干细胞的诱导分化方法及各类诱导试剂的配置
干细胞诱导分化的方法及各类诱导试剂的配置
YAO Xiang
由于易分离获得、免疫原性低且具有多向诱导分化潜能，骨髓基质干细胞（Bone
marrow stroma stem cells，MSCs）成为了组织工程与再生医学中理想的种子细胞。
正是由于上述原因，骨髓基质干细胞成为了很多研究者关注并使用的模型细胞。
本文将着重于骨髓基质干细胞的成骨诱导分化、成软骨诱导分化和成脂诱导分
化三个方向加以介绍，相关内容有利于实验研究者快速而有效地配制上述各类诱
导分化试剂，进而极大缩短前期探索实验和文献搜索整合所耗费的大量时间。本
文主要内容涵盖：
1. 成骨诱导分化中诱导液的添加方案（包含换液周期及诱导试剂浓度）
2. 成骨诱导分化中各类诱导试剂的产品信息及母液配置方案
3. 成脂诱导分化中诱导液的添加方案（包含换液周期及诱导试剂浓度）
4. 成脂诱导分化中各类诱导试剂的产品信息及母液配置方案
5. 成骨与成脂共诱导液的添加方案（包含换液周期及诱导试剂浓度）
6. 成骨与成脂共诱导试剂的产品信息及母液配置方案
7. 成软骨诱导分化中诱导液的添加方案（包含换液周期及诱导试剂浓
度）
8. 成软骨诱导分化中各类诱导试剂的产品信息及母液配置方案
注：下述诱导方案经多次实验验证是行之有效的，笔者利用相关方案参与发表的部分参考文献如下： 1. Yao X, Peng R, Ding JD*. Cell-material interactions revealed via material techniques of surface patterning.
Advanced Materials, 2013;25:5257-86. (材料领域TOP期刊)
2. Yao X, Hu YW, Cao B, Peng R, Ding JD*. Effects of surface molecular chirality on adhesion and differentiation
of stem cells. Biomaterials, 2013;34:9001-9. (生物材料领域TOP期刊)
3. Yao X, Peng R, Ding JD*. Effects of aspect ratios of stem cells on lineage commitments with and without induction
media. Biomaterials, 2013;34:930-9.
4. Peng R, Yao X, Cao B, Tang J, Ding JD*. The effect of culture conditions on the adipogenic and osteogenic
inductions of mesenchymal stem cells on micropatterned surfaces. Biomaterials, 2012;33:6008-19. (IF:8.39) 5. Peng R, Yao X, Ding JD*. Effect of cell anisotropy on differentiation of stem cells on micropatterned surfaces
through the controlled single cell adhesion. Biomaterials, 2011;32:8048-57.
首先需要说明的是骨髓基质干细胞正常传代培养所需的培养基为“基础培养
液”，一般2-3天更换一次新的培养液。基础培养液是基于低糖的DMEM
（Dulbecco's modified Eagle medium，后文均以简写的DMEM替代）所配置，其
中含有100 U/ml的青霉素，100 μg/ml的链霉素，2mM的L-谷氨酰胺和10%的
胎牛血清（Bovine serum albumin， FBS）。上述试剂全为Gibco品牌（下述诱导
液中也需用到这些试剂，直接购买使用即可）。
一．成骨诱导分化中诱导液的添加方案（包含换液周期及诱导试剂浓度）
对于单独的成骨诱导，干细胞需在“成骨诱导液中”中连续培养，采用每3
天更换一次新诱导液的方案进行。就总的时间跨度来说，一般短的1周，长的3-
4周都有，具体时间跨度需要依据你的实验目的而定。
成骨诱导液是基于高糖的DMEM（含100 U/ml的青霉素，100 μg/ml的链霉
素，2 mM的L-谷氨酰胺）所配置，其中含有10%的FBS（胎牛血清）、50 μM的
抗坏血酸、10 mM的β-甘油磷酸钠和100 nM的地塞米松。具体母液配置方案及
试剂信息详见下部分内容。其中单位μM表示的是μmol/L（下同）。
二．成骨诱导分化中各类诱导试剂的产品信息及母液配置方案 试剂名称 试剂信息 母液配置方案 母液最终加
入比例（母
液：培养液）
地塞米松 dexamethasone 产品编号 D4902
CAS号50-02-2
品牌SIGMA 母液浓度100μM；
约0.19235毫克加入到
20微升乙醇中溶解，再
用PBS稀释到50毫
升；
过滤除菌后用小管封1：1000 装并冷冻保存；
β-甘油磷酸钠
β-Glycerophosphate
disodium salt hydrate 产品编号 G9422
CAS号154804-51-0
SIGMA 母液浓度1M；
约4.3208克加入到20
毫升的PBS中溶解；
过滤除菌后用小管封
装并冷冻保存； 1：100
抗坏血酸 2-Phospho-L-ascorbic
acid trisodium salt 产品编号 49752
CAS号66170-10-3
SIGMA 母液浓度5mM；
约64.41毫克加入到40
毫升的PBS中溶解；
过滤除菌后用小管封
装并冷冻保存； 1：100
三．成脂诱导分化中诱导液的添加方案（包含换液周期及诱导试剂浓度）
对于单独的成脂诱导，干细胞需首先在“成脂诱导液”中培养2天，随后在
