丹参水溶性成分与脂溶性成分抑菌作用的考察
高效液相色谱法测定丹参胶囊脂溶性和水溶性成分含量*

高效液相色谱法测定丹参胶囊脂溶性和水溶性成分含量*张珺;程月发;张爱兵【摘要】目的:采用高效液相色谱法分别建立同时测定丹参胶囊中脂溶性成分二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I及丹参酮IIA和水溶性成分丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B及丹酚酸A的含量的方法。
方法:脂溶性成分:采用Welch ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱,流速1 mL·min-1,检测波长为270 nm。
水溶性成分:采用Thermo Syncronis C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以甲醇-乙腈-0.02%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱,流速1 mL·min-1,检测波长为286 nm。
结果:丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA分别在0.472-9.44μg(r=0.9998)、0.352-7.04μg(r=0.9999)、0.244-4.88μg(r=1.0000)、2.268-45.36μg(r=0.9999)、0.168-3.36μg(r=0.9999)、0.088-1.76μg(r=0.9999)、0.18-3.6μg(r=0.9999)、0.208-4.16μg(r=0.9999)和0.17-3.4μg(r=0.9999)呈良好的线性关系;加样回收率在97.48%-98.59%之间。
结论:该方法稳定,重复性好,可用于丹参胶囊含量的测定。
%This study was aimed to establish a HPLC method for the content determination of liposoluble components, such as dihydrotanshione I, croptotanshinone, tanshinone I and tanshinone IIA, as well as the content determination of water-soluble components, such as danshensu, protocatechuic aldehyde, rosmarinc acid, salvianolic acid B,and salvianolic acid A in Danshen capsule simultaneously. For liposoluble components, the determination was performed on a Welch ultimate XB-C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) by gradient elution usingacetonitrile-water as the mobile phase. The flow rate was 1 mL·min-1. And the detection wavelength was set at 270 nm. For water-soluble components, the determination was performed on a Thermo SyncronisC18 column (250 mm × 4.6 mm, 5μm) by gradient elution using methanol-acetonitrile-0.02%phosphoric acid as the mobile phase. The flow rate was 1 