ABO血型鉴定正反定型试验方法
实验一ABO正反定型及Rh定型、唾液血型物质检测
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唾液中HAB血型物质测定
【目的】
了解唾液HAB血型物质测定的原理、方法。
【原理】
HAB血型物质也存在于某些人的分泌液中。唾液中 HAB血型物质为半抗原，能特异性地与相应抗体结 合，从而抑制抗体与相应红细胞发生凝集。所以利
用凝集抑制试验，可测定唾液中HAB血型物质，它 有助于ABO亚型的分类及其特殊情况下血型的鉴定
(3)室温轻转动玻片(或鉴定纸板) ，使血清与细胞充
分混匀连续约2min，肉眼观察凝集(溶血)反应。玻片
试验时可用低倍镜观察结果。
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表l ABO血型正反定型结果
试剂血清+受检红细胞 （正定型）
-A -B 受检血型
受检血清+试剂红细胞 （反定型）
Ac Bc Oc
＋－
A
－＋
B
－－
O
＋＋
AB
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【器材】 小试管、滴管、试管架、记号笔、离心机
【试剂】 1. ５％A、B和O型红细胞盐水悬液。 2. 最适稀释度抗血清的制备（标化血清）
【标本】受检者唾液
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1.被检者漱口后留取自然流出的唾液2ml，将留取 的唾液1000g离心，取上清液置于大试管中，煮 沸10min，再离心10min，留取上清液备用。
－＋ － ＋－ － ＋＋ － －－－
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注意事项 1.试剂 2.悬红 3.蛋白 4.溶血 5.冷抗体 6.老年、儿童 7.污染
作业 简述ABO血型鉴定正反不一致的原因
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红细胞凝集强度判断标准 4+ 红细胞凝集成一大块，血清清晰透明。 3+ 红细胞凝集成大小块，血清清晰。 2+ 红细胞凝块分散成许多小块，血清清晰。 l+ 肉眼可见大颗粒，周围有较多游离红细胞。 ± 镜下可见数个红细胞凝集在一起，周围有很多游离
ABO血型的鉴定
反向定型 标准红细胞+被检查血清
A型红细胞 _ + _ + B型红细胞 + _ _ + C型红细胞 _ _ _ _
结果判断
A型 B型 AB型 O型
鉴定方法及评价
1、生理盐水凝集法； 2、微柱凝胶法； 3、血型定型试剂卡法。
1、生理盐水凝集法
2、微柱凝胶法
• 一种新的免疫学检测方法 • 采用单克隆抗体 • 结果可直接观察，也可用血型分析仪 • 灵敏度高
3、血型定型试剂卡法
• 利用免疫检测和分子排阻层析原理 • 能同时进行正反向定型和Rh（D）血型鉴定 • 结果重复性好
ห้องสมุดไป่ตู้
ABO血型的鉴定
ABO血型鉴定的原理
• ABO血型鉴定主要利用抗原与抗体之间的反
应来完成，包括正向定型和反向定型，正 向定型是用已知特异性抗体（标准血清） 检查红细胞上的未知抗原，反之反向定型 是利用已知血型的标准红细胞检查血清中 的未知抗体。
ABO血型正向、反向鉴定及结果判断
正向定型 标准血清+被检查红细胞
