浓度、 Ca2+浓度和膜电位： ◆当Em<ENCX时，钙外排：
－静息状态 －AP大部分时间
◆当Em>ENCX时，钙内流： －AP最初1-3ms －病理情况、药物作用 使Nai↑
• P型-钙通道 （ICa－P） 小脑Purkinje细胞 • Q型-钙通道 （ICa－Q） 神经细胞 • R型-钙通道 （ICa－R） 神经细胞
5
1.L型钙通道
• 阈电位：-40- -30mV
• 慢通道：
激活慢（20－30ms）,
失活更慢（100－300ms），
开放持续时间长
↑
long lasting current
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3）PLB的磷酸化解除了它对SR钙泵的抑制，提高了 SR钙泵摄取Ca2+的速率。
4）TnC的磷酸化导致其对Ca2+的敏感性下降。 3）4）作用可加速钙瞬变降支的速率，称为正性松弛
效应（positive lusitropism),可提高心肌的舒张功能.
2.提高cAMP水平的途径：
（1）激活AC 交感-肾上腺髓质系统、雨蛙素、胰高血糖素、前
使钙泵与Ca的亲和力增高，转运速率加快。 PKA、Ca-CaM(钙调素)依赖性蛋白激酶、PKC和PKG 可使 受磷蛋白磷酸化。
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（三）肌浆网腔内钙结合蛋白
➢ 以钙扣压素（集钙蛋白 calsequestrin）含量最高，主 要存在于JSR。心肌钙扣压素由391个氨基酸残基组 成，其结构上的主要特征是28%的氨基酸残基是酸性氨 基酸。
钙通道阻滞剂在心血管疾病中的应用指南
抗高血压药物对代谢的影响
————————————————————
药物
胰岛素抗性 血脂 血钾
————————————————————
利尿剂
↑
↑↓
β受体阻断剂
↑
↑—
钙阻滞剂
—
——
转化酶抑制剂
↓
—↑
α受体阻断剂
↓
↓
—
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
↑：增加； —：不变； ↓：降低
CCB被多个国际指南推荐为起始/联合降压治疗的一 线药物
Ⅱ类 选择性作用于其他电压依赖性钙通 道的药物：
(1)作用于T型钙通道 米贝地尔、苯妥英； (2)作用于N型钙通道 海螺毒素 conotoxin (3)作用于P型钙通道 某些蜘蛛毒素
Ⅲ类 非选择性钙通道调节药：普尼拉明、 氟利桂嗪、桂哌齐特等。
3、按应用时间先后：
第一代：维拉帕米、硝苯地平、地尔硫卓.
硝苯地平—慎用—与阻断剂合用 3. 不稳定性心绞痛：
维拉帕米，地尔硫卓—疗效较好（负性频率）， 硝苯地平—慎用—与阻断剂合用。
ACC/AHA不稳定型心绞痛和非ST段抬高心 肌梗死治疗指南（2007年修订版）
1. β-受体阻断剂治疗无效时，建议应用钙 通道阻断剂控制缺血症状（证据级别： B）。
2.β-受体阻断剂是禁忌或导致严重副作用 时，建议应用钙通道阻断剂控制缺血症 状（证据级别：C）。
静止态—激活门关闭而失活门打开
激活态—激活门开放，失活门由开 放而缓慢趋于关闭
失活态—失活门关闭，激活门由开 放而趋于关闭
【钙通道阻滞药分类】
1. 1987年WHO分类 （1） 选择性钙通道阻滞药：
Ⅰ类 苯烷胺类：维拉帕米 Ⅱ类 二氢吡啶类：硝苯地平 Ⅲ类 苯并噻氮卓类：地尔硫卓
钙的转运及其机制
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二、项目内容：
生理学网络课程
课程 模拟 网上 网上 内容 实验 答疑 考试
（ 中 英 文
生 理 学
）
模实 拟验 实示 验教
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细胞在静止(非激活)状态时，细胞溶质Ca2+浓度约 为10-7-10-8 moI/L，其代表性取值约为0．1 μmo1/L。