mL·min-1. And the detection wavelength was set at 286 nm. The results showed that there were good linear relationships between components of peak areas and the ranges were 0.472-9.44 μg (r = 0.999 8) for danshensu,0.352-7.04 μg (r = 0.999 9) for protocatechuic ald ehyde, 0.244-4.88 μg (r =1.000 0) for rosmarinc acid,2.268-45.36 μg (r = 0.999 9) for salvianolic acid B, 0.168-3.36 μg (r = 0.999 9) for salvianolic acid A, 0.088-1.76 g(r=0.999 9) for dihydrotanshione I, 0.18-3.6μg (r=0.999 9) for croptotanshinone, 0.208-4.16μg (r=0.999 9) for tanshinone I, and 0.17-3.4μg (r=0.999 9) for tanshinone IIA. Average recoveries of the method were between97.48%and 98.59%. It was concluded that the analysis was stable and reproducible, which can be used as a method for the analysis of Danshen capsule.【期刊名称】《世界科学技术-中医药现代化》【年(卷),期】2014(000)012【总页数】6页(P2740-2745)【关键词】丹参胶囊;脂溶性成分;水溶性成分;高效液相;含量测定【作者】张珺;程月发;张爱兵【作者单位】河北联合大学冀唐学院唐山 063300;河北联合大学冀唐学院唐山063300;河北省唐山市药品检验所唐山 063000【正文语种】中文【中图分类】R284.1丹参胶囊作为临床常用中成药,具有活血化瘀的功效。
丹参的水溶性成分的分离与纯化

丹参的水溶性成分的分离与纯化一、实验目的对丹参药材中脂溶性成分,利用大孔吸附树脂进行脂溶性成分纯化研究二、实验原理丹参是中国传统中药, 是山东省的地道药材。
其主要功效为祛瘀止痛、活血通经、清心除烦。
广泛应用于治疗冠心病、中风、微循环障碍等疾病据文献报道, 丹参中的化学成分主要为脂溶性与水溶性两大类。
其中α脂溶性成分主要有三种: 丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA 和隐丹参酮, 目前多以丹参酮Ⅱ A 或以丹参酮Ⅰ、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA 及隐丹参酮等多种脂溶性成分联合作为含量测定的指标。
大孔吸附树脂具有吸附性和筛选性,其吸附性是由范德华引力或产生氢键的结果,分子筛选性是有其本身多孔性结构所决定的。
通过吸附和分子筛原理,有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小,在大孔吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而达到分离、纯化、除杂、浓缩等不同目的。
三、仪器与材料1、丹参药材、乙醚、乙醇、蒸馏水、丹参素对照品、、大孔树脂等2、高效液相色谱仪、电子天平、蒸发仪、水浴锅、锥形瓶等四、实验内容1、提取1.1 丹参脂溶性成分初提物的制备取粉碎的丹参药材50g,90%乙醇水浴回流三次,每次10倍量、1.5h。
合并滤液并回收溶剂。