“成脂孵育液”中培养1天，之后再依次进行上述循环。就总的时间跨度来说，
一般短的1周，长的3-4周都有，具体时间跨度需要依据你的实验目的而定。
成脂诱导液和孵育液均是基于高糖的DMEM（含100 U/ml的青霉素，100
μg/ml的链霉素，2 mM的L-谷氨酰胺）所配置，其中成脂诱导液中含有10%的
FBS、1 μM的地塞米松、200 μM的吲哚美辛、10 μg/ml的胰岛素和0.5 mM的
3-Isobutyl-1-methylxanthine；成脂孵育液中则含有10%的FBS和10 μg/ml的胰岛
素。具体母液配置方案及试剂信息详见下部分内容。
四．成脂诱导分化中各类诱导试剂的产品信息及母液配置方案
试剂名称 试剂信息 母液配置方案 母液最终加
入比例（母
液：培养液） 地塞米松 dexamethasone 产品编号 D4902
CAS号50-02-2
品牌SIGMA 母液浓度100μM
约0.19235毫克加入到
20微升乙醇中溶解，再
用PBS稀释到50毫升 1：100
胰岛素 Insulin human 产品编号 I3536
CAS号11061-68-0
SIGMA 分子量 5807.57 依据分子量和
最终浓度10
μg/ml自行计算
吲哚美辛 indomethacin 产品编号 I7378
CAS号53-86-1
SIGMA 母液浓度200mM
约71.56毫克加入到1
毫升的DMSO中溶解 1：1000
3-异丁基-1-甲基黄嘌
呤 3-Isobutyl-1-
methylxanthine 产品编号 I7018
CAS号28822-58-4
SIGMA 母液浓度0.5M
约100毫克加入到0.9
毫升的DMSO中溶解 1：1000
细胞培养级别DMSO Dimethyl sulfoxide 产品编号 D2650
CAS号67-68-5
SIGMA 作为配置母液的溶剂
使用 ----
五．成骨与成脂共诱导液的添加方案（包含换液周期及诱导试剂浓度）
对于成骨和成脂的共诱导，干细胞首先在“成骨成脂共诱导液”中培养3天，
随后在“成骨诱导-成脂孵育液”中继续培养3天。之后再依次进行上述循环。
具体的总时间跨度需要依据你的实验目的而定。
成骨成脂共诱导液和成骨诱导-成脂孵育液均是基于高糖的DMEM所配置
（含100 U/ml的青霉素，100 μg/ml的链霉素，2 mM的L-谷氨酰胺）。其中成骨
成脂共诱导液中含有10%的FBS、1 μM的地塞米松、200 μM的吲哚美辛、10
μg/ml的胰岛素、0.5 mM的3-Isobutyl-1-methylxanthine、50 μM的抗坏血酸和10
mM的β-甘油磷酸钠；成骨诱导-成脂孵育液中含有10%的FBS、100 nM的地塞
米松、10 μg/ml的胰岛素、50 μM的抗坏血酸和10 mM的β-甘油磷酸钠。具体母液配置方案及试剂信息详见下部分内容。
六．成骨与成脂共诱导试剂的产品信息及母液配置方案 试剂名称 试剂信息 母液配置方案 母液最终加
入比例（母
液：培养液）
地塞米松 dexamethasone 产品编号 D4902
CAS号50-02-2
品牌SIGMA 母液浓度100μM
约0.19235毫克加入到
20微升乙醇中溶解，再
用PBS稀释到50毫升 1：1000
或1：100（看具
体终浓度）
β-甘油磷酸钠
β-Glycerophosphate
disodium salt hydrate 产品编号 G9422
CAS号154804-51-0
SIGMA 母液浓度1M
约4.3208克加入到20
毫升的PBS中溶解 1：100
抗坏血酸 2-Phospho-L-ascorbic
acid trisodium salt 产品编号 49752
CAS号66170-10-3
SIGMA 母液浓度5mM
约64.41毫克加入到40
毫升的PBS中溶解 1：100
胰岛素 Insulin human 产品编号 I3536
CAS号11061-68-0
SIGMA 分子量 5807.57 依据分子量和
最终浓度10
μg/ml自行计算
吲哚美辛 indomethacin 产品编号 I7378
CAS号53-86-1
SIGMA 母液浓度200mM
约71.56毫克加入到1
毫升的DMSO中溶解 1：1000
3-异丁基-1-甲基黄嘌
呤 3-Isobutyl-1-
methylxanthine 产品编号 I7018
CAS号28822-58-4
SIGMA 母液浓度0.5M
约100毫克加入到0.9
毫升的DMSO中溶解 1：1000
细胞培养级别DMSO Dimethyl sulfoxide 产品编号 D2650
CAS号67-68-5
SIGMA 作为配置母液的溶剂
使用 ----
人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定
中国组织工程研究 第19卷 第32期 2015–08–06出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research August 6, 2015 Vol.19, No.32
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