细胞溶质Ca2+处于极为严格的调节控制之中, 细胞 溶质中Ca2+浓度如果太高，可使磷酸根沉淀，而磷酸根 是细胞能量和物质代谢所必须的，故Ca2+过高对细胞有 害，甚至会致死。因此认为细胞内Ca2+稳态失控是许多 外界因素引起细胞坏死的共同机理, 在生理情况下，体 内各组织细胞内的钙含量保持相对的稳定。
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研究进程
2019.01~2019.03
脚本写作
2019.04~2019.05 2019.06~2019.09
完成程序的基本结构、文字录入及校对工作 分组完成图像处理、动画制作、实时录像、音
频采集等工作
2019.09~2019.10
完成样本
2019.10~2019.12
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预期目标：
总体目标是开发和制作一部图、文、声、动画并茂的生 理学网络教材。适合在校（含网校）的本、专科及以上的 学生，同时也适于医院的初、中级职称的医师自学。使之 成为学员获取生理学基本知识、了解生理学最新研究进展 及巩固所学知识的窗口。通过网络课程高度的交互功能， 教师可实时地解答学员的提问，也能相互讨论专业问题。
钙的吸收和转运机制及其影响因素_黄金明
文献综述钙的吸收和转运机制及其影响因素黄金明,王根林,杭苏琴(南京农业大学动物科技学院,南京210095)中图分类号:R591.1 文献标识码:A 文章编号:100725038(2001)0420008204摘 要:日粮钙主要在十二指肠和空肠吸收,钙的吸收途径有主动和被动转运,当钙的吸收较低时,十二指肠的主动转运增强,大部分的钙主要通过主动过程吸收。
当钙到达大肠时,钙通过主动和被动过程吸收。
有许多的因素影响钙的吸收和转运,如维生素D、蛋白质、甲状旁腺素相关蛋白、钙磷比例等。
关键词:钙;吸收和转运;影响因素近年来,人类钙营养不足的问题受到了广泛的重视,无论是老人还是儿童,缺钙是全球性的营养问题。
我国的膳食结构以植物性食物为主,植酸盐、纤维素、糖醛酸、藻酸钠和草酸等含量较高,食物中钙的吸收率很低[1]。
钙是中国居民膳食中缺乏最明显的营养素,全国平均每标准人每日钙摄入405m g,仅达到RDA的49.2%[2]。
乳中钙生物活性高,从全乳中得到的钙的生物活性达到88%,其中87%被保留在体内[3]。
但天然乳钙的含量受钙的化学形式、蛋白质、维生素等因素的影响。
因此,提高牛奶中钙的含量对于解决我国居民的钙缺乏问题具有非常重要的意义。
至今,有关钙在肠道的吸收和转运机理的研究较多,而有关钙在血液、乳腺中转运的机理的研究较少。
本文为探讨钙在乳腺中转运的机制的研究提供理论依据。
1 钙的吸收日粮钙主要在十二指肠和空肠吸收,吸收通过主动(需能)和被动(扩散)转运。
钙吸收有两条途径[4,5]:①饱和的跨细胞途径,并受钙结合蛋白(CaBP,MW=8800)的调节;②不饱和的旁细胞途径,不直接受功能性或营养性因子(如年龄或摄入)的影响。
跨细胞途径主要是在近端肠(主要是十二指肠),而旁细胞途径的钙吸收存在于整个肠道。
跨细胞的吸收包括三个步骤[6]:①进入肠细胞的纹状缘;②细胞内的运动;③伸出基侧膜。
钙是顺电化学梯度进入细胞并尽可能地利用钙通道,但是粘膜细胞的收稿日期:2001205223作者简介:黄金明(1979-),男,江西宁都人,硕士,主要从事动物生殖生理等方面的研究。
钙转运及其机制讲解
第四军医大学基础部生理学教研室 裴建明 2014.9
一、概 述
钙的重要性与体内分布
（1）骨骼、牙齿的主要组成原料 （2）降低毛细血管及细胞膜的通透性，是膜稳定剂 （3）参与肌肉收缩、纤毛运动、白细胞吞噬、细胞
Calcium elevation
பைடு நூலகம்
Ca2+
Ca2+
Ca2+ leakage
L-type
Ca2+
Na+-Ca2+ exchanger reverse-mode
Ca2+