• 是临床最常用的方法 • 可以用试管法和玻片法测定 • 玻片法不适用于反定型 • 标准血清来源有两种途径
人血清ABO血型抗体
• 高度特异性； • 高效价； • 高亲和力； • 无冷凝集素； • 无菌。
人ABO血型单克隆抗体
• 来源； • 特异性； • 亲和性； • 效价； • 稳定性； • 无菌； • 灭活补体。
试管法鉴定ABO血型标准操作规程
试管法鉴定ABO血型标准操作规程
试管法鉴定ABO血型标准操作规程
1、目的
为规范输血科ABO血型鉴定的技术操作，确保鉴定结果准确及临床输血安全有效，依据《输血实验室管理程序》4.1.7条款的要求制定本规程。
2、适用范围
本文件适用于本院输血科ABO血型鉴定的操作过程的规范化管理。
3、方法及原理
3.1方法：试管凝集法
3.2原理：根据红细胞上有或无A抗原或/和B抗原，将血型分为A型、B型、AB型及O型4种。
可利用红细胞凝集试验，通过正、反定型准确鉴定ABO血型。
所谓正定型，是用已知抗-A和抗-B分型血清来测定红细胞上有无相应的A抗原或/和B抗原；所谓反定型，是用已知A细胞和B细胞来测定血清中有无相应的抗-A或/和抗-B。
4、试剂
4.1血清抗A（市售）、抗B（市售）、抗A+B（健康O型人血清）；
4.2 5%A、B及0型试剂红细胞盐水悬液；
4.3受检者血清或血浆；
4.4受检者5%红细胞盐水悬液;
5、样本采集及处理
用一次性EDTA-K2真空采血管抽取静脉血1ml，将标示有患者姓名、性别、年龄、住院号、病室/门急诊、床号等信息的标签贴在标本管上，。
ABO血型正 反定型
ABO血型正、反定型操作规程[目的]保证ABO血型鉴定准确，确保临床输血安全。
[适用范围]XXX医院输血科[职责]具有专业技术的工作人员主要负责本院输血（或备血）标本的ABO血型鉴定（但只对该单份标本负责）。
[相关文件]试剂采购、保存和使用管理程序设备采购、使用管理程序消毒与清洁管理程序标本采集、运输、保存和报废管理程序紧急用血管理程序[相关记录]仪器设备的采购、使用和维护记录仪器的温度记录恒温水温箱的换水和消毒记录消毒液的配置记录清洁消毒记录试剂采购、使用记录标本交接和报废记录紧急用血记录[实验原理]ABO血型是根据红细胞表面存在的凝集原决定的。
存在A凝集原的称为A型，存在B凝集原的称为B型。
而血清中还存在凝集素。
当A凝集原与抗A凝集素相遇或B凝集原与抗B凝集素相遇时，会发生红细胞凝集反应。
一般A型血清中含有抗B凝集素，B型血清中含有抗A凝集素，因此可以用标准血清中的凝集素与被测者的红细胞反应（称为正定型），用标准红细胞与被测者血清中的凝集素反应（称为反定型），以确定其ABO血型。
[仪器器械]玻璃试管、玻片、记号笔、一次性塑料滴管、显微镜、普通离心机、试管架、恒温水温箱、试剂保存冰箱、标本保存冰箱。
[试剂]抗A标准血清、抗B标准血清、A型标准红细胞、B型标准红细胞、O型标准红细胞、生理盐水。
以上试剂均为有合格证件的正品。
[标本收集与处理]1．受检者血清：采集受检者静脉血2~3ml，经1000r/min离心1分钟或室温静置1小时后取上清。
2．2~5%的受检者红细胞：采集受检者静脉血或末梢血，用生理盐水制成2~5％红细胞盐水悬液备用，制备方法见本节质量控制和注意事项。
3．标本出现中度以上溶血者，为不合格标本，不能用于检测。