5155 肖建红，女，1980年生，四川省绵阳市人，羌族，2012年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事造血干细胞抑制、干细胞与组织工程，以及免疫性血小板减少性紫癜的临床研究和基础研究。 通讯作者：张阳春，硕士，主治医师，中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2015)32-05155-07 稿件接受：2015-07-01 Xiao Jian-hong, M.D., Attending physician, Department of Internal Medicine, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China Corresponding author: Zhang Yang-chun, Master, Attending physician, Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China Accepted: 2015-07-01 人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定 肖建红1，张阳春2，张常然1，杨 兴2(中山大学附属第一医院东院，1普通内科，2下肢骨科，广东省广州市 510700) 文章亮点： 1 实验通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。 2 实验发现第5代脂肪干细胞比较适合进行成脂及成骨诱导分化，以确定其多向分化潜能。 3 DAPI是一种简单、有效的标记人脂肪干细胞的方法，DAPI不损伤细胞活性，对细胞标记率高。 关键词： 干细胞；脂肪干细胞；人来源的脂肪干细胞；细胞分化；脂肪组织；细胞培养；细胞鉴定；国家自然科学基金 主题词： 干细胞；皮下脂肪；细胞分化；细胞，培养的 基金资助： 国家自然科学基金青年项目(81500091)；广东省自然科学基金博士启动项目(2015A030310022)；广州市黄埔区科技计划项目(201444-02) 摘要 背景：脂肪干细胞是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的间充质干细胞，在组织工程中比骨髓间充质干细胞具有更多优势，是当今的研究热点之一。 目的：在体外建立一种分离纯化人皮下脂肪来源脂肪干细胞的方法，进行体外培养扩增及诱导其向成骨、成脂细胞分化。 方法：通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。倒置显微镜下观察人脂肪干细胞的细胞形态和生长特性。选取第2代及第5代细胞，用CCK-8法检测细胞活性，绘制细胞生长曲线，用流式细胞仪检测细胞表面抗原标记。选取第5代细胞，分别进行成脂及成骨诱导分化，以确定其多向分化潜能。 结果与结论：①采用密度梯度离心和贴壁培养相结合方法，可成功从人脂肪组织中获得纯度较高的人脂肪干细胞。②人脂肪干细胞经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，符合正常细胞的生长规律，且其生长具有对数生长期，其倍增时间较短。③人脂肪干细胞表达干细胞表面抗原标记，具有低免疫原性，且具有成脂成骨多向分化潜能。④DAPI是一种简单、有效的标记人脂肪干细胞的方法，DAPI不损伤细胞活性，对细胞标记率高。 肖建红，张阳春，张常然，杨兴. 人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定[J].中国组织工程研究，2015，19(32):5155-5161. doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.013 Human subcutaneous adipose-derived stem cells: osteoblastic/adipogenic differentiation and identification Xiao Jian-hong1, Zhang Yang-chun2, Zhang Chang-ran1, Yang Xing2 (1Department of Internal Medicine, 2Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China) Abstract BACKGROUND: Adipose-derived stem cells are a kind of mesenchyam stem cells with multipotent differentiation capacity, which have more advantages than bone marrow mesenchymal stem cells in tissue engineering research. OBJECTIVE: To establish a method to isolate and purify adipose-derived stem cells from human subcutaneous adipose tissues followed by in vitro amplification and osteoblastic/adipogenic differentiation. METHODS: Adipose-derived stem cells were isolated from human subcutaneous adipose tissue and cultured by density gradient centrifugation and adherent culture. Cell morphology and growth features were observed under inverted microscope. Adipose-derived stem cells at passages 2 and 5 were selected for viability measurement using cell counting kit-8 method, and then cell growth curves were drawn. The immunophenotype identification was analyzed by flow cytometry. Passage 5 cells underwent osteoblastic/adipogenic