江苏1株鸡传染性贫血病毒的分离鉴定
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江苏1株鸡传染性贫血病毒的分离鉴定
作者：杜宗沛等
来源：《江苏农业科学》2015年第09期
摘要：利用MDCC-MSB1细胞系从江苏省泰州市发病鸡中分离获得1株病毒，通过间接荧光抗体试验（IFA）确定该病毒为鸡传染性贫血病毒（CAV）。利用PCR扩增、电泳、克隆、核酸测序得到全长2 324 bp的基因编码区序列，该序列碱基完整，无缺失和插入。经遗传学方法分析发现，该株序列与GenBank中已收录的可见CAV序列同源性为96.5%～99.8%。CAV的3个编码基因序列VP1（1 315 bp）、VP2（643 bp）、VP3（366 bp）均有不同程度变异，以VP1变异程度最大。使用电子显微镜观察到病毒粒子与鸡传染性贫血病毒一致，证实该病毒为鸡传染性贫血病毒新亚型，将其命名为CAV MY1305-30株并提交至GanBank，编号为KF318725、KF318726。
关键词： 鸡；传染性贫血病毒；分离鉴定；基因序列；编码
中图分类号： S855.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0244-03
鸡传染性贫血病（Chicken infectious anemia，CIA）最早被称为贫血综合征、贫血-皮炎综合征、出血性贫血病、贫血因子病等，其病原于1979年被首次分离并确定，早期称其为鸡贫血因子（chicken anemia agent，CAA）、鸡传染性贫血病毒（chicken infectious anemia virus，CIAV），之后逐渐统一称作鸡贫血病毒（chicken anemia virus，CAV）。CAV的核酸为环状单股负链DNA，在1995年第6次国际病毒分类大会上将其与猪圆环病毒（PCV）、长尾鹦鹉啄羽病病毒（PBFDV）一起归属于圆环病毒科（Circoviridae），该科病毒是已知最小的动植物病毒，因此很少有人能通过电子显微镜观察到CAV。从CAV感染的MDCC-MSB1（鸡马立克氏病成淋巴细胞样细胞系）细胞培养液中纯化的病毒粒子，经负染后在电子显微镜下呈直径约为20 nm的球状。CAV对乙醚、三氯甲烷均有抵抗力；对酸（pH值为3）作用3 h后仍保持稳定；对56 ℃下 120 min、70 ℃下60 min、80 ℃下15 min的处理均有抵抗力。鸡传染性贫血病的特征性病理变化为骨髓黄化和胸腺萎缩。发病鸡骨髓中的红髓组织被脂肪组织替代，呈黄色；胸腺严重萎缩，其大小仅为正常鸡的1/10。鸡传染性贫血病广泛流行于世界各地，呈垂直和水平传播[1]。
1材料
1.1待检样品
1日龄雏鸡来自江苏省泰州市，用间接酶联免疫吸附（ELISA）检测其父母代种鸡群血清，CAV阳性率高达87%。
1.2试剂和细胞 龙源期刊网
exTaq DNA聚合酶、rTaq DNA聚合酶、dNTP、DL2 000 DNA Marker、酚氯仿异戊醇、蛋白酶K均购于大连宝生物工程有限公司；无水乙醇、三氯甲烷均购于天津市富宇精细化工有限公司；琼脂糖购于上海英俊生物技术有限公司；EB替代物购于北京普利莱基因技术有限公司；工程菌DH5α、单克隆抗MDCC-MSB1细胞、CAV毒株阳性对照均由笔者所在实验室保存与提供。细胞培养液配方为83% RPMI 1640、15%胎牛血清、1%双抗、1%谷氨酰胺；细胞维持液配方为93% RPMI 1640、5%胎牛血清、1%双抗、1%谷氨酰胺；细胞冻存液配方为基础培养液、30%～40%胎牛血清、10% DMSO。
2方法
2.1样品的采集与处理
于江苏省泰州市发生鸡传染性贫血病的某鸡场采集 10～50 日龄的病鸡或病死鸡，在生物安全实验室内对其进行剖检，采集雏鸡的肝、脾、胸腺等组织脏器，充分研磨后用灭菌生理盐水制成悬浊液，加入终浓度为1 000 U/mL的双抗，于37 ℃下感作60 min。将其反复冻融3次后进行超声波处理，将1 000 g离心4 min后取上清，于70 ℃水浴处理5 min，再经体积分数50%的三氯甲烷处理15 min，离心并取上清，经 0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌后，置于-70 ℃保存待检。其中一份用于PCR的初步检测，另一份用于病毒的分离培养。
2.2回归试验
将分离毒株的第4代至第6代MSB1细胞培养物分别腹腔接种于1日龄SPF鸡0.2 mL/羽。于接种后14 d迫杀，测定HCT值，并进行病理剖检及病理组织学检查。
2.3MDCC-MSB1细胞培养分离
将含病毒样品接种MDCC-MSB1细胞，每2～3 d盲传1代，每日观察细胞病变（CPE），当70%～80%的细胞崩解或代谢停止时收毒[2]，并置于-20 ℃保存备用。
2.4免疫荧光染色试验
取分离毒株细胞培养物和T K5803分别接种MDCC-MSB1细胞（3.0×105个/mL），于48
h后收集细胞培养物，以1 000 r/min离心5 min，将细胞沉淀用PBS洗3次并涂于载玻片，干燥后用冷丙酮固定10 min。接种1日龄SPF鸡的组织切片，也按同样方法固定后作为待测抗原，进行间接免疫荧光染色，并用荧光显微镜观察。
2.5分离毒株的CAV抗原检测
将1株分离毒株的细胞培养物经超声波破碎后离心，除去细胞碎片，用PEG浓缩后负染，进行电子显微镜观察。 龙源期刊网
2.6样品的PCR初步检测
2.6.1引物设计 根据已发表的CAV Cux-1、TR20等毒株的基因组序列设计并合成检测引物，用于样品的PCR检测。扩增靶基因的理论长度为582 bp，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
2.6.2组织DNA的提取 采用蛋白酶K裂解法提取组织中的核酸，操作步骤如下：（1）取200 μL组织研磨液移至1.5 mL 的EP管中；（2）向EP管中依次加入300 μL PBS、5 μL 蛋白酶K、60 μL 10% SDS，于56 ℃水浴消化1 h后，至微波炉中高火处理1～2 min，使其透明澄清；（3）向各管加入等体积的酚氯仿异戊醇，以12 000 r/min离心10 min；（4）将上清液移至新的1.5 mL EP管中，重复步骤（3）；（5）取上清液并加入等体积三氯甲烷，以12 000
r/min离心10 min；（6）取上清液并加入2倍体积的无水乙醇、1/10体积的NaAc（3
mol/L），于室温下静置1 h后，以12 000 r/min离心 10 min；（7）弃上清并加入500 μL 70%乙醇，以12 000 r/min离心 15 min；（8）弃上清，干燥5 min后加入40 μL Elution Buffer使其溶解。
