HPLC测定黑果枸杞中花青素的成分及含量

标准与检测　食品研究与开发　Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｏｍｅｎｔ　２０１７年６月　

第３８卷第１２期　

ＤＯＩ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００５－６５２１．２０１７．１２．０２７　ＨＰＬＣ测定黑果枸杞中花青素的成分及含量　

赵子丹。葛谦，牛艳，王晓菁’，张艳　（宁夏农产品质量标准与检测技术研究所，宁夏银川７５０００２）　

摘要：建立黑果枸杞中花青素的高效液相色谱检测方法。采用酸化乙醇溶液超声提取黑果枸杞中的花青素，置于　沸水浴中将花青素水解为常见的花色素。选用高效液相色谱一紫外检测器、Ａｇｉｌｅｎｔ—ＺＯＲＢＡＸ　ＳＢ—Ｃ１８色谱柱，以乙腈／　Ｏ．１％磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，在５２５　ｎｍ波长处对６种常见花色素（矢车菊色素、天竺葵色素、飞燕草色素、　芍药色素、牵牛花色素和锦葵色素）进行定量检测。结果表明，６种花色素在浓度为０．２　ｍｇ／Ｌ～１００　ｍｇ／Ｌ范围内，与响应　值呈线性关系，分别获得标准曲线方程及相关系数，ｒ＞０．９９９；矢车菊色素、天竺葵色素、飞燕草色素、芍药色素、锦葵　色素的仪器检出限均为０．０２ｍｇ／Ｌ，牵牛花色素的仪器检出限为０．０５ｍｇ／Ｌ；６种花色素的平均回收率在８４％～１０６％，　ＲＳＤ值在０．５％一７．９％。　关键词：黑果枸杞；花青素；水解；高效液相色谱　

Ｄｅｒｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ　ｉｎ　Ｌｙｃｉｕｍ　ｒｕｔｈｅｎｉｃｕｍ　Ｍｕｒｒ．ｂｙ　ＨＰＬＣ　ＺＨＡＯ　Ｚｉ－ｄａｎ，ＧＥ　Ｑｉａｎ，ＮＩＵ　Ｙａｎ，ＷＡＮＧ　Ｘｉａｏ－ｊｉｎｇ　，ＺＨＡＮＧ　Ｙａｎ　（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ａｎｄ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｆｏｒ　Ａｇｒｏ－Ｐｒｏｄｕｅｔｓ　ｏｆ　Ｎｉｎｇｘｉａ，Ｙｉｎｃｈｕａｎ　７５０００２，　Ｎｉｎｇｘｉａ，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ（ＨＰＬＣ）ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｏｌｉｓｈｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ　ｉｎ　Ｌｙｃｉｕｍ　ｒｕｔｈｅｎｉｃｕｍ　Ｍｕｉｒ．．Ｔｈｅ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ　ｉｎ　Ｌｙｃｉｕｍ　ｒｕｔｈｅｎｉｃｕｍ　Ｍｕｒｒ．ｗｅｒｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ　ｗｉｔｈ　ａｃｉｄｉｆｉｅｄ　ｅｔｈａｎｅｌ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ　ｉｎｔｏ　ｍａｊｏｒ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ　ｉｎ　ｂｏｉｌｉｎｇ　ｗａｔｅｒ　ｂａｔｈ．Ａ　ｍｉｘｔｕｒｅ　ｏｆ　ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ　ａｎｄ　０．１％ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ　ａｃｉｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ａｇｉｌｅｎｔ—ＺＯＲＢＡＸ　ＳＢ—Ｃ　１　８　ｃｏｌｕｍｎ　ｂｙ　ＨＰＬＣ—ＵＶ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ．Ｔｈｅ　ｓｉｘ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ　ｉｎ－　ｃｌｕｄｉｎｇ　ｃｙａｎｉｄｉｎ，ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ，ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ，ｐｅｏｎｉｄｉｎ，ｐｅｔｕｎｉｄｉｎ　ａｎｄ　ｍａｌｖｉｄｉｎ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ａｔ　５２５　ｎｍ　ｗａｖｅ—　ｌｅｎｇｔｈ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｌｉｎｅａｒｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ（ｒ＞０．９９９）ｗａｓ　ｇｏｏｄ　ｏｖｅｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｒａｎｇｅ　ｆｒｏｍ　０．２　ｍｇ／Ｌ　ｔｏ　１００　ｍ　Ｌ　ｆｏｒ　ｓｉｘ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ．Ｔｈｅ　ｌｉｍｉｔｓ　ｏｆ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＬＯＤｓ）ｏｆ　ｃｙａｎｉｄｉｎ，ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎｍ，ｄｅｌ－　ｐｈｉｎｉｄｉｎ，ｐｅｏｎｉｄｉｎ　ａｎｄ　ｍａｌｖｉｄｉｎ　ｗｅｒｅ　０．０２　ｍｓ／Ｌ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ＬｅＤ　ｏｆ　ｐｅｔｕｎｉｄｉｎ　ｗａｓ　０．０５　ｍｇ／Ｌ．Ｔｈｅ　ｒａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｓｐｉｋｅｄ　ａｖｅｒａｇｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｅｖｅｌｓ　ｗｅｒｅ　８４％一１０６％ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ（ＲＳＤｓ）ｏｆ０．５％一　７．９％ｉｎ　ａ　ｒｅａｌ　ｓａｍｐｌｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｌｙｃｉｕｍ　ｒｕｔｈｅｎｉｃｕｍ　Ｍｕｉｒ．；ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ；ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ；ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　