残渣用氯仿萃取溶解3次,每次50ml,合并氯仿液,回收氯仿,残渣用适量乙醇溶解,备用2、大孔吸附树脂使用2.1三种不同的大孔吸附树脂对丹参素的静态吸附量考察精密称取大孔树脂各1g,置100ml烧杯中,精密加入上样溶液20ml,每隔5min振摇10s,持续120min,然后静置过夜,使其达到饱和吸附,过滤取续滤液,通过0.45μm的微孔滤膜,上高效液相色谱仪测定丹参素的含量,按公式计算树脂的饱和吸附量静态饱和吸附量=[(初始浓度—吸附后浓度)×吸附液体积]/树脂量(mg.g-1)。
2.2 各种大孔树脂对丹参总黄酮的静态吸附-洗脱性能将2.1中过滤的大孔树脂精密加入70%乙醇20ml,时时振摇,持续120min,静置过夜,过滤取续滤液,通过0.45μm的微孔滤膜,用高效液相色谱法计算丹参素的含量静态洗脱率=(洗脱剂浓度×洗脱剂体积)/饱和吸附量×100%。
丹参活性成分的现代中药药理研究进展分析

丹参活性成分的现代中药药理研究进展分析丹参又称赤参、紫丹参、红根等,主要生长于生于山坡草地林边道旁,或疏林干燥地上。
其味苦,微寒。
研究表明丹参的活性成分有脂溶性性质的和水溶性性质的两部分组成[1],脂溶性性质的成分主要包括丹参酮,而水溶性质的成分主要包括迷迭香酸、丹酚酸、丹参素等。
丹参主要应用于瘀血、疼痛、月经不调、痛经经闭、产后瘀滞腹痛、关节痹痛、跌打瘀肿、温病心烦、血虚心悸、疮疡肿毒、丹疹疥癣等疾病的治疗。
随着对丹参活性成分药用价值的研究不断深入,其在肿瘤疾病、心血管疾病和其它方面的应用价值也被逐渐发掘,本文主要对丹参活性成分的现代中药药理作用进行综述,具体信息如下。
1 在肿瘤方面的药用效果丹参酮是丹参的活性成分之一,近些年的研究发现其在肿瘤的预防和治疗具有重要的意义,主要通过抑制肿瘤细胞繁殖、促进肿瘤细胞分化与凋亡来其作用。
1.1 抑制肿瘤细胞繁殖:有关研究人员通过把含有丹参酮色素的1 6种活性成分(从丹参根部分离获取)对3种肿瘤细胞胞株进行处理2天后,结果发现这3中肿瘤细胞的繁殖增加速度降低程度明显。
主要起作用机制是丹参酮中菲环结构与DNA分子相结合,呋喃环、醌类结构能够形成自由基从而使DNA受到破坏,防止肿瘤细胞DNA形成[4]。
1.2 促使肿瘤细胞分化:研究发现做好肿瘤细胞分化工作对于肿瘤疾病的治疗十分关键。
通过实验发现丹参酮ⅡA把肿瘤恶性细胞分化成对人体无伤害的良性细胞,而对良性细胞不具有杀伤能力。
1.3 促使肿瘤细胞凋亡:细胞凋亡是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用,它并不是病理条件下,自体损伤的一种现象,而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
实验发现丹参酮ⅡA 具有调控基因表达的作用,从而达到促使肿瘤细胞凋亡的作用。
2 心血管疾病方面的效果2.1 丹参素能够起到抑制血栓的出现[2]:具有遏制血小板凝结的作用;能够促进血小板膜的循环,使其流动性加快;丹参素可在很大程度上让人体的抗凝和纤溶活性得到改善,能够促进环腺苷酸(cAM P)的产生。
_丹参的药用成分与药理作用探析_丹参的药用成分与药理作用探析

丹参运用临床的有效 成 分 主 要 包 括 丹 参 酮 ⅡA、丹参素及丹参酚酸 B,以上诸多的药理作用使 其更广泛的应用临床。在治疗心血管疾病方面显 示出了其独特的疗效和优越性。复方丹参滴丸治 疗冠心病心绞痛的疗效是明确的; 心宁片、通心络、 芪丹通脉片、双龙丸等主要含丹参,对冠心病治疗 效果是肯定的。冠心病的基本证候特点为气虚血 瘀型,运用益气活血类的中药和方剂如人参、丹参、 三七、黄芪、赤芍、当归补血汤及血府逐瘀汤对冠心 病的疗效是显著的[10]。以丹参为主的制剂还有丹 参注射液、复方丹参片、冠心丹参片,主要用于治疗 心脑血管类疾病。临床上还有应用丹参注射液治 疗消化性溃疡 30 例,治愈率 86. 7 %[11]。丹参是 杜雨茂教授[12] 治 疗 肝 硬 化 最 常 用 的 活 血 化 瘀 药, 其消肝脾肿大软坚消癥之效甚良。注射用丹参冻
2012 年 9 月第 35 卷第 5 期 Sep. 2012 Vol. 35 No. 5