[实验方法与步骤]血型的正定型（试管法）：⑴、取2支试管，分别标上抗A 和抗B ；⑵、制备待测标本2~5%的红细胞悬液（取1支试管，加入2ml 生理盐水，再加入1滴待测标本红细胞，混匀备用）；⑶、在抗A 管中加入2滴抗A 标准血清，在抗B 管中加入2滴抗B 标准血清；⑷、在抗A 和抗B 管中分别加入1滴已制备好的待测标本2~5%红细胞悬液； ⑸、混匀后，立即对称放入离心机中进行1000r/min 离心1分钟，或室温静置1小时，再轻轻摇动试管，使沉于管底的红细胞浮起，先肉眼观察有无凝集现象，如内眼不见凝集，应将反应物倒于玻片上，再以低倍镜检查。
卡式ABO正反定型和RhD操作规程
1.方法原理：根据红细胞上有或无A抗原或／和B抗原，将血型分为A型、B型、AB 型及O 型4种。
可利用红细胞凝集试验，通过正、反定型准确鉴定ABO血型。
所谓正定型，是用已知抗—A和抗—B分型血清来测定红细胞上有无相应的A抗原或／和B抗原；所谓反定型，是用已知A细胞和B细胞来测定血清中有无相应的抗-A或／和抗-B。
DiaMed系统采用微柱凝集技术，在微柱中加入凝胶，凝胶的间隙起到了分子筛的作用，通过离心来分离凝集和非凝集的红细胞，从而达到检测目的。
2.仪器：达亚美离心机3.试剂及配套品： ABO正反定/Rh定型卡，达亚美2号稀释液（ID-Diluent2），标准红细胞A1和B。
4.样本要求：4.1血样最好用枸橼酸、EDTA或CPD-A抗凝。
若需要用血清替代血浆进行检测时，应在用前离心，1500g×10min，以免纤维蛋白残余干扰反应结果。
4.2 样本准备：5%样本红细胞制备：压积红细胞25 μl或全血50 μl悬浮于0.5 ml达亚美2号稀释液中。
5.操作程序 :5.1 取50μl A1,B 标准细胞（0.8%）分别加入A1,B管中。
5.2 取50μl 血清或血浆加入A1,B管中。
5.3 取10μl 5% 样本红细胞加入A, B, D, Ctl管中。
5.4离心10 分钟。
判读结果。
记录。
5.5 阳性（＋）：细胞在凝胶表面凝集成一条红线或散布在凝胶中。
阴性（－）：细胞沉积在管底。
双相（d.p.）：既有阳性结果，同时也有阴性结果。
溶血（Hemo）：红细胞溶解，作为阳性结果对待。
5.6 ABO血型判断6.临床意义6．1临床输血：当循环血量不足或大失血或贫血需进行输血治疗，医学教.育网搜集整理在输血前必须先选择血型相同的供血者，再进行交叉配血，完全相同后才能输血。
6.2在皮肤、肾移植等器官移植的时候选择ABO血型相符的供体。
6.3不孕症和新生儿溶血症病因的分析。
6.4亲子鉴定等。
7.支持性文件：7.1中华人民共和国卫生部医政司.全国临床检验操作规程.第二版，东南大学出版社，19977.2 邱艳主编.全血成分血质量要求与血液标准化.中国标准出版社，2003 7.3 刘达庄主编．免疫血液学.上海科学技术出版社，2002.7：128-1377.4王培华主编.输血技术学.人民卫生出版社，第二版，20037.5李勇杨贵贞主编.人类红细胞血型学实用理论与实验技术.第一版,中国科学技术出版社，1999。
输血科常用实验及工作体
微柱法抗体筛选阳性，选择3袋微柱法配血均相合是否说明抗体筛选为假阳性？
微柱法抗体筛选阳性，是否可用凝聚胺法直接配血选择相合血液？
问题讨论：
试管法正定AB，A抗原弱于B抗原，但是结果明显
试管法正反定型复检：正定AB，反定B型，怀疑特殊血型或标本问题
怀疑A亚型B，产生抗A（以上试验我科完成）
微柱法正反定型，正反定型相符为B型，抗A抗体很强与正常抗A无差异，怀疑初检血型错误
ABO血型鉴定（微柱法）
1
2
3
4
假阳性反应可见于：
ABO血型鉴定（微柱法）