induction to confirm the multi-differentiation potential. RESULTS AND CONCLUSION: (1) Using density gradient centrifugation and adherent culture method, high-purity human adipose-derived stem cells can be successfully isolated from human adipose tissues. (2) The growth process of human adipose-derived stem cells includes stagnant phase, logarithmic phase and plateau phase, which meets the growth rhythm of normal cells. Moreover, the population doubling time is shorter. (3). 肖建红，等. 人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定
干细胞共培养的方法及其分化诱导_王珊青
ＣＲＴＥＲ
Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００４ｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ复旦大学附属中山医院整形外科，上海市２０００３２王珊青★，女，１９８３年生，江苏省南京市人，汉族，２００７年复旦大学医学院毕业，硕士，住院医生，
主要从事组织工程软骨方面的研究。ｗｓｑｙｖｏｎｎｅ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ通讯作者：徐剑炜，主任医师，复旦大学附属中山医院整形外科，上海市２０００３２ｊａｍｅｓｗａｙ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ中图分类号：Ｒ３９４．２文献标识码：Ａ文章编号：１６７３－８２２５（２００７）１１－０２１２２－０４收稿日期：２００６－１２－０７修回日期：２００７－０２－０１（０６－５０－１２－８８３１／ＺＳ・Ｑ）干细胞共培养的方法及其分化诱导★
王珊青，徐剑炜Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｔｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＡｂｓｔｒａｃｔＯＢＪＥＣＴＩＶＥ：Ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｏｆｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓａｎｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏｕｌｄｉｎｄｕｃｅｓｔｅｍｃｅｌｌｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇｉｎｔｏｔｈｏｓｅｋｉｎｄｓｏｆｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｔｏｒｅｖｉｅｗｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＤＡＴＡＳＯＵＲＣＥＳ：ＴｈｅｒｅｌａｔｅｄａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｄｉｎＰＵＢＭＥＤｂｅｔｗｅｅｎＪａｎｕａｒｙ１９９０ａｎｄＮｏｖｅｍｂｅｒ２００６ｕｓｉｎｇｃｏｍｐｕｔｅｒｗｉｔｈｔｈｅｋｅｙｗｏｒｄｓｏｆ＂ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ＂ｉｎＥｎｇｌｉｓｈ．Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ｔｈｅｒｅｌａｔｅｄａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｄｉｎＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌＦｕｌｌ－ｔｅｘｔＤａｔａｂａｓｅ（ＣＪＦＤ）ｂｅｔｗｅｅｎＪａｎｕａｒｙ１９９０ａｎｄＮｏｖｅｍｂｅｒ２００６ｗｉｔｈｔｈｅｓａｍｅｋｅｙｗｏｒｄｓｉｎＣｈｉｎｅｓｅ．ＳＴＵＤＹＳＥＬＥＣＴＩＯＮ：Ｆｉｒｓｔｔｒｉａｌｗｉｔｈｔｈｅｄａｔａｗａｓｇｏｔｔｅｎ，ａｎｄｔｈｅｃｉｔａｔｉｏｎｓｏｆｅｖｅｒｙｒｅｆｅｒｅｎｃｅｗｅｒｅｃｈｅｃｋｅｄ．Ｉｎｃｌｕｓｉｖｅｃｒｉｔｅｒｉａ：Ｔｈｅａｒｔｉｃｌｅｓｔｈａｔｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄｗｅｒｅａｄｏｐｔｅｄ．Ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｃｒｉｔｅｒｉａ：ＲｅｐｅｔｉｔｉｖｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｓｏｒＭｅｔａａｎａｌｙｓｉｓａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅｅｘｃｌｕｄｅｄ．ＤＡＴＡＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ：Ｔｏｔａｌｌｙ４０ｒｅｌａｔｅｄａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ，ａｎｄ３０ａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅａｃｃｏｒｄｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｌｕｓｉｖｅｃｒｉｔｅｒｉａ．