方药纵横
陕西中医学院学报 Journal of Shaanxi College of Traditional Chinese Medicine
·71·
丹参的药用科,陕西 铜川 727000)
丹参的药用成分主要分为脂溶性和水溶性两 类。脂溶性 成 分 包 括 多 种 菲 醌 衍 生 物,如 丹 参 酮 I、丹参酮ⅡA、丹 参 酮 Ⅱ B、隐 丹 参 酮、二 氢 丹 参 酮 Ⅰ、异丹参酮、异丹参酮Ⅱ、异隐丹参酮、丹参新酮 等。水溶性成分有丹参素、原儿茶醛及丹酚酸 B 等[2]。脂溶性 的 丹 参 酮 类 以 改 善 血 液 循 环、抗 菌 和抗炎为主,而水溶性的丹酚类则以抗氧化、抗凝 血、抗血栓 形 成、调 血 脂 和 细 胞 保 护 作 用 明 显[2]。 丹参酮ⅡA 和丹酚酸 B 为 2010 版《中国药典》所 规定的丹参主要的有效成分[1]。 1. 1 品种对药用成分的影响 因本草文献描述丹 参品种特征混乱,凡是具备“花红紫”及“根皮丹而
丹参的化学成分及其药理作用研究概述

文章编号:167424616(2009)012045204#文献综述#丹参的化学成分及其药理作用研究概述徐丽君黄光英华中科技大学同济医学院附属同济医院中西医结合研究所,武汉430030丹参(Sa lvia m ilti orrhiza Bge)是唇形科植物,药用其干燥的根及根茎。
丹参主产四川、山东、浙江等省,现全国大部分地区有分布。
丹参始载于5神农本草经6,列为上品。
以后历代本草均有收载,5本草纲目6记载,丹参色赤味苦,气平而降,阴中之阳也。
入手少阴、厥阴经。
心与包络血分药也。
5妇人明理论6曰:四物汤治妇人病,不问产前、产后、经水多少,皆可通用。
/惟一味丹参散,主治与之相同0。
丹参除了有以上功效外,现代医学研究和临床实践还表明,丹参有扩张冠状动脉、增加冠状动脉血流量、减慢心率、改善心肌缺氧之功效,常用于治疗冠心病、心绞痛、胸闷、心悸等症。
可治疗心肌梗塞、心肌炎,可改善急性症状和心电图缺血性改变,这也证明了丹参/一味丹参抵四物0的说法。
近年随着研究的深入,对于其化学成分组成、药理作用特点及机制等有较全面和系统的认识。
现将丹参研究的进展概述如下。
1化学成分[1–4]丹参的化学成分分为脂溶性和水溶性两大类,现分别予以介绍。
1.1脂溶性成分丹参的脂溶性大多为共轭醌、酮类化合物,具有特征的橙黄色和橙红色。
其主要包含以下物质:丹参酮Ñ、丹参酮ÒA、丹参酮ÒB、丹参酮Õ、丹参酮Ö、隐丹参酮、羟基丹参酮、丹参酸甲酯、次甲基丹参醌、紫丹参甲素、紫丹参乙素、戊素、丹参新酮、1,2二氢丹参醌、丹参醇Ñ、丹参醇Ò、丹参醇Ó、3A2羟基丹参酮ÒA、降丹参酮、1,2,15,162四氢丹参醌、异丹参酮Ñ、异丹参酮Ò、异隐丹参酮、丹参醌A、丹参醌B、丹参醌C、丹参醌D、二氢次丹参醌、二萜萘嵌苯酮、丹参螺旋缩酮内酯、丹参酚、丹参醛。
丹参中脂溶性成分的提取方法的探究

丹参中脂溶性成分的提取方法的探究丹参中脂溶性成分的提取方法的探讨【摘要】目的丹参中脂溶性成分丹参酮ⅡA是丹参制剂中重要的活性成分,也是成品的主要检测指标,通过对丹参酮ⅡA提取方法的研究,对丹参制剂提取工艺的优化具有重要的现实意义。
方法根据当前丹参制剂的生产工艺出发,在提取时间、溶媒倍数、提取温度、溶媒浓度等方面进行筛选试验,利用高效液相色谱法进行含量测定。
结果丹参的最佳提取重要条件为,4倍量90%的乙醇,70℃温浸小时,通过实验证明采用以上所述的丹参提取方法,干燥过程同样采用低温减压浓缩的丹参提取物中丹参酮ⅡA转移率超过50%。
结论本方法简便,快速,利于有效成分保留,适用于丹参中脂溶性成分的提取,对于丹参制剂的生产工艺优化有指导意义。
【关键词】丹参酮ⅡA 提取方法工艺优化丹参为唇形科鼠尾草,属多年生草本植物丹参的干燥根,其活性成分可分为脂溶性成分和水溶性酚酸成分,前者主要包括丹参酮ⅡA、丹参酮I和隐丹参酮等;后者主要包括丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸B和丹酚酸C等。