Na+
Ca2+
IP3R
Ca2+
SR
RyR
calsequestrin
Regulation of intracellular calcium
Hormones and blood calcium
（1）3 main hormones：PTH, l，25(OH)2D3 , CT （2）others: Growth hormone、thyroid hormone、 sex hormone and prostaglandin。
Regulation of intracellular calcium
骨
PTH
肾
CT
肠
VD3
三、 细胞钙的转运及其调节
2种存在形式: 结合态和离子态
1. 细胞内钙的分布和恒定 细胞内钙的分布极不均匀，相对恒定 （1）50 ％存在于细胞核， （2）线粒体占30 ％， （3）内质网占14 ％， （4）质膜占5 ％ （5）细胞溶质中仅占总钙的0.5 ％(结合态) 0.005 ％(离子态)
钙代谢讲稿PPT课件
[Ca2+] [Ca2+]
钙在人体内的代谢
钙的代谢转变 1、食物中的存在状态：结合钙 2、吸收状态：离子钙 3、贮存状态：骨钙 4、排泄： 约20%经肾排出，80%随粪便排出。
钙在人体内的代谢
一、肠道的钙代谢
1 ．需要量：成人摄入量800-1200mg(20-30mmol） 2 ． 吸收部位： 十二指肠/小肠上端, 吸收率依次为十二指肠>空肠>回肠。
羟磷灰石结晶：3Ca3(PO4)2Ca(OH)2 无定形磷酸钙沉淀：CaHPO42H2O；Ca3(PO4)23H2O
钙 的 分 布 1%
细胞外液钙 （可溶）
不扩散钙：与蛋白质结合(40%）
血 清 总 钙
(nondiffusiblecalcium)
白蛋白结合 （30%） 球蛋白结合（10%）
游离钙 (48%） 可扩散钙
食物中钙吸收率通常只有30%，当体内缺钙或生理需钙量增加时， 吸收率可增高。
3 ．吸收途径 （1）旁细胞途径——被动吸收 （2）跨细胞途径-——主动吸收
钙在人体内的代谢
二、肾脏的钙代谢
60% ~70% Ca重吸收（ Ca2+ - ATP 酶）
10% ~15%Ca重吸 收3Na+ - Ca2+交换
Ca2+水平调节钙的肾小球滤过
钙平衡的调节
主要由甲状旁腺素、1，25-(OH)2D3和降钙素来调节 一、甲状旁腺激素(Parathormone,PTH)
PTH具有促进成骨和溶骨的双重作用。实验研究表明 小剂量PTH可促进成骨作用，而大剂量则可促进溶骨作用。PTH可刺激骨细胞分泌 胰岛素样生长因子，从而促进骨胶原和基质的合成，利于成骨作用。另一方面 PTH能使骨组织中破骨细胞的数量和活性增加，破骨细胞分泌各种水解酶，并且 产生大量乳酸和柠檬酸等酸性物质，使骨基质及骨盐溶解，释放钙和磷到细胞外 液。但PTH只引起血钙升高，血磷减少，其原因在于PTH对肾脏的作用。
钙通道课件
首选药：阵发性室上性心动过速
2. 扩张血管作用<DHP
舒张冠脉
舒张外周血管
[不良反应]
便秘、眩晕、头痛、外周水肿和心动过缓
禁忌症
严重心衰、病窦综合征、II～III度房室传
导阻滞、心动过缓者
CCB的抗心绞痛作用
1. 降低心肌耗氧量： ① 舒张血管，降低外周阻力，↓后负荷 ② ↓心率，↓收缩力； ③ 拮抗交感活性 2. 增加缺血区血供：扩张冠脉、↑侧支循环、 抑制血小板聚集，解除冠脉痉挛→↑冠脉和 缺血区血流量；
Ia类 二氢吡啶类
Ib类 地尔硫卓类 Ic类 苯烷胺类
Id类 粉防己碱
II类 选择性作用其他电压依赖性钙通道 咪贝地尔 conotoxins 普尼拉明 （1）作用于T型通道 （2）作用于N型通道 （3）作用于P型通道 III 类 非选择性钙通道调节药
钙通道阻滞药
按药物发展过程及特点分类
第一代:维拉帕米、硝苯地平、地尔硫卓
3. 保护缺血心肌: ↓Ca2+ 超载；↓组织ATP分解， ↓黄嘌呤氧化酶激活和继发性氧自由基产生； 抑制缺血时cAMP堆积。
CCB的临床应用