Ｔｈｅ１０ｅｘｃｌｕｄｅｄａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅｏｌｄｏｒｒｅｐｅａｔｅｄｏｎｅｓ．Ｉｎｔｈｅｓｅ３０ａｒｔｉｃｌｅｓ，ｔｈｅｙｄｉｓｃｕｓｓｅｄａｂｏｕｔｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｏｆｃｅｌｌｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐａｒａｃｒｉｎｅａｃｔｉｏｎｏｆｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓ，ｃｅｌｌｓａｎｄｃｅｌｌｇａｐｊｕｎｃｔｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｄｕｅｔｏｃｒｅｖｉｃｅｕｎｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓ．ＤＡＴＡＳＹＮＴＨＥＳＩＳ：Ｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏｕｌｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｍａｎｙｋｉｎｄｓｏｆｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓｉｎｄｅｆｉｎｅｄｍｅｄｉａ．Ｗｉｔｈｔｈｉｓｐｒｏｐｅｒｔｙ，ｉｔｈａｄｐｒｏｖｉｄｅｄｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｅｓｆｏｒｔｈｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓｗｉｔｈｍａｔｕｒｅｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓｃｏｕｌｄｉｎｄｕｃｅｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｔｏｔｈａｔｋｉｎｄｏｆｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅ６ｋｉｎｄｓｏｆｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓ，ｎａｍｅｌｙｍｏｎｏｌａｙｅｒｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｒａｎｓｗｅｌｌｓ，ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ，ｃｅｌｌｐｅｌｌｅｔ，ｃｅｌｌｓｈｅｅｔａｎｄｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓ＇ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｗｅｒｅｔｈａｔｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓｐｒｏｖｉｄｅａｓｕｉｔａｂｌｅｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｆｏｒｅｘｐａｎｓｉｏｎｏｆｔｈｅｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ｂｙｓｅｃｒｅｔｉｎｇｓｏｍｅｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ａｎｄａｃｔｉｖａｔｉｎｇｔｈｅＰＩ３－ｋｉｎａｓｅ，ＭＡＰＫｓ，ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣ，ｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ｃｅｌｌ－ｔｏ－ｃｅｌｌｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗａｓａｓｅｐａｒａｔｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｆｏｒｓｔｅｍｃｅｌｌｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｓｔｅｍｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｗａｓｔｈｅｇａｐｊｕｎｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ：Ｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃａｎｂｅｉｎｄｕｃｅｄｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｂｙｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｏｆｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓａｎｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｃｈｈａｖｅｂｅｅｎａｃｅｒｔａｉｎｆｅａｓｉｂｌｅａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄ．Ｂｕｔｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｓｓｔｉｌｌｕｎｃｌｅａｒ．ＷａｎｇＳＱ，ＸｕＪＷ．Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｔｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＺｈｏｎｇｇｕｏＺｕｚｈｉＧｏｎｇｃｈｅｎｇＹａｎｊｉｕｙｕＬｉｎｃｈｕａｎｇＫａｎｇｆｕ２００７；１１（１１）：２１２２－２１２５（Ｃｈｉｎａ）［ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ／ｚｇｌｃｋｆ／ｅｊｏｕｒｎａｌ／ｕｐｆｉｌｅｓ／０７－１１／１１ｋ－２１２２（ｐｓ）．ｐｄｆ］摘要目的：体细胞与干细胞共培养可以诱导干细胞向该种体细胞表型分化，文章就干细胞共培养的不同方法及其诱导分化的机制进行综述。资料来源：应用计算机检索ＰＵＢＭＥＤ１９９０－０１／２００６－１１期间的相关文章，检索词为“ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ”，并限定文章语言种类为Ｅｎｇｌｉｓｈ。同时计算机检索中国期刊全文数据库１９９０－０１／２００６－１１期间的相关文章，检索词为“干细胞，共培养”，并限定文章语言种类为中文。资料选择：对资料进行初审，并查看每篇文献后的引文。纳入标准：文章所述内容应与干细胞共培养分化诱导研究相关。排除标准：重复研究或Ｍｅｔａ分析类文章。资料提炼：共收集到４０篇相关文献，３０篇文献符合纳入标准，排除的１０篇文献为内容陈旧或重复。符合纳入标准的３０篇文献中，分别涉及干细胞与体细胞共培养的不同方法、体细胞的旁分泌作用、细胞与细胞接触介导诱导以及干细胞与体细胞之间的缝隙连结诱导干细胞分化的可能机制。资料综合：干细胞可以通过特定的培养条件被诱导分化成具有不同表型的细胞，这为组织工程技术的应用提供了又一有效的种子细胞来源。用体细胞与干细胞共培养同样可以诱导干细胞向该种体细胞表型分化。干细胞与体细胞共培养的方法主要有六种，分别为单层共培养（ｍｏｎｏｌａｙｅｒｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）、分层渗透培养（ｔｒａｎｓｗｅｌｌｓ）、悬浮培养（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ）、细胞团块培养（ｃｅｌｌｐｅｌｌｅｔ）、细胞层培养（ｃｅｌｌｓｈｅｅｔ）以及三维支架培养。干细胞分化的可能机制是体细胞通过分泌一些细胞因子，从而激活蛋白激酶，如ＰＩ３－激酶、促分裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶Ｃ等，作用于相关的受体或抑制体，为干细胞的分化增殖提供了合适的环境。同时，有研究显示细胞与细胞接触反应是干细胞分化的独立机制。缝隙连接介导的细胞与细胞间反应也是干细胞分化中必需的。结论：干细胞与体细胞共培养诱导干细胞定向分化已经成为一种确实可行且非常有研究前景的方法，但共培养诱导分化的机制尚未完全明确。关键词：干细胞；细胞培养技术；细胞分化；综述文献王珊青，徐剑炜．干细胞共培养的方法及其分化诱导［Ｊ］．中国组织工程研究与临床康复，２００７，１１（１１）：２１２２－２１２５［ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ／ｚｇｌｃｋｆ／ｅｊｏｕｒｎａｌ／ｕｐｆｉｌｅｓ／０７－１１／１１ｋ－２１２２（ｐｓ）．ｐｄｆ］综述
成骨诱导培养基配方
成骨诱导培养基配方
介绍
成骨诱导是一种在体外培养条件下诱导干细胞或间充质干细胞向成骨细胞分化的过程。成骨诱导培养基是通过提供特定的营养物质和生长因子来模拟体内成骨环境的培养基。本文将详细讨论成骨诱导培养基的配方及其影响因素。
成骨诱导因子
成骨诱导培养基的核心是成骨诱导因子，它们是一类能够促进干细胞或间充质干细胞向成骨细胞分化的信号分子。以下是一些常见的成骨诱导因子：
1. 骨形成蛋白（BMPs）
2. 成骨细胞分化因子（RUNX2）
3. 碱性磷酸酶（ALP）
4. 骨基质蛋白（BSP）
5. Osterix
这些因子在不同阶段的成骨分化中起着关键作用，并能够调控细胞增殖、分化和骨基质合成。
成骨诱导培养基配方
成骨诱导培养基的配方是根据不同细胞类型和研究目的来确定的。下面是一种经常使用的成骨诱导培养基配方：
成骨诱导培养基配方（基础版）
• DMEM/F12培养基
• 胚牛血清（FBS）或胎牛血清（FCS）
• 抗生素/抗真菌剂（如青霉素/链霉素）
• 1% 非必需氨基酸溶液
• 2 mM L-谷氨酰胺（L-Glutamine）
• 10 mM β-甘油磷酸钠（β-glycerophosphate）
• 10 nM 二磷酸腺苷（dexamethasone） • 0.05 mM 抗坏血酸（ascorbic acid）
• 成骨诱导因子（根据需求添加）
成骨诱导培养基的优化
成骨诱导培养基的配方可以根据研究需求进行优化。以下是一些常见的优化因素：
1. 成分浓度调节
各种成分的浓度可以根据实验需要进行调节。例如，增加成骨诱导因子的浓度可以提高成骨分化效果，而降低成骨诱导因子的浓度则可以减缓成骨分化速度。
2. 添加辅助因子
除了基本的成骨诱导因子外，还可以添加其他辅助因子来增强成骨效果。例如，添加维生素D3和维生素K2可以提高骨基质合成和骨矿化。
3. 优化培养时间
培养时间对于成骨诱导的效果也有一定影响。较长的培养时间可以促进细胞进一步分化为成熟的成骨细胞，但可能会降低细胞存活率。
神经干细胞分化为少突胶质细胞的方法、培养基及用途
神经干细胞分化为少突胶质细胞的方法、培养基及用途