2.6.3PCR检测 以病毒DNA为模板，用引物CAV-R、CAV-F 扩增所需目的基因。按反应体系（表1）配制好后混匀并置于PCR扩增仪中，运行如下程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，循环35次；72 ℃延伸10 min，结束后于4 ℃保存。
表1 PCR 25 μL反应体系
组分 加入体积（μL/支）10×Buffer 2.5DNTP（2.5 mmol/L） 2.0引物CAV-R（20.0
mmol/L） 1.0引物CAV-F（20.0 mmol/L） 1.0rTaq酶 0.5ddH2O 15.5DNA模板（1 μg/μL）2.0合计25.0
2.6.4PCR扩增电泳操作步骤如下：（1）称取1 g琼脂糖，与100 mL的1×TAE缓冲液配成1%琼脂糖溶液。（2）溶解后冷却5～10 min，加入14 μL EB替代物并混匀。（3）架好梳子，倒入琼脂糖溶液，静置30 min使其凝固，移去梳子。（4）将PCR扩增产物与Loading
Buffer缓冲液按 5 ∶1 的比例混匀，并将混匀后的液体加至电泳槽小孔中。（5）重复步骤（4），加入其他剩余PCR扩增产物。（6）选用DL2000的Marker，加至电泳槽小孔中。（7）接通电源，红色为正极、黑色为负极，将电压调至180 V。（8）电泳条带至1/3位置时即可停止，电泳时间约为10～15 min。（9）使用凝胶成像系统进行拍摄并保存。
3结果与分析
3.1 病毒的分离鉴定
感染CAV的MDCC-MSB1传代细胞呈IFA阳性（图1）。分离株CAV经电子显微镜观察，与以往发现的CAV结构一致（图2）。分离株与CAV阳性对照的电泳条带处于同一点位（图3）。 龙源期刊网
3.2序列测定结果
CAV MY1305-30株基因编码区全长为2 324 bp，碱基完整，无缺失和插入。与国际基因库中可见CAV序列进行同源性、亲缘关系的比对分析，结果发现，其同源性为96.5%～998%。CAV的3个编码基因序列VP1（1 315 bp）、VP2（643 bp）、VP3（366 bp）均有不同程度变异，其中VP1的变异程度最大。
3.3核苷酸和氨基酸位点的改变
由VP1基因比对序列结果可知，MY1305-30属于A3亚分支。在683位核苷酸中该点为T，而JAPAN-ABO46590则为G（图4）。
3.4遗传进化关系分析
将CAV MY1305-30株基因与国际基因库中可见CAV序列进行遗传进化比对分析，绘制遗传进化树。CAV MY1305-30株VP1基因属于以Majority为代表的基因群，与
A3 JAPAN AB046590.亲缘关系最近；与C Australia AF227982.、C Australia EF683159.亲缘关系最远（图5）。
CAV MY1305-30株基因VP2序列与印度的A1 India AY583756 CAV-B亲缘关系最近，与澳大利亚的C Australia AF227982、C Australia EF683159亲缘关系最远（图6）。
4结论与讨论
基因序列分析对比表明，江苏分离株CAV MY1305-30与其他32株CAV病毒编码区的核苷酸基因同源性为96.5%～99.8%；与vp1.seq、B_JS-China_73.seq、A3 JAPAN AB046590.seq株相对比，VP1序列仅有1个碱基不同。单一比对VP1、VP2、VP3的生物开放阅读框架（ORF），CAV MY1305-30与其他32株CAV毒株的核苷酸同源性分别达95.7%、99.1%、98.7%以上，表明该分离株变异不大，且CAV病毒本身变异很小。
不容忽视的鸡传染性贫血病
不容忽视的鸡传染性贫血病 彭军。王宏飞，杨永增 德国罗曼动物保健有限公司北京代表处，北京朝阳１ ＯＯＯ２７） 在近期流行的鸡病中，大家的注 意力大多集中在免疫抑制病、霉菌毒 素、新城疫等方面，我们在一些大型 养殖公司鸡群的临床中还见到一些值 得重视的现象，就是鸡传染性贫血病 （ＣＩＡ）造成的伤害。鸡传染性贫血病 毒是由鸡传染性贫血病毒（ＣＩＡＶ）引 发的，引起小鸡严重贫血、皮下肌肉 出血、骨髓内成红细胞受到破坏，法 氏囊、胸腺萎缩。ＣＩＡＶ既可垂直传播， 又可水平传播。 单纯的鸡传染性贫血感染足以造 成生产上的损失，如果同时伴有呼肠 孤、霉菌毒素中毒等疾病的发生，就 会出现更严重的死鸡、生长障碍和免 疫器官的萎缩（胸腺、法氏囊），雏鸡 ２５ ｄ以后的非典型病和大肠杆菌更加 难以控制，严重影响着养禽业的经济 效益。 本病于ｌ９７９年由日本学者Ｙｕａｓａ 等首先报道并分离到病毒，其后英国、 瑞典、德国、加拿大、美国及中国等 国家都证实了本病的存在，澳大利亚 及其它一些欧洲、非洲、亚洲国家， 通过血清学调查，也发现了鸡群广泛 感染ＣＩＡＶ。目前，鸡传染性贫血病已 被当作重要的世界性禽病。 据国内的文献报导，目前鸡传染 性贫血在我国黄羽鸡和白羽鸡中的感 染率从３０％～１００％不等，全国都有 发生。这是一个必须认真对待的现实。 最近，我们在国内某肉鸡养殖公 司见到ＣＩＡ感染得比较严重的危害。 该公司种鸡场孵化的雏鸡普遍出现生 长迟缓的现象，雏鸡瘦弱、苍白，从 １０日龄以后死亡偏高，２５日龄以后发 病较多，大肠杆菌发生也较为普遍， 难于治愈。雏鸡到３６日龄时的体重仅 仅相当于正常鸡群ｌ５日龄的体重，剖 检病鸡均可以见到胸腺、法氏囊高度 萎缩，骨髓颜色变成浅红色。 在发病鸡场采产蛋种母鸡的血清 以及它们所产的１日龄雏鸡血清送到 中国农业大学赵继勋教授实验室检测， 从结果中可以看到，同群种鸡中有 ９．９％是阴性，９０．１％是阳性，说明鸡 群中正在感染ｃＩＡＶ。 种鸡一般在感染以后３～９周发 生垂直传播，假如种鸡群中的ＣＩＡＶ 可以迅速地感染全群的话，那么，在 这段时间以内产的蛋可以带有垂直感 染的ＣＩＡＶ，雏鸡发生ＣＩＡ是正常的。 但是，现在种鸡场大多采用笼养的方 式，因为成年鸡水平传播最可能的方 式是通过粪便经口腔传播，而在笼养 鸡水平传播速度缓慢，造成ＣＩＡ病 毒在种鸡场的滚动感染，使得种鸡场 生产的雏鸡持续的、长时间的发生雏 鸡ＣＩＡ，给种鸡场带来灾难性的损失。 ＣＩＡＶ病毒除了垂直传播以外，还可以 通过呼吸道将ＣＩＡＶ传播给健康雏鸡， 这就加大了在孵化器和育雏舍雏鸡早 期感染的感染比例，使得阳性种鸡场 垂直传播ＣＩＡ的问题长期不能解决， 而且愈演愈烈。 我们所见到的鸡场中就总有一定感 染比例的种鸡从产蛋开始直到５４周龄， 在所产雏鸡中持续不断地发生ＣＩＡ。 由于一些鸡群中同时还有霉菌毒 素的问题存在，加之使用的ＩＢＤ的疫 苗毒力偏强，我们常可以看到这样的 结果：胸腺极度萎缩甚至难以寻找， 法氏囊萎缩到０．３～０．５ ｃｍ大小，小 到肉眼不好辨别。这样的鸡群，由于 免疫系统受到毁灭性的破坏，加之病 毒对骨髓的破坏，使雏鸡严重的贫血、 生长不良，所以雏鸡在生长中后期不 管发生什么鸡病我们都是可以理解的。 另据韦平等报告，应用多重ＰＣＲ 方法对广西主要养鸡地区的５１４只可 疑鸡传染性贫血与其他禽免疫抑制性 疾病临床病／死鸡进行了检测。结果 显示，鸡传染性贫血病毒（ＣＩＡＶ）与其