① 对冠脉痉挛所致变异型心绞痛最有效，也用于 稳定型及不稳定型心绞痛。 ② 对伴有哮喘和阻塞性肺病更合适。
硝苯地平：变异性心绞痛 维拉帕米：伴心率失常的不稳定/稳定心绞痛 地尔硫卓：冠脉痉挛所致变异型心绞痛
第二节
钙通道阻滞药
（Calcium Channel Blocker，CCB）
钙拮抗药
calcium antagonists 钙通道阻滞药 定义: 阻滞Ca2+从细胞外液经电压
依赖性钙通道进入细胞内，
从而降低细胞内钙的药物
钙的测定
5钙与健康————新盖中盖高钙片中钙含量的测定专业年级：材料科学与工程2011级学生姓名：刘昰林学号：1116010133指导教师：邱海燕西南石油大学化学化工学院年2012 月05日02目录一、钙与健康(一) 、钙是目前活跃于心血管疾病中的重点课题。
80年代以来，对Ca2＋进行了深入广泛的研究，发现Ca2＋与心血管疾病如动脉粥样硬化［1～3］、冠心病［4］、心绞痛［5］、高血压［6～7］、心肌病等之间有密切关系。
钙作为人体内含量最高的一种矿物质，主要用于骨骼的构成(占人体总钙量的99%以上)，体液和细胞中的钙则相对较少。
然而，这极少量的钙(大都以离子形式存在)对细胞功能的调节起着极其重要的作用，特别是在兴奋型(应激性，指心肌、骨骼肌、平滑肌、脑、神经节等)和分泌型(非应激性，指分泌腺体及肝、血小板等)细胞中，Ca2＋的调节作用尤引人注目［3～9］。
在正常细胞中，细胞质内游离Ca2＋浓度大约为0.1 μmol/L，这要比毫摩尔水平的细胞外Ca2＋低10，000左右。
某些细胞器(如内质网、肌浆网及线粒体)中都聚集了Ca2＋，浓度与细胞外Ca2＋浓度相当。
此外，细胞内还有一些Ca2＋结合到带负电的脂和蛋白上。
当细胞受到刺激时，细胞外及细胞器中的Ca2＋都可能被动员进入细胞质，使游离Ca2＋浓度升至1～10 μmol/L，从而引起一定的生理反应［10］。
1883年英国生理学家Ringer做了著名的蛙心Ca2＋灌注实验，证明心肌收缩需要Ca2＋的存在，从而开创了Ca2＋与心血管功能研究的先河［11］。
Fleckenstein A 提出，Ca2＋对心脏的主要作用有［12］：膜稳定作用、动力作用及致痛作用。
Ca2＋对心肌膜复合体的完整起着很重要的作用，如Ca2＋—糖、Ca2＋—蛋白质、Ca2＋—脂质、Ca2＋脂蛋白等复合体结构一旦改变，心肌膜功能就发生了改变［13］。
正常心肌细胞兴奋时，Ca2＋经慢钙通道流入胞内形成一微弱内向电流，通过T横管系统诱导肌浆网释放Ca2＋，参与心肌收缩。
钙转运及其机制
B.咖啡因引起的钙瞬变 Caffeine induced calcium transient
Caffeine induced Ca2+ transient in the myocytes
Caffeine
Ca2+ Ca2+ pump
Ca2+
Ca 2+ RyR Ca2+
Sarcoplasmic Reticulum
钙的转运及其测定 Calcium homeostasis and measurement of calcium
第四军医大学基础部生理学教研室 裴建明 2014.9
一、概 述
钙的重要性与体内分布
（1）骨骼、牙齿的主要组成原料 （2）降低毛细血管及细胞膜的通透性，是膜稳定剂 （3）参与肌肉收缩、纤毛运动、白细胞吞噬、细胞
（1）Ca2+通道进入细胞内
（2）通过细胞膜进入细胞(Ca2+漏)
（3）反向钠-钙交换
Ca2+
Ca2+
Ca2+ leakage
L-type
Ca2+
Na+-Ca2+ exchanger reverse-mode
Ca2+
Na+
B. 内钙释放 （1）IP3 途径 （2）Ryanodine 途径
Ca2+
IP3R
细胞内钙 A. Ca2+浓度约为10-7-10-8 moI/L B. 体内各组织细胞内的钙含量保持相对的稳定 C. 磷酸根是细胞能量和物质代谢所必须的， Ca2+过高对细胞有害，甚至会致死
2．细胞内钙的转运体系
Ca2+进入细胞浆内有5条路径： A. 外钙内流3条 B. 内钙释放2条