本文以脂溶性成分丹参酮ⅡA为指标对提取方法进行研究。
丹参酮ⅡA在临床上具有很好的药理活性,有抗凝血、促纤溶作用。
我们以丹参酮ⅡA这一活性成分为指标,从提取时间、提取溶媒倍数、提取温度、提取溶媒浓度等方面进行试验,以筛选提取条件,为提取工艺优化奠定基础。
1 药品与试剂丹参(蓟县野生药材),丹参酮ⅡA对照品(购于中国药品生物制品检定所),甲醇(分析纯)、乙醇(药用级)、蒸馏水。
2 方法色谱条件的确定高效液相色谱仪:SP-8100。
色谱柱:YMC C18分析柱(×150mm)。
流动相:甲醇-水(75∶25)。
检测波长:270nm。
流速:1ml/min。
对照品溶液的制备精密称取丹参酮ⅡA对照品,用分析甲醇配制成浓度为/ml的对照品溶液。
3 试验及结果试验用丹参药材中丹参酮ⅡA的含量测定取丹参粉末(过三号筛),精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加甲醇50ml,密塞,称定重量,加热回流1小时,放冷,密塞,再称定重量,用甲醇补足重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
丹参的主要化学成分

丹参的主要化学成分、药理作用和功效(1)主要化学成分丹参的化学成分主要有两大类:脂溶性的丹参酮类化合物和水溶性的酚酸类化合物。
脂溶性成分属醌、酮型结构的有:丹参酮,隐丹参酮,异丹参酮,异隐丹参酮,羟基丹参酮,丹参酸甲酯,亚甲基丹参醌,二氢丹参酮,丹参新醌A、B、C、D,二氢异丹参酮,新隐丹参酮,去羟新隐丹参酮,代号为Ro-090680的2-异丙基-8-甲基菲-3, 4-二酮,去甲丹参酮,丹参二醇A、B、C,丹参新酮,1-氢丹参新酮,1-氢丹参酮,1-氧代异隐丹参酮,3a-羟基丹参酮IIA, 1, 2-二氢丹参醌,醛基丹参酮,亚甲二氢丹参酮,7伏羟基-8, 13-松香二烯-11, 12-二酮,1,2,5,6-四氢丹参酮,4-亚甲丹参新酮,丹参酚醌,鼠尾草呋萘嵌苯酮,丹参内酯,二氢丹参内酯,丹参螺缩酮内酯,表丹参螺缩酮内酯,丹参螺缩酮内酯I,就是丹参隐螺内酯,表丹参螺缩酮内酯I,就是丹参隐螺内酯,鼠尾草酮,鼠尾草酚酮,丹参酮二酚。
丹参环庚三烯酚酮等;属其他类型结构的有:降鼠尾草氧化物,弥罗松酚,鼠尾草酚,柳杉酚等。
水溶性成分酚性酸化合物有:丹参酸A、B、C,丹参酸A又称丹参素,其结构为D(+)-0-(3, 4-二羟基苯基)乳酸,丹参酸B是由3分子的丹参素和1分子的咖啡酸缩合形成的,就是丹参酚酸B;丹参酸C是2分子丹参素的缩合物;丹参酚酸A、B、C、D、E、G;迷迭香酸,迷迭香酸甲酯,紫草酸草酸单甲脂,紫草酸二甲酯,紫草酸乙酯,紫草酸B,原儿茶醛,咖啡酸,异阿魏酸等。
还含黄芩甙,异欧前胡内酯,熊果酸,快谷甾醇,胡萝卜甙,5-(3-羟丙基)-7-甲氧基-2-(3'-甲氧基4-羟苯基)-3-苯并[b]呋喃甲醛,替告皂甙元,豆甾醇等。
(2)药理作用和功效丹参有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效。
现代药理学的研究表明, 它具有多方面的药理作用。
对心血管系统可增加冠脉流量、降低心肌兴奋性和传导性,对急性心肌缺血缺氧所致的心肌损伤具有明显保护作用。
丹参的药用成分

• 2.7 抗肿瘤作用 (1)丹参酮对肿瘤细胞有杀伤作用。体内外
实验研究表明,一方面,丹参酮类化合物
有着广泛的菲醌结构,其中菲环结构与 DNA分子相结合,而呋喃环、醌类结构可 产生自由基,从而引起DNA损伤,抑制肿 瘤细胞DNA合成;另一方面,丹参酮通过 抑制抗增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞增殖 相关的基因表达,影响DNA多聚酶活性, 以抑制DNA合成,从而抑制肿瘤细胞增殖。
• 2.5 抗心肌缺氧作用 孙学刚等〔8〕研究丹参酮对缺氧心肌细胞膜电位 (MP)和线粒体膜电位(MMP)的影响,结果表明丹
参酮能显著降低因缺氧引起的心肌细胞钙离子 [Ca2+]的升高,抑制缺氧细胞钙超载,减少触发