鸡传染性贫血病的诊断及防治
兽医雉诊．８５．
４典型病例
病案一：本市开城村一农厂】３岁秦
杂牛就诊。主诉：该牛因久患伤力拉 稀，只吃不上二膘．劳动无力，容易出汗。 笔者随给以补中益气汤１付见效，２付 痊愈。 病案二：２００８年７月，原州区中河乡
丰堡村马某１头４岁牛来就诊。主诉：该 牛１０１３前由于经常使役．时泻时止，曾
灌服氯霉索片、诺氟沙星胶囊，收效甚 微．两目前大便又转溏稀．吃草减少，甚
是顽固。症见形体消瘦，被毛粗乱，精神 沉郁，粪便稀溏完谷不化，唇色淡白，舌
色青 。笔者给服本方１剂痊愈。
５方义
黄氏升补巾气为主药，黄氏、党参
补正气，止虚汗；茯苓强心利尿；白术 补脾治劳倦：五味于收敛肺气；赤石
脂，ｉｉ】『子肉涩汤止泻：青皮、陈皮和解 郁滞之气，使肝木舒畅，以缸通脾土， 互得其养；升麻能提升清阳气于上焦，
不使养分再坠下；山药补虚治体瘦，重
用可生膘：酉蒲强心以补脾虚。以上诸 药总和补气益虚．气足体强．ｒｔ无陷下 拉稀之患，不治泻丽泻 止矣。
６体会
奉瘸以伤力而得．出力就得运气． 气来源于肺，肺气令靠饲料养分的供 给，但是此病一经劳动出力．就是把
胃与小肠内容物的猝分．不是上Ｅ常地
经过消化机能分配到全身各系统七． 而是很怏的ｆ｛｛大肠商下而 肛门。脾 不得养，肺气亦亏，既所谓脾土乍肺
金。按病理来说：“饮食伤胃，劳倦伤 脾，就叫【１］气不足。便会产生脾虚下陷
之症”，就是这病。若按伤力清肺火之 药治疗，是不可能见效的。“治病必先 求其本”，根本治法主要以补中益气为
先，补中既补益ｒ｛１气，中气指中焦脾胃 之气 《中兽医治疗学》指出，“补气血
症以巾焦脾胃为主．因脾胃为水谷之 海，营 气血生化之源，又为后天之
本，如根本败坏，则任何补剂都不会生
效。”升阳是具有补益中气．升阳举陷 的药物，以升提下陷之气，壮其元阳，
故脾气足，则土厚生金，所谓虚则补气 母，“母壮儿肥”就是这个道理。 鸡传染性贫血病的诊断及防治
鸡传染性贫血病的诊断与防治
鸡传染性贫血病的诊断与防治
作者：武治云
来源：《现代畜牧科技》 2015年第7期
武治云
（河北省石家庄市动物卫生监督所 050000）
鸡传染性贫血病(CIA)是由鸡传染性贫血病毒(CIAV)引起雏鸡的以再生障碍性贫血和全身性淋巴组织萎缩为特征的一种免疫抑制性疾病，经常合并、继发和加重病毒、细菌和真菌性感染，危害很大。根据近几年的流行病学调查，鸡传染性贫血病毒在我国鸡群中的感染率约40%～70%。
1 流行病学
鸡是传染性贫血病毒的唯一宿主。各种年龄的鸡均可感染，自然感染常见于2～4周龄的雏鸡，不同品种的雏鸡都可感染发病。随着日龄的增加，鸡对该病的易感性迅速下降，肉鸡比蛋鸡易感，公鸡比母鸡易感。有母源抗体的鸡也可感染，但不出现临诊症状。在火鸡或鸭血中检测不到CIAV抗体，用高剂量的病毒接种1日龄雏火鸡，对感染有抵抗力，并且不产生抗CIAV抗体。
鸡传染性贫血病毒可通过垂直传播和水平传播。经孵化的鸡蛋进行垂直传播认为是本病的最重要的传播途径。由感染公鸡的精液也可造成鸡胚的感染。实验感染母鸡，在感染后8～14天可经卵传播，在野外鸡群垂直传播可能出现在感染后的3～6周。水平传播可通过口腔、消化道和呼吸道途径引起。发病康复鸡可产生中和抗体。
2 临床症状
本病的唯一特征性症状是贫血。一般在感染后10天发病，14～16天达到高峰。病鸡表现为精神沉郁，虚弱，行动迟缓，羽毛松乱，喙、肉髯、面部皮肤和可视黏膜苍白，生长不良，体重下降；临死前还可见腹泻。血液稀薄如水，红细胞压积值降到20%以下（正常值在30%以上，降到27%以下便为贫血），红细胞数低于200万个／mm3，白细胞数低于5000个，血小板值低于27%。在病的严重时期，还可见到红细胞的异常变化。发病鸡的死亡率不一致，受到病毒、细菌、宿主和环境等许多因素的影响，实验感染的死亡率不超过30%，无并发症的鸡传染性贫血患鸡，特别是由水平感染引起的，不会引起高死亡率。如有继发感染，可加重病情，死亡增多。感染后20～28天存活的鸡可逐渐恢复正常。
鸡传染性贫血病毒研究进展
・５２－ 中国兽药杂志 ２０１０，４４（３）：５２～５６／曲鸿飞，等
鸡传染性贫血病毒研究进展
曲鸿飞，李慧姣
（中国兽医药品监察所，北京１０００８１） ［收稿日期］２００９—０５—１１ ［文献标识码］Ａ［文章编号］１００２—１２８０（２０１０）０３—００５２－０５ ［中图分类号］￥８５２．６５９．２
［摘 要］ 对鸡传染性贫血病毒的理化特性、基因组结构及其编码蛋白、复制、致病性和免疫预防
与控制措施等进行了概述。
［关键词］ 鸡传染性贫血病毒；基因组结构；复制；致病性
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｃｈｉｃｋｅｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｎａｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ
ＱＵ Ｈｏｎｇ—ｆｅｉ，ＬＩ Ｈｕｉ—ｊｉａｏ （Ｃｈｉｎａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｂｅ￣ｉｉｎｇ １０００８１；Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ￣Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｇｅｎｏｍｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｒｏｔｅｉｎ—ｃｏｄｉｎｇ，ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ｉｍｍｕｎｅ
ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｅａｓｕｒｅｓ ｏｆ ｃｈｉｃｋｅｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎａｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｗｅｒｅ ｏｖｅｒｖｉｅｗｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ａｒｔｉｃｌｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｈｉｃｋｅｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎａｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ；ｇｅｎｏｍｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ；ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ
鸡传染性贫血病毒（ＣＩＡＶ）又称鸡传染性贫血
因子，引起以雏鸡再生障碍性贫血和淋巴器官萎缩
为主要特征的传染病。１９７９年１３本学者Ｙｕａｓａ首次
报道该病毒，我国于１９９２年…首次从东北地区分离
到该病毒。各种品系的鸡对ＣＩＡＶ均有易感性，主要
发生于２周龄前的雏鸡，其中１～７日龄雏鸡最易感。
鸡传染性贫血病最新研究进展
鸡传染性贫血病最新研究进展
张 宁１ 赵博伟２ 胡晓悦３ 王 珏１ 刘晓慧４ 王学会４
（１河北省畜牧兽医研究所 保定 ０７１０００ ２河北省畜牧兽医局 石家庄 ０５００３１
３河北省动物疫病预防控制中心 保定 ０７１０００ ４河北省保定市出入境检验检疫局 保定 ０７１０００）
鸡传染性贫血病是由圆环病毒科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉ－ｄａｅ）陀螺病毒（Ｇｙｒｏｖｉｒｕｓ）属的鸡传染性贫血病毒（Ｃｈｉｃｋｅｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ，ＣＩＡＶ）引起的，临
床上以贫血、骨髓黄染、全身淋巴组织萎缩和免疫
机能损害为主要特征。１９７９年Ｙｕａｓａ等〔１〕首次分
离到鸡传染性贫血病毒（Ｇｉｆｕ－１株）。该病呈世界
性分布，广泛存在于日本、英国、瑞典、美国、巴西、
阿根廷、澳大利亚、新西兰和南非等国家。１９９２年
我国崔现兰等〔２〕首次从肉鸡群中分离出该病毒。目
前我国山东、河南、江苏、吉林、黑龙江、安徽、广西
等多个省市地区有该病的报道。由于ＣＩＡＶ不仅可
导致雏鸡再生障碍性贫血和免疫抑制，严重影响雏
鸡的生长发育和免疫反应，还可与马立克氏病病
毒、传染性法氏囊病病毒等相互作用，给养殖业带
来了巨大损失，因此该病已成为当前严重危害我国
养鸡业的传染病之一，应引起我们的高度重视。本
文就其病原学、流行病学、临床症状与病理组织学
变化、检测及防制等方面的研究进展作一综述。
１ 病原学
ＣＩＡＶ是一种单股环状的ＤＮＡ病毒，无囊膜，
平均直径为２５．０～２６．５ｎｍ，二十面体对称。在氯
化铯中的浮密度为１．３５～１．３７ｇ／ｍＬ。ＣＩＡＶ只存
在１个血清型。ＣＩＡＶ对理化因素的抵抗性很强，
对丙酮、氯仿、乙醚均不敏感，耐酸、耐热。该病毒
在ｐＨ ３作用３ｈ仍然稳定，碘仿和甲醛可显著降低
其活性，１００℃１ｍｉｎ可将其灭活，在０．０５ｇ／ｍＬ的
次氯酸钠中３７℃２ｈ失去感染力。
１日龄雏鸡、细胞培养和鸡胚能够增殖鸡传染
性贫血病毒。ＣＩＡＶ只能在马立克氏病及某些白血
鸡传染性贫血病毒广东分离株GD-1-12致病性研究
鸡传染性贫血病毒广东分离株GD-1-12致病性研究
张新珩;刘远佳;吴波良;陈峰;孙宝丽;马静云;谢青梅
【期刊名称】《动物医学进展》
【年(卷),期】2014(035)001
【摘 要】从广东省某商品代肉鸡场12日龄生长迟缓的小鸡体内分离到1株鸡传染性贫血病毒(CAV),暂定名为GD-1-12株.分离病毒用MDCC-MSB1细胞进行培养,通过肌肉注射方式感染1日龄SPF鸡,于感染后第7天、第14天、第21天分别检测CAV对SPF鸡体质量、胸腺、脾脏、肝脏、法氏囊及胸腺和外周血液中CD3+T淋巴细胞指标的影响,同时观察鸡的临床症状.结果表明,GD-1-12分离株导致SPF鸡30％的死亡率.感染后第14天,胸腺极度萎缩,肝脏肿大,法氏囊萎缩,脾脏萎缩.感染后第7～14天之间,胸腺和外周血中CD3+T淋巴细胞呈下降趋势.结果表明1日龄SPF雏鸡在人工感染CAV后第7～14天是损伤上述器官的关键时期.
【总页数】5页(P27-31)
【作 者】张新珩;刘远佳;吴波良;陈峰;孙宝丽;马静云;谢青梅
【作者单位】华南农业大学动物科学学院,广东广州510642;华南农业大学兽医学院,广东广州510642;华南农业大学动物科学学院,广东广州510642;华南农业大学动物科学学院,广东广州510642;华南农业大学动物科学学院,广东广州510642;华南农业大学动物科学学院,广东广州510642;华南农业大学动物科学学院,广东广州510642
【正文语种】中 文 【中图分类】S852.659.2;S858.31
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一例鸡传染性贫血病的诊治与体会
一例鸡传染性贫血病的诊治与体会
詹生威
（永安市农业农村局屠宰中队，福建三明366000）文章编号：1004-2342渊2019冤04-0064-02中图分类号院S852.65文献标识码：C
鸡传染性贫血是由传染性贫血病毒感染鸡而
引起，14~27日龄小鸡的患病率最高，其临床多表现
为贫血、全身淋巴组织萎缩和免疫机能损害。近年
来鸡传染性贫血病给养鸡业造成的损失在不断增
加，已经引起世界各个养禽国家的广泛关注，怎样
有效的进行防治成为一大热点[1]。1病原学
鸡贫血病毒是一种小的耐热，抗氯仿病毒，属
于圆环病毒科，陀螺病毒属。该病毒为单股环状的
DNA病毒，无囊膜。世界各地养鸡场都能检出鸡贫
血病毒的抗体，多数养鸡业发达的国家都有发生过
该病。鸡贫血病毒除了感染鸡以外，是否能感染其
它禽类目前还不清楚。当1日龄易感小鸡肌肉接种
鸡贫血病毒时，24h内就能产生症状。接种后，鸡贫
血病毒可从多数器官中再分离出来，直肠内容物可
延至35d。中和抗体可在感染后21d内检测到，临床
诊断、血液学和病理学参数可在感染后35d恢复正
常。2流行情况
鸡贫血病毒可通过直接接触、污染物等进行水
平传播，也可通过鸡蛋垂直传播。在开始生产受精
蛋前多数繁育鸡群可被感染，并且产生了鸡贫血病毒抗体。如果正在产蛋的血清学阴性的种鸡群受到
感染，鸡贫血病毒将会垂直传播，传播时间和母鸡
的病毒症状发生时间一样长，大约为1~3周，用此
种蛋孵出的小鸡将会感染鸡贫血病毒。如果母鸡血
清学阳性，母源抗体一般会保护雏鸡不发病，但不
具有抗病毒感染的能力。没有鸡贫血病毒母源抗体
的雏鸡，将会在1周龄内感染并发病。此外，很多
SPF鸡群也有鸡贫血病毒抗体，感染的传播方式可
能是通过使用鸡贫血病毒污染的胚，或细胞培养物
所制备的疫苗，或生物产品而造成的，但并非总会
发生。
鸡传染性贫血病的年龄抗性产生在1周龄的
时候，完成于孵出后的2周龄。但是，母源抗体和年
龄抗性的保护效果可被鸡贫血病毒共同感染的
免疫抑制因子所破坏，这些因子包括传染性法氏
鸡传染性贫血病研究进展_杨克礼
ＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅ
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!收稿日期：２００７－０２－１４中图分类号：Ｓ８５８．３１５．３文献标识码：Ａ文章编号：１６７３－１０８５（２００７）０４－００４１－０５综述