苯妥英抑制心脏Cav1.2通道合成与转运的机制研究
苯妥英抑制心脏Cav1.2通道合成与转运的机制研究罗超迪,闫 炀,郑幸龙,韩 丹摘要 目的:探讨抗癫痫药物苯妥英(PHT )对心肌细胞(CMs )中L 型钙通道(Cav1.2)蛋白合成和转运的影响㊂方法:对无特定病原体(SPF )级雄性Sprague -Dawley (SD )乳鼠的原代CMs 分别使用不同浓度的PHT (0μg/mL ㊁0.0001μg/mL ㊁0.001μg/mL ㊁0.01μg/mL ㊁0.1μg/mL ㊁1μg/mL ㊁10μg/mL ㊁100μg/mL )干预24h 和48h ,采用CellTiter -Glo 法检测细胞活性㊂采用蛋白免疫印迹法(Western Blot )和激光扫描共聚焦显微镜分别观察PHT 对原代CMs 中Cav1.2通道蛋白合成和转运的影响㊂结果:在CellTiter -Glo 细胞活性检测中,随着苯妥英浓度的增加,除100μg/mL 组干预48h 后细胞存活率降低至85.23%(P <0.05)外,其余各组间细胞活性比较,差异均无统计学意义(P >0.05)㊂Western Blot 结果显示,100μg/mL 苯妥英干预原代CMs 时Cav1.2合成明显受到抑制,然而激光扫描共聚焦显微镜结果提示在10μg/mL 苯妥英干预原代CMs 时已出现Cav1.2转运障碍㊂结论:苯妥英可抑制心脏Cav1.2的合成和转运,可能与其可致心律失常作用相关,临床上在应用苯妥英时应仔细评估病人情况,尽可能减少副作用的产生㊂关键词 心律失常;L 型钙通道蛋白,Cav1.2;苯妥英;合成;转运d o i :10.12102/j.i s s n .1672-1349.2023.07.013 抗癫痫药物苯妥英(phenytoin ,PHT )是一种ⅠB 类抗心律失常药物,主要作用于心肌细胞的电压依赖性钠离子通道(Nav1.5)[1]㊂苯妥英用作抗心律失常药物的典型剂量为每天200~400mg ,目标血药浓度为40~70μmol/L [2]㊂然而,苯妥英引起的一些严重心脏不良反应已有报道,特别是在心律失常方面,包括心动过缓㊁窦性停搏㊁Ⅰ型Brugada 型心电图模式和心源性猝死(sudden cardiac death ,SCD )[3-6]㊂体外研究表明,苯妥英引起的心律失常可能是由于其阻断了快速激活的延迟整流钾(IKr )通道而引起的[7]㊂苯妥英通过阻断IKr 通道导致心脏复极时间延长,进而导致QT 间期延长,早期后除极(early after depolarization ,EAD )㊁延迟后除极(delayed after depolarization ,DAD )和触发活动,增加了室性复极的透壁分散,最终导致尖端扭转型室性心动过速(torsades de pointes ,TdP )甚至心室颤动(ventricular fibrillation ,VF )[8]㊂钙电流是由广泛分布于心脏组织的L 型钙通道(Cav1.2)介导的,该通道在心脏组织中发挥重要的生理作用㊂心脏Cav1.2通道参与触发兴奋-收缩耦联(excitation -contraction coupling ,EC ),控制动作电位时程(action potential duration ,APD )并且调节基因表达[9]㊂研究表明,当内向电流增加和/或外向电流减少基金项目 陕西省自然科学基础研究计划(No.2021JQ -394)作者单位 西安交通大学第一附属医院(西安710061)通讯作者 韩丹,E -mail :******************引用信息 罗超迪,闫炀,郑幸龙,等.苯妥英抑制心脏Cav1.2通道合成与转运的机制研究[J ].中西医结合心脑血管病杂志,2023,21(7):1239-1242.