活动和折返,降低心率而防治心律失常;并且通
过降低细胞膜离子通透性,抑制因缺氧导致的离 子顺浓度梯度透过细胞膜,减少钙离子[Ca2+]内 流导致的细胞内钙离子[Ca2+]增加和K+外流导致 的细胞内K+减少,从而升高了缺氧引起的MP和 MMP降低,使缺氧状态下心肌细胞膜电位(MP)和
• 2O世纪9O年代,学者们发现丹参的主要作用在 于其水溶性酚酸类物质,从中可分离出丹酚酸、 迷迭香酸、咖啡酸等27种成分,其中丹酚酸A、 丹酚酸B的抗氧化活性比维生素E强百倍至千倍。 中科院上海药物所发现,以丹参乙酸镁为主要成 分的丹参多酚酸盐是丹参中最重要的有效活性物 质, 其在抗氧化、抗凝血、细胞保护、扩张血管、抗 衰老等方面具有明显作用。2005版国家药典首次 将丹酚酸B作为丹参片的质控标准。
• 3.1.3 妇科感染性疾病 张敏〔19〕应用丹参酮配伍甲硝唑治疗细 菌性阴道病,实验组口服丹参酮,3片/次, 3次/d,14d为一疗程;阴道填塞甲硝唑栓 0.5 mg,每晚1次,7d为一疗程。对照组阴 道填塞甲硝唑栓0.5 mg,每晚1次,7d为一 疗程。两组均随访3个月,于每月月经后来 院复查。实验组60例中,总有效率100% ; 对照组58例中,总有效率66%。
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丹参水溶性成分与脂溶性成分抑菌作用的考察(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)作者:周静李惠芬王洪志骆达杜凡王宇歆吴咸中【摘要】目的考察丹参中水溶性成分与脂溶性成分的含量及其抑菌作用。
方法采用HPLC法测定丹参素、原儿茶醛和丹参酮ⅡA含量;以平板二倍稀释法统计最小抑菌浓度(MIC),探讨其体外抑菌作用。
结果丹参水溶性成分和脂溶性成分均对金黄色葡萄球菌标准株、临床株;大肠埃希菌标准株;铜绿杆菌标准株;大肠杆菌临床株1、临床株2有抑菌作用,两种抑菌药液均对金黄色葡萄球菌标准株、临床株作用最强,对大肠埃希菌标准株作用相对较弱;水溶性成分的抑菌作用强于脂溶性成分。
结论丹参水溶性成分与脂溶性成分均具有一定的抑菌活性,提示该作用可进一步开发利用。
【关键词】丹参丹参素原儿茶醛丹参酮ⅡA 抑菌Abstract:ObjectiveTo investigate the content of liposoluble and hydrosoluble constituents in Salvia miltiorrhiza Bge. and its antibacterial effect.MethodsThe contents of danshensu,protocateehualdehyde and salviolⅡAwere determined by HPLC and the antimicrobial effect was obseved according to MIC by the method of plate doubling-dilution.ResultsThe liposoluble and hydrosoluble constituents of Salvia miltiorrhiza Bge. had some inhibition on all bacterial species in our experiments, especially the strongest on Staphylococcus aureus,the weakest on Bacillus coli; moreover, the hydrosoluble constituent had stronger effect than the liposoluble one.ConclusionThe antibacterial active components of Salvia miltiorrhiza Bge. need to make better use.Key words:Salvia miltiorrhiza Bge.; Danshensu; Protocateehualdehyde; SalviolⅡA; Antibacterial effect丹参Salvia miltiorrhiza Bge.属唇形科植物,其药用部位为干燥根及根茎,味苦,性微寒[1],归心、肝经,具有祛淤止痛、活血通经、清心除烦等功效[2],临床广泛用于活血化瘀、宁心安神、抗菌消炎和心脑血管疾患等症,是国内外现代化中药研究的热点品种之一[3]。