神经干细胞是具有自我更新和分化成多种细胞类型能力的多能干细胞。神经干细胞分化为少突胶质细胞是近年来研究的热点之一。少突胶质细胞是一种类似于星形细胞的神经胶质细胞，在神经系统中起着很重要的支持作用。在临床应用方面，少突胶质细胞的作用同样非常重要。在这篇文章中，我们将会讨论神经干细胞分化为少突胶质细胞的方法、培养基及其用途。
神经干细胞分化主要分为两种方法：自然分化和向导分化。自然分化是指在无添加外源性因素的情况下，神经干细胞随机分化为不同种类细胞。而向导分化是指在添加一定的外源性因素的帮助下，神经干细胞有选择性地分化为特定种类的细胞。
目前，神经干细胞分化为少突胶质细胞的方法主要采用向导分化方法。向导分化方法主要包括以下几种方式：
1.小分子化合物诱导
小分子化合物是一种可以促进神经干细胞分化的化学物质，通过添加小分子化合物，可以促进神经干细胞向少突胶质细胞的分化。例如，添加化合物可溶性文件夹（SB431542）可以促进神经干细胞向少突胶质细胞的分化。
2.神经营养因子诱导
3.基质分子诱导
4.遗传学方法
遗传学方法通常采用基因转染的方式，通过转染一些特定的DNA/RNA到神经干细胞中，可以促进其向少突胶质细胞分化。例如，转染SOX9和PAX6基因可以使神经干细胞向少突胶质细胞分化。
神经干细胞分化需要一种特殊的培养基，称为神经分化培养基。神经分化培养基的成分复杂，包括不同种类的营养物质、生长因子和基质分子。不同的培养基成分会影响分化的种类和分化效率。
目前，常用的神经分化培养基包括：
1. DMEM/F12：Dulbecco的最小必需培养基/12号哈弗地球村培养基
2. 人血清/胎儿牛血清/N2/B27补充因子：这些成分可以为细胞提供必需的蛋白质和营养物质
大鼠骨髓间充质干细胞体外培养以及成骨诱导
数理医药学杂志 ２０１１年第２４卷第２期
文章编号：１００４—４３３７（２０１１）０２—０１３９—０３ 中图分类号：Ｑ８１３．１ １ 文献标识码：Ａ ・基础医学研究・
大鼠骨髓问充质干细胞体外培养以及成骨诱导
龚子龙 戴冀斌
（武汉大学基础医学院武汉４３００７１）
摘要： 目的：分离培养大鼠骨髓问充质干细胞，研究其体外培养的生物特性。方法：获取骨髓间充质干细胞进行培养，倒置相
差显微镜观察细胞生长情况，绘制生长曲线，流式细胞仪鉴定细胞表面抗原。在地塞米松、 甘油磷酸钠、抗坏血酸的作用下，进行成
骨诱导分化。结果：原代和传代培养的体外培养细胞呈现梭形、多角形外观，具有较强的生长增殖能力；细胞ＣＤ２９抗原呈阳性表达， ＣＤ３４呈阴性表达。分化细胞表现成骨细胞特性，茜素红染色有橘红色磷酸盐胞外基质沉积。结论：建立稳定可靠的分离培养大鼠骨 髓ＢＭ－ＭＳＣｓ方法，分离出的ＢＭ－ＭＳＣｓ具有干细胞的生物特性，可用于组织工程中的种子细胞。
关键词： 间充质干细胞； 骨髓；成骨诱导； 细胞培养
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４—４３３７．２０１１．０２．００７
在大鼠骨髓基质系统存在的骨髓间充质干细胞（Ｂｏｎｅ
ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＢＭ－ＭＳＣｓ），是一种除造血干
细胞以外的、具有多向分化潜能的干细胞，可以向骨、软骨、肌
组织、皮肤、脂肪、神经等多种组织分化，因此可以作为组织工
程中的种子细胞 ］。虽然容易分离得到，但骨髓中ＢＭ－ＭＳＣｓ
含量很少，难以满足组织工程和细胞治疗的需要，因此体外纯
化和扩增尤其重要。
１材料与方法
１．１主要试剂及仪器
ＳＰＦ级ＳＤ大鼠（雄性，体重９Ｏ～１００ｇ），由武汉大学实验
动物中心提供。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基（Ｇｉｂｃｏ）、胎牛血清（杭州
四季青）、胰蛋白酶（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、倒置相差显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ）、
细胞培养箱（Ｆｏｒｍａ），ＣＤ２９、ＣＤ３４兔抗鼠单克隆抗体均购自
3t3-l1细胞诱导分化原理
3t3-l1细胞诱导分化原理
3T3-L1细胞是一种常用的成纤维细胞株，可通过特定的诱导条件转分化为脂肪细胞。其诱导分化的原理是通过连续培养和控制细胞外环境，使细胞经历特定的分化过程。
首先，3T3-L1细胞会被培养在含有高营养的培养基中，其中含有高浓度的葡萄糖和羊血清。这一步骤有助于细胞增殖和发育。接下来，在细胞生长至达到密度的时候，减少培养基中营养物的浓度，同时添加较低浓度的羊血清。这种改变细胞外环境的操作有助于减少细胞增殖，促进细胞向分化方向发展。
然后，在细胞进入密集生长阶段之后，可以应用一种称为诱导剂的物质来促使细胞向脂肪细胞分化。常用的诱导剂有一种混合物，包括二甲苯和异丙基甲基酰胺(DMI)。这种物质可以诱导细胞内的转录因子PPARγ和C/EBPα的表达，这两个转录因子在脂肪细胞分化中起到关键作用。
最后，在细胞处于诱导剂作用下，可以观察到细胞的形态和特征从成纤维样逐渐转变为脂肪细胞特征。这包括细胞膜的变化、细胞内脂滴的积聚以及与脂肪细胞相关的基因表达的增加。
综上所述，3T3-L1细胞的诱导分化原理主要包括通过调节细胞外环境和应用特定的诱导剂，促使细胞向脂肪细胞方向分化，并最终表现出脂肪细胞特征。
干细胞流程及注意事项说明
干细胞流程及注意事项说明
干细胞是一种具有自我更新和分化能力的细胞，具有广泛的应用前景。在干细胞研究中，正确的操作流程和注意事项非常重要，下面将为您详细介绍干细胞流程及注意事项说明。
一、实验前准备
1.1 实验室环境
干细胞实验需要在严格的无菌条件下进行，因此实验室环境应该保持清洁、整洁、无尘，并且要定期消毒。
1.2 实验仪器
干细胞实验所需的仪器设备包括显微镜、离心机、培养箱等。这些设备应该经过严格的检测和保养，确保其正常运行。
1.3 培养基和试剂
干细胞培养需要使用特殊的培养基和试剂，这些物品应该购买正规厂家生产的产品，并且要注意保存条件。
二、获取干细胞
2.1 干细胞来源