ｂｒｏｉｌｅｒｃｈｉｃｋｓａｆｔｅｒｈａｔｃｈｉｎｇ［Ｊ］．ＢｒｉｔｉｓｈＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅ．１９９１；３２：５１５－５２３．８Ｎｏｙ，Ｙ．ｅｔ，ａｌ．Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｉｎｔｈｅｙｏｕｎｇｃｈｉｃｋ［Ｊ］．ＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅ，１９９５，７４：３６６－３７３．９ＬａｃｅｙＪＭ，ＷｉｌｍｏｒｅＤＷ．Ｉｓｇｌｕｔａｍｉｎｅａｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙｅｓｓｅｎ－ｔｉａｌａｍｉｎｏａｃｉｄ［Ｊ］．Ｎｕｔｒ．ｒｅｖ，１９９０，４８：２９７．１０施用晖，乐国伟，刘建文，吴辛驰．外源核苷酸对肉鸡生产性能的影响［Ｊ］．无锡轻工大学学报，２０００，１９（６）．１１邬小兵．日粮核苷酸营养初探［Ｄ］．雅安：四川农业大学，１９９９．１２唐方，指阿部博马．锌缺乏对小鼠巨噬细胞与小肠粘膜上皮细胞的影响［Ｊ］．营养学报，１９９２，１４（４）：３３５．１３ＺｅｈａｖａＵｎｉ，ＧｉｄｉＺａｌｒ，ＲａｍＲｅｉｆｅｎ．ＶｉｔａｍｉｎＡｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｉｎｄｕｃｅｓｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｅｃｈａｎｇｅｓａｎｄｄｅｃｒｅａｓｅｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉ－ｔｙｉｎｃｈｉｃｋｅｎｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎｅ［Ｊ］．ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｕｔｒｉ－ｔｉｏｎ，１９９８，８０：４０１－４０７．１４Ｕｎｉ，Ｚ，Ｅｔａｋｏ，Ｏ．Ｇａｒｂｅｒ，ａｎｄＤ．Ｓｋｌａｎ．２００３ｂ．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｍｏ－ｌｅｃｕｌａｒ，ａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ；ｃｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅｃｈｉｃｋｅｎｓｍａｌｌｉｎｔｅｓ－ｔｉｎｅｏｆｔｈｅｌａｔｅｔｅｒｍｅｍｂｒｙｏ［Ｊ］．Ｐｏｕｌｔ．Ｓｃｉ，１９８２：１７４７－１７５４．１５高景编译．给鸡胚饲喂有助健康并降低死淘［Ｊ］．家禽科学，２００３（０９）．１６Ｕｎｉ，Ｆｅｒｋｅｔ．Ｍｅｔｈｏｄｆｏｒｅａｒｌｙｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｉｒｐｏｔｅｎｔｈｌ［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ＇ＳＰｏｕｌｔｓｃｉＪ，２００４，６０：１０１－１１１．１７黄小春，吴灵英．鸡胚给养氮基酸对肉仔鸡孵化率和胚胎生长的影响［Ｊ］．中国饲料，２００５年第２３期：１９－２０．１８Ｏ．Ｔ．Ｆｏｙｅ，Ｚ．Ｕｎｉ，Ｊ．Ｐ．ＭｃＭｕｒｔｒｙａｎｄＰ．Ｒ．ＦｅｒｋｅｔＴｈｅＥｆｆｅｃｔｓｏｆＡｍｎｉｏｔｉｃＮｕｔｒｉｅｎｔＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，“ＩｎｏｖｏＦｅｅｄｉｎｇ”ｏｆＡｒｇｉｎｉｎｅＡｎｄ／ｏｒβ－Ｈｙｄｒｏｘｙ－β－ＭｅｔｈｙｌＢｕｔｙｒａｔｅ（ＨＭＢ）ｏｎＩｎｓｕｌｉｎｌｉｋｅＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ，ＥｎｅｒｇｙＭｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄＧｒｏｗｔｈｉｎＴｕｒｋｅｙＰｏｕｌｔｓ［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉ－ｅｎｃｅ，２００６，５（４）：３０９－３１７．１９ＰｅｔｅｒＲ．Ｆｅｒｋｅｔ＆ＵｎｉＺｅｈａｖａ．ＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌＤｅｖｅｌｏｐ－ｍｅｎｔａｔＨａｔｃｈ［Ｊ］．ＭａｒｙｌａｎｄＮｕｔｒｉｔｉｏｎＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ２００３．２０Ｅ．Ｔａｋｏ，Ｐ．Ｒ．Ｆｅｒｋｅｔ，ａｎｄＺ．Ｕｎｉ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＩｎＯｖｏＦｅｅｄｉｎｇｏｆＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓａｎｄβ－Ｈｙｄｒｏｘｙ－β－ＭｅｔｈｙｌｂｕｔｙｒａｔｅｏｎｔｈｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＣｈｉｃｋｅｎＩｎｔｅｓｔｉｎｅ［Ｊ］．ＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅ，２００４（８３）：２０２３－２０２８．２１ＡＩ－ＭｕｒｒａｎｉＷＫ．Ｅｆｅｃｔｏｆｉｎｊｅｃｔｉｎｇａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｔｏｔｈｅｅｇｇｏｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｄｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｇｒｏｗｔｈｉｎｔｈｅｄｏｍｅｓｔｉｃｆｏｗｌ［Ｊ］．ＢｒＰｏｕｌｔＳｃｉ，１９８２，２３：１７１－１７４．□鸡传染性贫血病研究进展杨克礼，徐涤平，梁望旺，刘泽文，汪宏才（湖北省农科院畜牧兽医研究所，湖北武汉４３００６４）鸡传染性贫血（Ｃｈｉｃｋｅｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓａｎｅｍｉａ，ＣＩＡ）是由鸡传染性贫血病毒（ｃｈｉｃｋｅｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓａｎｅｍｉａｖｉｒｕｓ，ＣＩＡＶ）引起的一种以雏鸡再生障碍性贫血和全身淋巴组织萎缩为主要特征的病毒性传染病，是鸡重要的免疫抑制病之一。