时会发生EADs ,导致心脏APD 延长,其中钙离子(Ca 2+)内流发挥重要作用,在这种条件下,动作电位平台期Cav 1.2通道可能重新激活并反向复极化[10]㊂研究还表明,细胞内Ca 2+循环,特别是自发Ca 2+释放是导致EADs 的原因之一[11]㊂ Cav1.2通道在心脏的起搏㊁心率㊁心律和收缩活动中发挥着关键作用[12]㊂苯妥英诱发的心律失常可能与其干扰心脏Cav1.2通道有关㊂苯妥英对胰高血糖素分泌肿瘤细胞中的Cav1.2通道的影响已有研究,但苯妥英对心肌细胞(CMs )中Cav1.2通道的作用机制尚不清楚[13]㊂本研究采用CellTiter -Glo 法探讨苯妥英对CMs 活性的影响,采用蛋白免疫印迹法(Western Blot )和激光扫描共聚焦显微镜探讨苯妥英对SD 大鼠CMs 中Cav1.2通道的合成和转运的影响㊂1 材料与方法1.1 心肌原代细胞提取 无特定病原体(SPF )级雄性Sprague -Dawley (SD )乳鼠(1~3d ,购于西安交通大学医学部动物实验中心)10只,乙醇消毒后将心脏剪下并将心室肌组织剪碎成约1mm 3组织块,在不含钙离子和镁离子的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline ,PBS )(Hyclone )中冲洗2次,向组织块中加入2mL 胰蛋白酶(索莱宝,T1300)和Ⅱ型胶原酶(索莱宝,C8150),37ħ水浴锅中轻微震荡,取出上清,并在上清中加入含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素(Hyclone )的DMEM/F -12培养基(Corning ),重复7次,前4次每次振荡5min ,后3次每次振荡7min ㊂用铁筛将消化后的液体过滤,将收集到的液体以800r/min 离心5min ㊂弃上清液,然后用DMEM -F12完全培养基重悬细胞并培养㊂培养45min后,心肌成纤维细胞贴壁,取上清液,同时在上清液中加入抑制剂,上清液即为原代心肌细胞㊂1.2苯妥英配制苯妥英(S2525,Selleck)溶解于二甲基亚砜(DMSO)(碧云天,ST038)中,储存液浓度为20mg/mL,-20ħ保存,每次实验前用生理盐水连续稀释至最终使用浓度㊂实验过程中DMSO的最终含量不超过0.05%㊂1.3细胞干预及CellTiter-Glo法测定细胞活力CellTiter-Glo法是基于ATP检测的快速细胞活力检测法[14]㊂将原代CMs接种于96孔板(100μL,5ˑ104个/mL细胞,5000个/孔细胞),待细胞充分贴壁后换用无血清培养基饥饿12h后,分别使用含0μg/mL㊁0.0001μg/mL㊁0.001μg/mL㊁0.01μg/mL㊁0.1μg/mL㊁1μg/mL㊁10μg/mL㊁100μg/mL㊁100μg/mL苯妥英的完全培养基干预细胞并进行分组,然后在37ħ㊁5% CO2环境中分别孵育24h和48h(1μg/mL苯妥英ʈ3.96μmol/L苯妥英)㊂每孔加入CellTiter-Glo试剂和DMEM(Corning)各50μmol/L,在避光条件下于培养箱中孵育10min㊂使用Tecan Infinite M1000酶标仪(Tecan Austria GmbH,Grödig,Austria)记录结果㊂重复该实验至少3遍至结果保持稳定㊂1.4Western Blot测定Cav1.2蛋白水平将原代CMs(n=1250)接种于直径35mm的培养皿(中国香港NEST Biotechnology公司)内,待细胞充分贴壁后换用无血清培养基饥饿12h后,分别使用含0μg/mL㊁10μg/mL㊁30μg/mL㊁100μg/mL苯妥英的完全培养基干预细胞48h后提取蛋白㊂每1mL蛋白裂解液RIPA(碧云天,P0013B)中加入20μL(50ˑ)蛋白酶抑制剂储存液(碧云天,P1005),使抑制剂的最终浓度为1mmol/L㊂吸去上清液后,用PBS清洗培养皿3次,加入100μL蛋白裂解液,在冰上用细胞刮刀轻刮细胞,每次5min,3次后将液体转移至1mL EP管中,冰上孵育30min,旋涡振荡3次,于4ħ,半径12cm, 