丹参的化学成分主要为水溶性成分和脂溶性成分两部分。
本文比较了多种提取方法,建立了从同一样品中分步先后提取脂溶性与水溶性成分,并应用高效液相色谱法优化筛选了色谱条件,使之在同一梯度条件下完成丹参中3种活性成分丹参素、原儿茶醛和丹参酮ⅡA的定量分析。
丹参有关心血管方面的药理研究已相当深入,但其抑菌方面的研究报道较少,多为水煎液或对照品丹参酮ⅡA的抑菌报道,未见丹参的抑菌有效部位及其成分的抑菌研究。
本实验先于定量之后,准确把握抑菌浓度再行相关抑菌研究,以期为临床应用其抗菌消炎作用提供科学依据。
1 仪器与材料美国SSI高效液相色谱仪,分析之星色谱工作站,乙腈为色谱纯、水为双蒸水、磷酸为分析纯。
丹参素钠对照品,原儿茶醛对照品,丹参酮ⅡA对照品(中国药品生物制品检定所)。
丹参药材购自天津中药饮片厂(经天津中医药大学第一附属医院尚英和药师鉴定)。
金黄色葡萄球菌标准株,临床株;大肠埃希菌标准株;铜绿杆菌标准株;大肠杆菌临床株1,临床株2(均由天津医科大学微生物教研室提供)。
2 方法和结果2.1 水溶性成分丹参素、原儿茶醛和脂溶性成分丹参酮ⅡA的测定2.1.1 色谱条件色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相A:0.4%磷酸水溶液,流动相B:乙腈,流速为1.0 ml/min,检测波长为275 nm,柱温40℃,梯度洗脱:0~10 min,4%B;10~16 min,10%B;16~20 min,15%B;20~30 min,20%B;30~50 min,70%B;50~58 min,100%B。
2.1.2 对照品溶液的制备精密称取一定量原儿茶醛、丹参素钠对照品,各置10 ml棕色容量瓶中,加70%甲醇定容,均配成1 mg/ml 溶液,后者相当于丹参素0.875 mg/ml,另称一定量丹参酮ⅡA对照品,以甲醇溶解按上述方法配成0.232 2 mg/ml的溶液;分别吸取丹参素钠、原儿茶醛和丹参酮ⅡA标准溶液各400,25,60 μl于1 ml 容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,即得0.4 mg/ml丹参素钠、0.025 mg/ml 原儿茶醛和0.013 93 mg/ml丹参酮ⅡA的混合对照品溶液(10℃以下保存)。
2.1.3 供试品溶液的制备取丹参药材置烘箱中50℃干燥,粉碎过60目筛。
精密称取干燥粉末4 g,加95%乙醇100 ml于圆底烧瓶中,以索氏提取器提取1 h,控制温度75℃,收集提取液于100 ml容量瓶中,加乙醇稀释至刻度,摇匀,得脂溶性部位提取液。
再加蒸馏水150 ml于圆底烧瓶中,在索氏提取器中继续提取16 h,注意控制温度保持微沸状态,浓缩提取液转至100 ml容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀即得水溶性部位提取液,备用。
各取以上提取液0.5 ml,混匀作为供试品溶液。
2.1.4 标准曲线的制备精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液3,4,6,8,12,14 μl进样测定,以峰面积为纵坐标,质量为横坐标绘制标准曲线,计算丹参素、原儿茶醛、丹参酮ⅡA三者的回归方程分别为Y=334 759X-55 813(r=0.999 4);Y=4E+06X-49 201(r=0.999 6);Y=5E+06X+1 804.9(r=0.999 4);知三者分别在1.2~5.6 μg,0.075~0.35 μg,0.042~0.20 μg范围内与峰面积线性关系良好。