正常的红细胞有一定的变形性，可以通过小于其直径的凝胶间隙，而镰形红细胞贫血的病人红细胞变形能力降低，刚性增大，不能透 过凝胶间隙，故出现假阳性。
镰刀形红细胞贫血病人在做血型配血时易出现假阳性：
病人血清或血浆中的白细胞过多，堵塞了凝胶间隙，从而影响了红细胞的沉降，造成假阳性。（曾遇到一例）
B(A)血型血清学特点
谢谢！
汇报时间
汇报人姓名
ABO血型鉴定（试管法）
常见问题解决 ABO亚型 正定：抗-A、抗-B、抗-AB、抗-A1、抗-H 反定：A1c、A2c、Bc、Oc、自身对照 吸收放散 唾液型物质检测 有条件者可作家系调查
01
02
03
04
05
吸收放散
酶处理红细胞
唾液型物质检测
延长孵育时间、4℃孵育
既往血型调查
A、B抗原减弱
ABO血型鉴定（试管法）
用谱细胞做抗体鉴定
01
选择没有相应抗原的A、B细胞做反定型
02
室温反应的同种抗体
ABO血型鉴定（试管法）
原理：是生物化学凝胶过滤技术和免疫学抗原抗体反应相结合的产物，通过调节凝胶的浓度来控制凝胶间隙的大小。使其间隙只能允许游离的R BC通过，从而使游离RBC与聚集RBC分离。如果通过离心RBC沉积在凝胶管底部，则表明RBC未发生凝聚凝集，是阴性反应， 若RBC聚集在凝胶带上部，则表明RBC发生凝集，呈阳性反应。其本质仍是凝集试验（凝胶可能不同，长春为葡聚糖。）
血型鉴定试管法的应用
目录
• 试管法血型鉴定的操作及注意事项 • ABO正反定型不符的原因分析及解决
方法
试管法ABO血型鉴定的操作步骤
• 试管法测定ABO血型 1、正定型 在2只分别标记抗A、抗B干净试管中分别加入相应的试剂；在每个试管中
各加1滴2-5%受检者的红细胞悬液；轻轻混匀，离心15秒（3400转/分），轻 轻重悬细胞扣，检查凝集情况；判读结果，与反定型结果比较。 • 2、反定型
ABO定型常见问题的解决方法
冷自身抗体 ➢ 用37℃温盐水洗涤红细胞、56℃热放散。 ➢ 巯基试剂(DTT、2-Me)处理红细胞。 ➢ 将血浆和红细胞分别在37℃孵育5-10分钟后 再进行试验。 ➢ 自身吸收、O型红细胞吸收吸收去除血浆中的 冷自身抗体
ABO定型常见问题的解决方法
室温反应的同种抗体 ➢ 用谱细胞做抗体鉴定。 ➢ 选择没有相应抗原的A、B细胞做反定型。 ➢ 常见抗体：MN、Lewis、P血型系统抗体。
蛋白凝集
蛋白凝集
盐水法——蛋白凝集
• 加生理盐水前
盐水法——蛋白凝集
• 加生理盐水后，凝集消失
ABO定型常见问题的解决方法
ABO亚型 ➢ 正定：抗-A、抗-B、抗-AB、抗-A1、抗-H ➢ 反定：A1c、A2c、Bc、Oc、自身对照 ➢ 吸收放散试验 ➢ 唾液型物质检测 ➢ 血型基因检测 ➢ 有条件者可作家系调查
实验程序
反应
条件
-A
IS
二次
多次
人源
ABO正定型
反应
-B
-A1
-AB 条件
Ac
4oC
ABO反定型
Bc
Oc
自身c
ABO血型定型试剂
抗-H
抗-H 用于检测ABO亚型及孟买、类孟买型。 ( A或B亚型H抗原增强，孟买 、类孟买H抗原阴性。) 注意：
ABO血型疑难定型
ABO疑难定型ABO系统是唯一一个在红细胞上缺乏相应抗原的情况下其血清或血浆中存在对应抗体的最重要的血型系统。
因此ABO定型必须进行正反定型并且正反定型结果相一致的前提下才能准确鉴定ABO血型。
在正定型试验中，一般我们使用抗-A和抗-B来检测红细胞上是否存在A和/或B 抗原，反定型试验中使用A和B型标准试剂红细胞来检测血清/血浆中是否存在抗-A和/或抗-B 抗体。
一般而言，正反定型的结果互相一致。