ＣＩＡ主要发生于２￣４周龄的雏鸡，病鸡的造血器官受损，导致雏鸡贫血和成鸡免疫抑制。１９７９年Ｙｕａｓａ等［１］首次在日本发现，此后在英国、德国、澳大利亚、美国等世界许多国家相继报道了该病的发生。我国于１９９２年由崔现兰等［２］报道发现，近几年来各地又陆续报道有本病毒的存在，证实了国内鸡群中ＣＩＡＶ感染较为普遍。成鸡感染ＣＩＡＶ后呈亚临床带毒状态，易被忽视，对养鸡业构成潜藏的巨大威胁。因此对本病的防治越来越引起国内外兽医工作者和养禽业户的高度重视，并被列为禽病研究的前沿课题。１ＣＩＡＶ的基本特征ＣＩＡＶ在２０００年第７次国际病毒分类委员会（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎＴａｘｏｎｏｍｙｏｆＶｉｒｕｓ，ＩＣＴＶ）报告后被归为圆环病毒科（ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ），陀螺病毒（Ｇｙｒｏｖｉｒｕｓ）属。它们具备圆球状形态、单股环型ＤＮＡ结构、无囊膜等共性。１９９８年Ｎｉａｇｒｏ等［３］建议将圆环病毒科重新分为三个群，即：第一群为ＰＣＶ和ＰＢＦＤＶ；第二群为植物圆环病毒；第三群包括ＣＩＡＶ、输血传播病毒（Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄｖｉｒｕｓ，ＴＴＶ）、ＴＴ样小病毒（ＴＴＶ－ｌｉｋｅｄｍｉｎｉｖｉｒｕｓ，ＴＬＭＶ）。湖北省科技攻关项目（项目编号２００１ＡＡ２０１Ｂ０３）４１家禽科学２００７．４综述游离ＣＩＡＶ为环状单股负链ＤＮＡ，大小约２．３ｋｂ，无囊膜，球形，直径约１８￣２５ｎｍ，能通过２５ｎｍ直径的滤膜，二十面体对称，有精细的表面结构。ＣＩＡＶ对理化因素的抵抗性很强，对丙酮、氯仿、乙醚均不敏感，耐酸、耐热。然而ＣＩＡＶ生长要求苛刻，只能在马立克氏病及某些白血病的肿瘤淋巴细胞系中生长，最常用的是ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１细胞。从世界各地分离毒株的血清学分析表明，不同毒株毒力有差异，但抗原性相同，因此现有ＣＩＡＶ毒株属同一血清型［４］。２鸡传染性贫血病的流行情况鸡是ＣＩＡＶ的主要自然宿主，各种品系的鸡均有易感性。不同年龄、地理位置的鸡群对ＣＩＡＶ的感染力几乎无差异。２￣３周龄鸡易感，１￣７日龄鸡最易感，六周龄以上的鸡和成鸡感染不发病，即对于该病，鸡有年龄抵抗力。１日龄雏鸡实验室感染发病率达１００％，７日龄则降为１５％￣２０％，三周后已产生了年龄抵抗力。ＣＩＡＶ既可经卵垂直传播，也可由病毒污染的粪便、房舍及工具等引起水平传播。一般认为ＣＩＡＶ主要感染途径是消化道，其次是呼吸道。水平传播时只产生抗体，不引起明显发病；垂直感染则导致雏鸡出壳后不久即出现贫血和造血器官、免疫器官萎缩等鸡传染性贫血病典型症状。多数鸡群在母源抗体消失后至产蛋前的生长期感染ＣＩＡＶ并产生抗体，其子代鸡可获得母源抗体的保护，而有些鸡在开产初期感染病毒，短时间内不能产生大量抗体，其后代子鸡难以获得母源抗体的保护，结果导致ＣＩＡ的暴发或流行。此外产蛋性应激及体内激素水平的改变，能使潜在的病毒激活，导致该病暴发，常造成重大经济损失。１９７９年由日本学者Ｙｕａｓａ等首次发现鸡传染性贫血病毒，当时被称作鸡贫血因子（Ｃｈｉｃｋｅｎａｎｅ－ｍｉａａｇｅｎｔ，ＣＡＡ）。据报道，第一个毒株是从用污染网状内皮增生病毒的马立克氏病疫苗接种鸡的材料中分离出来的，命名为ＣＡＡＧｉｆｕ－１株，后来一般以此为标准株。目前，鸡传染性贫血病毒广泛存在于世界上所有主要家禽生产国家。英国、瑞典、德国、加拿大、丹麦、美国、荷兰、巴西和阿根廷等国家都证实了本病的存在，澳大利亚及其它一些欧洲、非洲、亚洲国家，通过血清学调查，也发现了鸡群广泛感染ＣＩＡＶ。日本至少有１１个毒株，西德的代表株为Ｃｕｘ－１，美国的代表株为ＣＩＡ－１。从这些毒株的抗原性来看，ＣＩＡＶ只有一个血清型，但各株毒力变化较大。我国于１９９２年由崔现兰等在黑龙江省首先分离到该病毒。随后我国其它省市的鸡群中也陆续分离到该病毒，证实了国内鸡群中ＣＩＡＶ感染较为普遍。崔现兰等［５］还应用建立的间接免疫荧光法（ＩＩＦＡ）对来自大连、沈阳、哈尔滨地区部分鸡场的血清进行检测，结果阳性率分别为７８．３％（３１／４２）、８１．３％（１３／１６）和８４％（８４／１００）。刘岳龙等［６］应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和斑点杂交（Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ）的方法对江苏省不同地市随机采集的２月龄左右不同疾病的病鸡ＤＮＡ样品进行检测，结果表明在被检的５２个不同鸡群来源的病料中，有３６个鸡群来源的病料ＤＮＡ显示ＣＩＡＶ阳性，群阳性率为６９．２％；许兰菊等［７］用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记的１．４ｋｂＣＩＡＶ探针对河南省不同地市随机采集的病鸡材料用斑点杂交的方法检测ＣＩＡＶ，结果检出ＣＩＡＶ群阳性率为４６．３％，个体阳性率为３０．６％；杨林等［８］选择黑龙江省内不同地区、不同品种、不同日龄的鸡群，利用间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）对黑龙江省９个市（县）１３个鸡场的３５０２份鸡血清进行了鸡传染性贫血病血清学抗体检测，结果表明这１３个鸡场均有阳性鸡检出，血清阳性率在４．３４％￣８７．８％之间，平均阳性率为３３．６４％；王莉莉等［９］对山东省１２个地市的５８个鸡群鸡传染性贫血的流行情况进行了调查，共检测了３６８份血清样品，蛋鸡群、肉鸡群和种鸡群的鸡传染性贫血病毒（ＣＩＡＶ）ＥＬＩＳＡ抗体检出率分别为９１．７％、７７．６％和８４．７５％，平均抗体阳性率为８３．２％；蒋玲艳等［１０］应用ＰＣＲ检测技术，对采自广西五个主要养鸡地区５０多个鸡群３２１羽病鸡的组织样品，进行了鸡传染性贫血病毒核酸的检测，结果检测的病例平均阳性率为２８．３４％。杨克礼等［１１］应用ＰＣＲ检测技术，对采自安徽省六个主要养鸡地区３９个鸡群的９５羽病鸡的组织样品进行了鸡传染性贫血病毒核酸的检测，结果检测的病例平均阳性率为２２．１１％。作为养鸡大省的湖北省，目前尚未见有关于鸡传染性贫血病流行情况的报道。３鸡传染性贫血病与其它病毒性免疫抑制病的相互作用ＣＩＡＶ感染引起的直接死亡率并不很高，但由于ＣＩＡＶ主要损害免疫器官，致使机体的免疫机能严重障碍，对外界不良因素的抵抗力严重降低，鸡群对其它传染病的易感性增高，导致一些传染病如４２ＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅ综述鸡传染性法氏囊病、马立克氏病、新城疫等病的暴发。