12000r/min离心30min,将上清液转移至干净EP管内,用蛋白定量试剂盒(中晖赫彩,PQ003)测定各组样本蛋白质浓度,分装后置于-80ħ冰箱保存㊂取蛋白样品40g进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后转移至硝酸纤维膜(碧云天,FFP39),室温下使用50g/L牛血清清蛋白的TBST封闭硝酸纤维膜2h,再加入羊抗鼠Cav1.2抗体(Abcam,ab58552)中4ħ孵育过夜㊂TBST缓冲液洗涤3次后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(博奥森,bs-80295G-HRP)孵育1h,将膜用TBST缓冲液洗涤3次后加入超敏化学发光试剂(碧云天,P0018FS),曝光㊁成像㊂用Quantity One 分析软件测定各条带灰度值,结果用目的条带的灰度值/β-actin条带的灰度值表示㊂1.5Cav1.2蛋白的表达定位将原代CMs(1250个)接种于直径35mm的培养皿(香港NEST Biotechnology公司)内,待细胞充分贴壁后换用无血清培养基饥饿12h后,分别使用含0μg/mL和10μg/mL 苯妥英的完全培养基干预细胞48h后连续孵育抗CACNA1C抗体(Abcam,ab58552),抗Calnexin抗体(Invitrogen,MA3-027),Hoechest(Sangon,E607329)㊂洗涤后与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(Invitrogen,1832035)孵育,细胞图像采用FV1000激光扫描显微镜(德国Leica,DM2500)获取㊂1.6统计学处理采用SPSS22.0软件进行数据分析㊂符合正态分布的定量资料以均数ʃ标准差(xʃs)表示,方差齐性检验采用Levene检验㊂两组间比较采用Dunnett't检验和独立样本t检验㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果2.1CellTiter-Glo法检测苯妥英对细胞活力的影响随着苯妥英浓度的增加,除100μg/mL组在干预48h 时的细胞存活率降低到85.23%(P<0.05)外,其余各组间细胞存活率比较,差异均无统计学意义(P> 0.05)㊂详见图1㊂2.2Western Blot检测苯妥英对Cav1.2蛋白合成的影响根据CellTiter-Glo实验和前期实验结果[7],本研究选择了不同浓度的苯妥英(0μg/mL㊁10μg/mL㊁30μg/mL㊁100μg/mL)干预原代CMs48h后提取细胞蛋白㊂采用Western Blot评价不同浓度苯妥英对原代CMs中Cav1.2通道蛋白合成的影响㊂结果显示,100μg/mL苯妥英组明显降低了原代CMs中Cav1.2蛋白的合成,与0μg/mL组细胞比较,差异有统计学意义(P<0.05)(见图2㊁图3)㊂因此,认为苯妥英在超过治疗水平的较高浓度下可能导致Cav1.2通道蛋白合成异常㊂与0μg/mL苯妥英组比较,*P<0.05㊂图1不同浓度苯妥英干预后细胞活力比较图2Cav1.2及β-actin 蛋白免疫印迹与0μg/mL苯妥英组比较,*P<0.05㊂图3Cav1.2蛋白表达定量图2.3激光扫描共聚焦显微镜观察苯妥英对Cav1.2蛋白转运的影响为确定苯妥英对Cav1.2蛋白转运的影响,使用激光扫描共聚焦显微镜评估0μg/mL和10μg/mL苯妥英干预组原代CMs染色图像(见图4),对照组抗CACNA1C抗体荧光(红色)主要出现在细胞表面,表明Cav1.2蛋白从内质网正常转运到细胞膜㊂然而,10μg/mL干预组细胞图像显示,Cav1.2通道蛋白从内质网转运至细胞膜受阻,红色荧光从膜上消失, Calnexin是内质网膜上作为分子伴侣参与新生肽链的折叠㊁加工的蛋白质,抗Calnexin抗体荧光(绿色)集中分布在内质网膜上,说明10μg/mL苯妥英干预后Cav1.2蛋白由