花青素（ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）是一类水溶性植物色素，　广泛存在于植物的花、果实、茎、叶中，是植物的主要呈　色物质，使它们呈现红、蓝、紫等不同的颜色。花青素　在自然条件下很少以游离状态存在，常与各种单糖以　基金项目：宁夏农林科学院院科技先导资金项目（ＮＫＹＱ一１４—０６）；农　业部农产品质量安全监管局特质性食用农产品营养组分识别与验证　评估项目（ＧＪＦＰ２０１６０１５０１）　作者简介：赵子丹（１９８５一），女（汉），助理研究员，硕士，研究方向：农　产品质量标准与检测技术研究。　通信作者：王晓菁（１９７２一），女（汉），研究员，硕士，研究方向：农产　品营养与安全检测研究。　糖苷键的形式结合形成花色苷。黑果枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ　ｒｕｔｈｅｎｉｃｕｍ　Ｍｕｉｒ．）为茄科枸杞属多年生灌木，是我国西　北地区特有的野生植物品种，其果实富含花青素，是　典型的天然花色苷类植物色素资源ｌｌ】。近年研究表明，　黑果枸杞花青素具有多种生理功能，包括抗氧化　、　抗辐射翻、抗衰老［６３以及调节血脂功能［７］，能有效防治动　脉粥样硬化等慢性疾病［８１。同时，黑果枸杞花青素还具　有安全、无毒、药食兼用的特性，作为一种天然色素在　食品行业中的应用前景非常广阔　１０］。　目前，对黑果枸杞花青素含量的测定方法有紫　外一可见分光光度法ｌｌｌ　、高效液相色谱法ｌｌ４　ｑ和高效　—＝＝＝１２４　赵子丹，等：ＨＰＬｃ测定黑果枸杞中花青素的成分及含量　标准与检测　液相色谱一串联质谱法　等。紫外一可见分光光度法　操作相对简便，但无法测定出花青素的种类和准确含　量；高效液相色谱一串联质谱法适合测定花青素含量　较低的植物性样品，同时可用于鉴定一些未知结构的　花色苷，然而含量较高的样品容易超出其线性范围；　高效液相色谱法是目前检测花青素报道最多的方法，　但是现有相关研究均只选择一种或两种花色素标准　品进行检测，测定结果有失偏颇。自然存在的花青素　种类繁杂、品种众多，利用高效液相色谱法直接分析　需要购置多种标准品，成本较高，难以用于实际检测　中。自然界中存在６种常见的花色素，分别是矢车菊　色素（ｃｙａｎｉｄｉｎ）、天竺葵色素（ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ）、飞燕草色　素（ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ）、芍药色素（ｐｅｏｎｉｄｉｎ）、牵牛花色素　（ｐｅｔｕｎｉｄｉｎ）和锦葵色素（ｍａｌｖｉｄｉｎ）。通过强酸水解可将　花青素转化成６种常见花色素中的一种或几种，因此，　通过分析花色素来确定花青素的成分就成为一种简　便有效的分析方法。本试验对黑果枸杞中花青素的提　取试剂、提取条件、色谱条件等进行了较为细致的研　究，以期建立黑果枸杞中花青素成分及含量测定的高　效液相色谱法，为黑果枸杞中花青素的研究提供技术　支撑，也为完善黑果枸杞的质量标准检测体系提供科　学依据。　