因此，已发生ＣＩＡＶ感染的鸡群要注意继发感染的预防和控制。ＣＩＡＶ感染的雏鸡，细胞免疫和体液免疫功能明显降低。ＣＩＡＶ单独或与其它免疫抑制病毒如传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ）等联合感染可明显抑制马立克氏病（ＭＤ）疫苗及传染性喉气管炎（ＩＬＴ）疫苗等的免疫保护效力，并可抑制新城疫（ＮＤ）灭活疫苗的ＨＩ抗体效价。当ＭＤＶ、ＩＢＤＶ与ＣＩＡＶ先后或共同感染时，或抑制免疫反应，提高了鸡对这些疫病和其他感染的易感性；或相互作用，可使各种疾病的病状加重。ＣＩＡＶ和ＭＤＶ双重感染可导致早期死亡，其中１日龄双重感染的雏鸡在１３￣１４日龄时８０％死亡；９日龄双重感染的雏鸡在１１￣１３日龄有６３％死亡。剖检可见胸腺、法氏囊严重萎缩，肝、肾肿大，脾有坏死灶。这些变化与ＭＤＶ超强毒株（ｖｖＭＤＶ）所引起的早期死亡综合征很相似。１￣１４日龄接种ＣＩＡＶ可引起雏鸡对ＭＤＶ疫苗（ＨＶＴ）或血清Ｉ型ＭＤＶ弱毒疫苗免疫失败。因此ＣＩＡＶ感染是导致ＭＤ疫苗免疫失败的原因之一。传染性法氏囊病（ＩＢＤ）与ＣＩＡ都是对幼鸡危害严重的免疫抑制性疾病。ＩＢＤＶ主要侵害法氏囊组织，破坏机体的体液免疫系统，而ＣＩＡＶ主要侵害胸腺中的淋巴细胞和骨髓组织，损伤机体的细胞免疫系统。当幼龄鸡同时感染或先后感染ＩＢＤＶ和ＣＩＡＶ时，可使二者相互增强感染力和致病力，同时损伤机体的体液免疫和细胞免疫系统，造成严重后果。ＩＢＤＶ感染可消除雏鸡对ＣＩＡＶ的日龄抵抗性，１日龄接种ＩＢＤＶ的鸡于２、３、４月龄感染ＣＩＡＶ时仍可发生贫血，甚至死亡；而未接种ＩＢＤＶ的鸡２周龄感染ＣＩＡＶ却不发生贫血；ＣＩＡＶ感染可加剧由ＩＢＤＶ引起的法氏囊破坏。在有ＣＩＡＶ存在的条件下，常发生ＩＢＤ免疫失败，造成ＩＢＤ大面积暴发、病程延长且死亡率增高；在有ＩＢＤＶ存在的条件下，ＣＩＡＶ的亚临床感染可升级为临床感染，并破坏鸡群对ＣＩＡＶ的年龄抵抗力，使得中雏感染发病。最近已报道有对１０周龄成年鸡有高致病性的ＣＩＡＶ毒株出现［１２］，这可能与混合感染有关。４鸡传染性贫血病的诊断方法根据感染雏鸡的贫血、发育受阻等临床表现及胸腺萎缩、骨髓脂肪变性、颜色变黄等典型病理变化一般可作出初步诊断。由于ＣＩＡＶ感染易感鸡后引起免疫抑制，一方面可造成机体对疫苗的免疫应答低下，导致疫苗免疫效果不佳或免疫失败；另一方面可增加机体对其它疫病的易感性，造成其它病毒病及细菌病的混合感染，如与马立克氏病、新城疫、传染性法氏囊病及网状内皮增生症等的混合感染，彼此相互影响，加剧疾病的严重性和复杂性。成鸡因对其有年龄依赖性的抵抗性，所以不一定会出现单纯的、典型的鸡贫血病的症状和病变。这使得确诊ＣＩＡ非常困难，因而常使该病毒因不被考虑为主要致病因素而被忽略，从而导致巨大的经济损失。因此，将ＣＩＡ与禽类其它疾病尤其是免疫抑制性疾病相鉴别开来并进行流行病学调查显得意义重大。４．１常规实验室诊断４．１．１病毒分离与鉴定ＣＩＡＶ不能在鸡各种组织制备的单层细胞及哺乳动物细胞系中培养生长，在马立克氏病毒（ＭＤＶ）和淋巴白血病淋巴瘤（ＬＬ）所建立的成淋巴样细胞系上能够生长，最常用的是成淋巴细胞Ｔ－细胞系ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１。病毒分离的方法有：１日龄ＳＰＦ鸡接种和ＭＳＢ１细胞接种；５日龄鸡胚卵黄囊接种。ＣＩＡＶ感染鸡的所有组织均可作为病毒分离材料，感染２１ｄ内各组织和直肠内容物中ＣＩＡＶ含量几乎是恒定的，２１￣２６ｄ后病毒含量迅速下降。发病后７ｄ的肝脏含毒量很高，被认为是分离ＣＩＡＶ的最好材料。由于该病毒对理化因子的抵抗力很强，所以一般可取肝脏、脾脏、骨髓组织捣碎制成匀浆（反复冻融），取上清液，加入等量氯仿混合１５ｍｉｎ或７０℃处理３０ｍｉｎ以去除外来可能的污染，再２５００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ后，取上清液作为病毒分离材料，接种于１日龄ＳＰＦ鸡、ＭＳＢ１细胞上或５日龄鸡胚卵黄囊内以分离病毒。１日龄ＳＰＦ易感雏鸡肌肉或腹腔接种后，第１０￣２１ｄ测定红细胞压积值（ｈａｅｍａｔｏｃｒｉｔ，ＨＣＴ），其值低于２７％，骨髓萎缩脂肪化的则可判断为ＣＩＡＶ分离阳性。ＭＳＢ１被认为是ＣＩＡＶ敏感、适用的宿主细胞，常用于体外病毒分离和病毒滴度的检测。将组织匀浆上清液以１：１０的比例接种于新鲜制备的ＭＳＢ１细胞上，每２￣４ｄ培养液颜色由红变黄时，取０．２￣０．３ｍｌ细胞悬液移入含新鲜培养液中继代。经７￣１０代，当细胞死亡、培养液颜色不再变化，即产生细胞病变（ＣＰＥ）时，可判定为病毒分离阳性。但有些ＣＩＡＶ毒株在ＭＳＢ１细胞上不能复制或复制很弱，需要用易感雏鸡再分离。另外，还可接种５日龄鸡胚复制病毒或病变。４３
鸡传染性贫血病毒SYBR GreenⅠ法荧光定量PCR检测方法的建立及其在疫苗污染检测中的应用
鸡传染性贫血病毒SYBR GreenⅠ法荧光定量PCR检测方法的建立及其在疫苗污染检测中的应用
付佳媛;李丹;常臻;李阳;房立春;崔治中;常爽;赵鹏
【摘 要】To detect the contamination of Chicken infectious anemia virus
(CIAV) in attenuated poultry vaccines, one pair of specifi c primers were
designed and synthesized within conserved region VP2 partial gene
sequence of CIAV for development and optimization of a SYBR GreenⅠ
real-time quantitative PCR assay. The sensitivity limit of the SYBR Green I
quantitative PCR was 6.36 copies/μl, which was 1000 times higher than
that of conventional PCR assay. Under experimental condition, the
detection limit was 1 EID50/1000 plumes. The SYBR Green I quantitative
PCR had good specifi city to CIAV and had no cross-reaction with other
REV, ALV and MDV genes. The coeffi cients of variations of both intra-assay and inter-assay were less than 2.5%, suggesting good repeatability.