2.1.5 精密度实验精密吸取同一混合对照品溶液10 μl,重复进样6次,测定峰面积,三者RSD分别为1.63%,1.34%,1.71%。
结果表明,仪器精密度良好。
2.1.6 含量测定依法测定混样中脂溶性成分丹参酮ⅡA的含量为105.29 μg/ml,水溶性成分丹参素、原儿茶醛含量依次为347.6,290.4 μg/ml。
2.2 体外抑菌作用2.2.1 药液的制备将“2.1.3”项水溶性部位供试液,作为水溶性部位抑菌药液;同前将脂溶性部位供试液旋蒸,除尽乙醇溶剂后,以生理盐水溶解至1/4体积,作为脂溶性部位抑菌药液,备用。
2.2.2 培养基的配制将MH琼脂加水煮沸融化后,分装于试管内,每管20 ml,高压灭菌(121℃)1 h,取出后,置于80℃水浴,备用。
2.2.3 含药琼脂平板制备根据实验设计,将已倍比稀释的不同浓度的抑菌药液分别加入已平衡的琼脂中充分混匀倾倒至灭菌平皿,琼脂厚度约4 mm。
另设蒸馏水代替药液为阴性对照。
2.2.4 接种菌的制备分别从保存菌种的培养基斜面上将上述各菌株移至培养基中,37℃培养18 h,制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液,相当于1.5×108/ml,在15 min之内接种。
2.2.5 琼脂稀释法进行最低抑菌浓度的抑菌评价用移液器取已校正浓度的待测菌液2 μl,滴加于含药琼脂表面,使用接种环将每一接种点直径控制在5~8 mm之间,待接种物被培养基吸收后,将平板置于35℃培养箱中,倒置培养18 h后观察结果。
每个实验重复3次。
凡肉眼无细菌生长的药物最低浓度为最低抑菌浓度(MIC)。
2.2.6 抑菌结果由表1可见,丹参水溶性成分和脂溶性成分均对金黄色葡萄球菌标准株、临床株;大肠埃希菌标准株;铜绿杆菌标准株;大肠杆菌临床株1、临床株2有抑菌作用,两种抑菌药液均对金黄色葡萄球菌标准株、临床株作用最强,对大肠埃希菌的标准株作用相对较弱。
另外发现,水溶性成分的抑菌作用强于脂溶性成分。
表1 丹参水提液和醇提液的抑菌结果(略)3 讨论3.1 抑菌药液提取方法的比较对于脂溶性成分提取方法的筛选,先后考察了以乙醇作溶剂的索氏提取、热提及超声提取3种方法,其中索式提取含量最高,热提居中,超声提取最低,故本实验采用索式提取法。
实验中还发现索提1h丹参酮ⅡA的含量高于2h,故确定1h 提取,这可能与丹参酮ⅡA受热过长分解有关。
对于水溶性成分提取方法的筛选,主要以水作溶剂比较了上述3种方法,其中也以索提最佳,提取时间根据HPLC分析,16 h提取完全。
3.2 色谱条件的优化2005版《中国药典》对于水溶性成分和脂溶性成分的含量测定,分别采用不同的色谱条件进行分析,本文经多次实验筛选,建立了同一色谱条件下同时测定水溶性成分丹参素、原儿茶醛及脂溶性成分丹参酮ⅡA3种成分含量的方法。
实验中曾尝试了4种梯度,梯度比依次为①0~10 min,4%B;10~50 min,80%B;50~53 min,100%B;② 0~10 min,4%B;10~15 min,6%B;15~50 min,80%B;③0~10 min,4%B;10~16 min,16%B;16~20 min,26%B;20~25 min,30%B;25~50 min,80%B;50~53 min,100%B;第4梯度同前述。
其主要区别在于10~50 min的两相配比的梯度变化不同。
第1梯度,A相降低迅速,流动相极性变弱,水溶性峰堆积;第2梯度,虽增加一过渡平台,但流动相极性变化还是过快,峰形仍有叠加现象;第3梯度,流动相极性变化又过缓,不仅使脂溶性成分拖后,且与相邻峰重叠,采用第4梯度,水溶性成分保留时间恰当,脂溶性成分分离完全,峰形良好。
3.3 丹参抑菌活性实验的比较与以往文献对比[4,5],丹参抑菌活性实验多采用水煎液或对照品丹参酮ⅡA作为抑菌药液,前者除裹带了过多杂质,还未提出脂溶性成分,即实际上降低了有效的抑菌浓度,导致最低抑菌浓度实验结果偏高;后者仅利用脂溶性成分,尚缺水溶性抑菌成分,也是不完全的实验结果。