１材料与方法　１．１材料与试剂　乙腈、甲醇、乙醇（色谱纯）：美国Ｆｉｓｈｅｒ公司；盐　酸、磷酸（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；超纯水（过　０．２２　ｍ滤膜）。　飞燕草色素标准物质（纯度≥９７％）、矢车菊色素　标准物质（纯度ｉ＞９６％）、天竺葵色素标准物质（纯　度≥９７％）、芍药色素标准物质（纯度≥９７％）、锦葵色　素标准物质（纯度＞１９７％）：法国Ｅｘｔｒａｓ　Ｓｙｎｔｈｅｓｅ公司；　牵牛花色素标准物质（纯度＞１９９％）：日本Ｔｏｋｉｗａ公司。　１．２仪器与设备　Ｗａｔｅｒｓ　２６９５液相色谱仪（配２４８７紫外检测器）：　美国Ｗａｔｅｒｓ公司；ＸＳ２０５　ＤｕａｌＲａｎｇｅ电子天平（精度　０．０００　１　ｇ）：瑞士Ｍｅｔｔｌｅｒ　Ｔｏｌｅｄｏ公司；Ｔ２５　ｄｉｇｉｔａｌ型高速　匀浆机：德国ＩＫＡ公司；ＭＳ３　ｂａｓｉｃ涡旋混匀器：德国　ＩＫＡ公司；ＤＳ一２５　１０ＤＴＨ型超声波清洗器：上海生析超　声仪器有限公司；水浴锅：上海科恒实业发展有限公　司；ＴＤＬ一４０离心机：上海安亭仪器有限公司；纯水机：　美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司；ＤＨＧ一９２４０Ａ型电热鼓风干燥箱：　上海一恒仪器有限公司；精密移液枪：法国Ｇｉｌｓｏｎ　公司。　

１．３方法　１．３．１标准溶液的制备　分别精密称取飞燕草色素、矢车菊色素、牵牛花　色素、天竺葵色素、芍药色素、锦葵色素６种标准物质　各５．０　ｍｇ，分别用５％ＨＣ１甲醇溶解并定容至１０　ｍＬ，　充分摇匀，配制成５００ｍｇ／Ｌ的标准储备液，一２０℃冷冻　保存。　１．３．２样品前处理　将黑果枸杞干果用高速万能粉碎机粉碎，准确称　取１．０００　０　ｇ，置于２５０　ｍＬ磨口锥形瓶中，加入５０　ｍＬ　酸化乙醇提取溶剂。超声提取３０　ｍｉｎ后，置于沸水浴　中冷凝回流１　ｈ，取出后迅速冷却。当达到室温时，立即　将样品过０．２２　Ｉｘｍ水相滤膜到２　ｍＬ的棕色小瓶中，待　检测。　１．４色谱条件　色谱柱：Ａｇｉｌｅｎｔ－ＺＯＲＢＡＸ　ＳＢ—Ｃ　１　８（４．６　ｍｍｘ２５０　ｍｍ，　５　ｍ），流动相为乙腈／０．１％磷酸溶液，流速０．８　ｍＵｍｉｎ，　柱温为４Ｏ℃，检测波长５２５　ｎｍ，进样体积１０　Ｌ。梯度　洗脱条件见表１。　

表１流动相梯度洗脱条件　Ｔａｂｌｅ　１　Ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｅｌｕｔｉｏｎ　

注：一表示无。　２结果与分析　２．１色谱柱及流动相的选择　分别选择Ｗａｔｅｒｓ—ＸｂｒｉｄｇｅＴＭ　ＨＩＬＩＣ色谱柱　（４．６　ｍｍｘ１５０　ｍｍ，３．５　ｍ），Ｗａｔｅｒｓ—ＸｂｒｉｄｇｅＴＭ　Ｃ１８　色谱柱（４．６　ｍｍ￣２５０　ｍｍ，５　ｍ）和Ａｇｉｌｅｎｔ—ＺＯＲＢＡＸ　ＳＢ—Ｃ１８色谱柱（４．６　ｍｍｘ２５０　ｍｍ，５　ｍ），以不同的流　动相体系及不同的体积配比对６种花色素标准品的液　相色谱检测条件进行优化。结果表明，Ａｇｉｌｅｎｔ—ＺＯＲ—　ＢＡＸ　ＳＢ—Ｃ１８色谱柱，以乙腈与０．１％磷酸溶液为流动　相进行梯度洗脱，既与干扰组分达到有效分离，且同　时保持６种花色素的基线分离度。６种花色素的相对　保留时间分别为：１２．１、１５．８、１６．９、１９．４、２０．８、２１．５　ｍｉｎ，　重现性好。最终确定的梯度洗脱条件见表１，色谱图见　图１。