鸡传染性贫血病毒广东分离株GD-1-12致病性研究 2
动物医学进展，２０１４，３５（１）：２７—３１ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 鸡传染性贫血病毒广东分离株ＧＤ一１—１２致病性研究 张新珩 ，刘远佳 ，吴波良 ，陈 峰 ，孙宝丽 ，马静云 ，谢青梅¨ （１．华南农业大学动物科学学院，广东广州５１０６４２；２．华南农业大学兽医学院，广东广州５１０６４２） 摘 要：从广东省某商品代肉鸡场１２日龄生长迟缓的小鸡体内分离到１株鸡传染性贫血病毒（ＣＡＶ）， 暂定名为ＧＤ－１—１２株。分离病毒用ＭＤＣＣ—ＭＳＢ１细胞进行培养，通过肌肉注射方式感染１日龄ＳＰＦ鸡，于 感染后第７天、第１４天、第２１天分别检测ＣＡＶ对ＳＰＦ鸡体质量、胸腺、脾脏、肝脏、法氏囊及胸腺和外周血 液中ＣＤ３ Ｔ淋巴细胞指标的影响，同时观察鸡的临床症状。结果表明，ＧＤ－Ｉ一１２分离株导致ＳＰＦ鸡３Ｏ 的 死亡率。感染后第１４天，胸腺极度萎缩，肝脏肿大，法氏囊萎缩，脾脏萎缩。感染后第７～１４天之间，胸腺和 外周血中ＣＤ３ Ｔ淋巴细胞呈下降趋势。结果表明１日龄ＳＰＦ雏鸡在人工感染ＣＡＶ后第７～１４天是损伤 上述器官的关键时期。 关键词：鸡传染性贫血病毒；ＳＰＦ鸡；致病性 中图分类号：￥８５２．６５９．２；￥８５８．３１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７—５０３８（２０１４）Ｏ１—００２７—０５ 鸡传染性贫血（Ｃｈｉｃｋｅｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎｅｍｉａ， ＣＩＡ）是一种以雏鸡再生障碍性贫血和全身淋巴组 织萎缩为主要特征的疾病，该病由鸡传染性贫血病 毒（Ｃｈｉｃｋｅｎ ａｎｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ，ＣＡＶ）所引起，能通过垂 直传播和水平传播，导致鸡群免疫抑制。１９７９年日 本学者ＹｕａｓａＮ及其团队ｌ＿】 首次报道该病毒。自 １９９２年我国黑龙江省首次分离到该病毒＿２］，其在我 国流行的趋势不断上升，在吉林、山东等地都有陆续 报道 。印度 、韩 引、澳大利亚［ 等国家也分离 到了此病毒。鸡传染性贫血病毒是目前危害家禽养 殖业的重要病毒，会导致鸡群其他细菌病的继发感 染，增加雏鸡死亡率，给养禽业带来严重的损失。 鸡传染性贫血病毒可感染所有年龄的鸡，而２ 周龄以内的雏鸡对其最易感，随着鸡日龄的增大，该 病的感染率呈降低趋势＿７］。为了检测广东省ＣＡＶ 流行毒株的毒力变异情况，华南农业大学动物科学 学院家禽研究室从１只１２日龄生长迟缓的小鸡体 内分离并鉴定到１株ＣＡＶ，命名ＧＤ一１—１２，用该病毒 对１日龄ＳＰＦ鸡进行人工感染，以分析ＧＤ－１—１２分 离株的致病性。 １材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 病料采集及处理 ２０１２年从广东省某商品 鸡场１２日龄生长迟缓的小鸡体内分离并鉴定到鸡 传染性贫血病毒。该鸡群表现为精神抑郁，消瘦，鸡 冠和肉垂苍白，羽毛蓬松，鸡爪发白。病理剖检可见 鸡胸腺萎缩，出血，小腿骨呈淡黄色。无菌采集胸腺 及肝脏等组织，置于玻璃研磨器中，用液氮充分研 磨，收集组织悬液于２ ｍＬ离心管中，反复冻融３次 并用超声波处理，并离心弃沉淀，上清经７０℃水浴 和５００ ｍＬ／Ｌ的氯仿处理２Ｏ ｍｉｎ，用０．２２“ｍ微孔滤 膜过滤，置于一８Ｏ℃保存。 １．１．２ 细胞 ＭＤＣＣ—ＭＳＢ１细胞系由广东省农业 科学院兽医所郭鹏举主任惠赠。ＭＤＣＣ—ＭＳＢＩ细胞 系用含体积分数１００ ｍＬ／Ｌ胎牛血清和ＲＰＭＩ一１６４０ 培养液（每毫升含青霉素１００单位、链霉素１００ ｕｇ）， 在体积分数为５ ＣＯ。３７℃下进行悬浮培养，每３ ｄ 传代１次。 １．１．３ 试验用动物 ６Ｏ只１ Ｅｔ龄ＳＰＦ鸡购于广东 大华农有限公司。随机取３Ｏ只作为空白对照组，剩 余３０只作为攻毒组，分别饲养于２个负压隔离器 内。 １．２ 方法 １．２．１ ＭＤＣＣ—ＭＳＢ１细胞培养分离病毒 按文献 ［８］方法，将病鸡脏器组织悬液接种ＭＤＣＣ—ＭＳＢ１ 细胞，每２ ｄ～３ ｄ盲传１代，直到病毒繁殖稳定后 收毒，置于一８Ｏ℃保存。 １．２．２ ＣＡＶ人工攻毒 空白对照组３０只１日龄 ＳＰＦ鸡以大腿肌肉注射的方式人工注入１ ｍＬ生理 盐水。将ＭＤＣＣ—ＭＳＢ１细胞繁殖的病毒液使用荧 光定量仪采用绝对定量的方法检测出病毒效价为 １０¨ｃｏｐｉｅｓ／／￣Ｌ，并对攻毒组３０只１ Ｅｔ龄ＳＰＦ鸡以 收稿日期：２ｏ１３－ｏ７－３ｏ 基金项目：广东省重大科技项目（２ｏ０９ＢＯ２Ｏ２Ｏ１（）Ｏ８） 作者简介：张新珩（１９８９一），女，吉林白城人，硕士研究生，