但在一些特殊的情况下，正反定型的结果相互不一致，在本文中分析了ABO正反定型不一致的原因，并对不同的原因加以分析解决，即分别在正定型和反定型中增加一些试剂来更进一步的细化检测红细胞上的抗原和血清/血浆中可能出现的抗体，并通过型物质测定及吸收放散等方法来准确定型。
一、ABO疑难血型鉴定的方法（一）正反定型：正定型：-A, -B，-AB, -H, -A1反定型：Ac, Bc, Oc, 自身对照1. ABO正定型中各种试剂用途疑难定型中正定型用抗血清抗-A及抗-B抗-AB:确认弱A和弱B抗原,与弱A及弱 B抗原亲和力强,会产生强反应抗-H:用于检查亚型及孟买型, A亚型红细胞上的H抗原多于正常A型抗-A1: 用于A亚型(如A2, A3)检测2. H抗原在红细胞上的分布3. ABO反定型中各种试剂的用途反定型中试剂红细胞的意义A及B细胞: 确认抗-A或抗-B抗体O型红细胞:检查是否存在ABO系统以外抗体干扰ABO反定型自身对照: 用于确认正反定型结果的有效性,排除自身抗体对定型的干扰(如冷凝集等) A2细胞: 用于亚型的鉴定, 尤其是在怀疑是A亚型且又存在抗-A1抗体的情况下（二）型物质测定型物质准备：1~2ml唾液，沸水煮10分钟，离心后得到的上清。
标清的调制：标清用盐水稀释至其效价为1：16中和：将0.5ml型物质与调制后的标清0.5ml等体积混合,室温放置30分钟检测：用Ac检测中和后的抗-A, Bc检测中和后的抗-B.结果判断：如果抗-A被中和，则被检者为A型，如果抗-B被中和，则被检者为B型。
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ABO血型鉴定正反定型试验方法
一、试剂和材料：
（一）单克隆抗A、抗B试剂（由试剂厂家提供）
（二）显微镜、载玻片
（三）A型、B型红细胞（本实验室制备的5%混悬液）
（四）EDTA抗凝的待测红细胞全血
（五）竹签
二、方法（玻片法）：
（一）正定型：
1. 在一块干净的玻片上，间隔一定距离做好标记，分别滴一滴抗A和抗B试剂；
2. 在每滴试剂中加一滴待测红细胞全血；
3. 用竹签混匀试剂和红细胞，并使混合物直径＞15mm；
4. 轻摇玻片，两分钟内观察结果，必要时可以在低倍镜下观察；
5. 判读、解释并记录反应结果。
（二）反定型：
1. 在玻片上间隔一定距离标明Ac和Bc字样。分别滴加5%的A型红细胞悬液、B型
红细胞悬液各一滴；
2. 在玻片每滴红细胞悬液上滴加待测血清各一滴；
3. 混匀（同正定型）；
4. 轻摇玻片，两分钟内观察结果，必要时可以在低倍镜下观察；
5. 判读、解释并记录反应结果。
6. 结合正反定型反应结果、判定血型，见表1
表1ABO血型正反定型试验结果判定
正定型 反定型 血型
抗体试剂+红细胞标本 红细胞试剂+血清标本
抗A 抗B A细胞 B细胞
+ O O + A
O + + O B
O O + + O
+ + O O AB
三、附注：
（一）表中“O”表示无凝集，“+”表示凝集，一般都是3-4个+的强凝集反应；
（二）2分钟后红细胞仍呈均匀混悬状态是阴性反应；
（三）若得到弱的或可凝集反应结果，该标本应用试管法重新试验；
（四）由于新生儿在出生4~6个月内，血浆中的ABO抗体活动太弱，并且含有来自
母亲的抗体，故新生儿血型只能由检测红细胞抗原的正定型来测定其ABO血型；
（五）做正定型时，还可加一抗A、B血清（O型人血清），以检测ABO弱抗原；做
反定型时可以加试一O型红细胞，借以证实是否有不规则抗体的存在。