内质网转运至细胞膜受阻㊂尽管苯妥英在100μg/mL水平开始抑制Cav1.2通道蛋白的合成,但在治疗剂量范围内可诱导蛋白转运功能障碍㊂以上结果表明,苯妥英易导致Cav1.2通道蛋白转运异常㊂图4原代CMs亚细胞水平Cav1.2蛋白定位图像(A㊁B㊁C㊁D为无苯妥英干预的原代CMs的图像,E㊁F㊁G㊁H为10μg/mL苯妥英干预的原代CMs的图像㊂蓝色标记细胞核,绿色标记Calnexin,红色标记Cav1.2)3讨论苯妥英于1938年作为一种抗癫痫药物引入临床,后来又作为抗心律失常药物被用于心血管领域[15]㊂近年来,心电生理领域对苯妥英不良反应的认识逐渐深入㊂苯妥英的致心律失常作用是由于其阻断了心肌细胞离子通道,其中Cav1.2通道在调节心率和心律方面发挥重要作用[16]㊂本研究评估了苯妥英对原代CMs中Cav1.2蛋白合成和转运的影响,结果显示,苯妥英对心脏Cav1.2通道蛋白表达的抑制具有浓度依赖性;Western Blot显示,100μg/mL苯妥英导致Cav1.2通道蛋白合成显著降低;苯妥英干预后的细胞荧光照片显示,Cav1.2通道蛋白从内质网转运到细胞膜表面的过程出现异常㊂苯妥英虽然仅在大于治疗剂量上抑制了Cav1.2的合成,但仍可在治疗剂量范围内诱导蛋白转运功能障碍,这或许可以部分解释苯妥英的致心律失常作用;也有可能是由于苯妥英对Nav1.5通道的抑制作用使Na+电流降低,抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinasesⅡ,CaMKⅡ)的活性,进而导致Cav1.2通道蛋白表达降低㊂因此,苯妥英对CMs Cav1.2蛋白的影响也可通过Na+和Ca2+阻滞剂干预进一步探究㊂Abrahamsson等[17]研究发现,较低水平的苯妥英导致心动过缓,而随着苯妥英浓度的增加,逐渐出现室性心律失常㊁其他严重的心脏不良反应,如致命性室性心律失常,Ⅰ型Brugada型心电图㊁低血压㊁窦性停搏和SCD也有报道[5-6,18]㊂苯妥英抑制Cav1.2蛋白的合成和转运,可能导致Ca2+电流降低,从而导致内质网偶联功能障碍,从而阻碍相邻心肌细胞电活动的传导㊂随着Ca2+电流的降低,IKr相对增加,促进APD 明显缩短,心室复极跨壁离散度增加,导致ST段抬高,J波形成,甚至 R on T ,最终导致心室颤动[19-20]㊂这些级联反应在一定程度上可以解释苯妥英引起的心律失常㊂另有研究显示,苯妥英成功纠正了用传统治疗方法难以纠正的TdP病人的心律失常[21-22]㊂苯妥英的抗心律失常作用包括降低心室自律性㊁交感放电和增加房室传导速度[21]㊂由于苯妥英对Cav1.2通道的抑制作用,本研究结果显示,苯妥英在不同的个体中表现出促心律失常作用或抗心律失常作用㊂因此,苯妥英的用药是一把双刃剑,在选择用药中应综合评价苯妥英的个体风险获益比,以减少不良反应的发生㊂综上所述,本研究验证了苯妥英对心脏Cav1.2通道的影响,苯妥英以浓度依赖性的方式抑制Cav1.2通道,改变Cav1.2蛋白合成并干扰通道蛋白运输,这可能是苯妥英促心律失常作用的原因㊂参考文献:[1]GALLOP K.Review article:phenytoin use and efficacy in the ED[J].Emergency Medicine Australasia:EMA,2010,22(2):108-118.[2]KOWEY P R.Pharmacological effects of antiarrhythmic drugs.Review and update[J].Archives of Internal Medicine,1998,158(4):325-332.[3]ZONERAICH S,ZONERAICH O,SIEGEL J.Sudden death followingintravenous sodium 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