目前可以用于获取干细胞的方法有多种，包括体内分离、体外培养等。其中较为常见的方法是从人类或动物组织中分离出干细胞。
2.2 干细胞分离
干细胞分离需要使用特殊的试剂和设备，具体操作步骤如下：
（1）准备组织样本，并进行消化处理。
（2）将消化后的组织样本过筛，去除不需要的组织碎片和异物。
（3）使用特定的抗体或其他方法对干细胞进行分离。
2.3 干细胞培养
将分离出的干细胞放入培养基中进行培养。在培养过程中应该注意以下事项：
（1）保持无菌状态，避免污染。
（2）定期更换培养基，以保证营养物质的供应和废物的排出。
（3）控制培养温度、湿度和二氧化碳浓度等环境条件，以促进干细胞生长和分化。
三、干细胞鉴定
为了确保分离出来的是真正的干细胞，需要进行鉴定。常用的鉴定方法包括：
3.1 免疫荧光染色法
使用特异性抗体标记干细胞表面标志物，然后观察染色结果。如果干细胞表面标志物呈阳性，说明分离出的是真正的干细胞。
3.2 流式细胞术
利用流式细胞仪对干细胞进行鉴定。流式细胞仪可以对单个细胞进行检测，并且可以同时检测多种标志物。
四、干细胞分化
4.1 干细胞分化方法
干细胞可以通过不同的方法进行分化，包括：
（1）生长因子诱导法：通过添加特定的生长因子来促进干细胞向特定方向分化。
胚胎干细胞的定向诱导分化及应用
生物学教学２０１１年（第３６卷）第５期
胚胎干细胞的定向诱导分化及应用
林 海 张 芳 郝慧敏 （河南省鹤壁职业技术学院４５８０３０） ・＇・
摘要胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团分离培养出来的具有发育全能性或多能性的干细胞，具有多向分化潜能和自我更新
的特性。胚胎干细胞可以定向诱导分化生产组织和细胞，可为细胞移植提供无免疫原性的材料，为难以治愈的疾病的细胞移植治
疗提供可能。本文介绍了胚胎干细胞的诱导分化方法和应用前景。
关键词胚胎干细胞定向诱导分化分化潜能 自我更新
早在１９８１年，英国剑桥大学的Ｅｖａｎｓ等…建立了
小鼠的胚胎干细胞系。１９９８年Ｔｈｏｍｓｏｎ等－２ Ｊ建立了
人胚胎干细胞细胞系。１９９９年ｌ２月，美国《科学》杂
志将干细胞的研究成果列为当年十大科学进展榜首。
相关研究在细胞治疗、胚胎发育、新基因的功能研究、
基因治疗、药物筛选、新药药理研究与开发等领域都显
现出诱人的应用前景。胚胎干细胞治疗（无论自体还
是异体）应用最关键的问题在于定向诱导分化。大量
的研究表明，胚胎干细胞可以向多种细胞类型诱导分
化，诱导分化技术也有了较大的发展，为干细胞治疗和
器官移植研究提供了基础资料，胚胎干细胞已成为全
世界的研究热点。
１胚胎干细胞概述
胚胎干细胞是由动物胚胎早期的内细胞团或胎儿
的原始生殖细胞经体外分离培养而获得的一种具有发
育全能性或多能性的细胞。根据其来源分为胚胎干细
胞和胚胎生殖细胞。一般将两者统称为胚胎干细胞。
胚胎干细胞具有多向分化潜能和自我更新的特性，可
以分化形成人和动物个体各种类型的细胞，甚至分化 发育成新的个体。
２胚胎干细胞定向诱导分化方法
目前通常采用的方法是针对不同的终末靶细胞有
目的地选择适当的分化诱导剂，使胚胎干细胞向一定
方向分化。常用的诱导方法包括：化学诱导剂诱导法、
细胞因子诱导法、共培养方式诱导法和转基因诱导法
等。
２．１化学诱导剂诱导法维甲酸（ＲＡ）、二甲基亚砜
雷洛昔芬通过促进一氧化氮释放诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化
・２４・ 中国药理学通报Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ２０１１ Ｊａｎ；２７（１）：２４～８ 雷洛昔芬通过促进一氧化氮释放 诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化 卢翔，陈江宁，张峻峰 （南京大学生命科学院生物医药国家重点实验室，江苏南京２１００９３） 中国图书分类号：Ｒ一３３２；Ｒ３２９．２１；Ｒ３２９．２４；Ｒ９７７．１２ 文献标识码：Ａ文章编号：１００１—１９７８（２０１１）Ｏ１—００２４—０５ 摘要：目的探讨雷洛昔芬诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化 作用及其机制。方法从大鼠体内提取分离脂肪干细胞，并 进行多向分化能力鉴定。在成骨诱导培养液中加入不同浓 度雷洛昔芬（０、０．０１、０．１、１ Ｉｘｍｏｌ・Ｌ ）、非选择性一氧化氮 合成酶抑制剂 一硝基精氨酸甲酯（Ｌ—ＮＡＭＥ（１ ｍｍｏｌ・ Ｌ ））、雷洛昔芬（１ｔｘｍｏｌ・Ｌ ）＋Ｌ—ＮＡＭＥ（１ ｍｍｏｌ・Ｌ ）， 在共同条件培养１４—２８ ｄ，测定各项成骨细胞形成指标。结 果雷洛昔芬（０．０１—１ ｌ￣ｍｏｌ・Ｌ ）能明显提高脂肪干细胞 胞质一氧化氮的释放和成骨细胞分化标志基因（碱性磷酸 酶、骨形态发生蛋白２和Ｉ型胶原）的表达以及矿化结节的 生成， 一ＮＡＭＥ可以拮抗雷洛昔芬引起的胞质一氧化氮的释 放，并同时抑制雷洛昔芬诱导脂肪干细胞向成骨分化的作 用。结论雷洛昔芬可以促进胞质一氧化氮释放，从而诱导 脂肪干细胞向成骨细胞分化。 关键词：雷洛昔芬；脂肪干细胞；多向诱导分化；成骨分化；一 氧化氮；细胞增殖 长期的雌激素补充治疗可以改善妇女更年期骨 质流失以及降低骨折发生的几率，但同时可增加乳 腺癌的风险¨Ｊ。选择性雌激素受体调节剂（ｓｅｌｅｃ． ｔｉｖｅ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ，ＳＥＲＭ）雷洛昔芬 （ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ，Ｒａ１）为一种非类固醇类、苯噻酚化合物， 由于其对骨骼具有保护作用，对乳腺和子宫内膜无 刺激作用，已被批准用于绝经后妇女骨质疏松的预 防和治疗。雷洛昔芬除了可以预防和治疗绝经后妇 女的骨质疏松症，增加骨密度，还能降低乳腺癌和子 宫内膜肿瘤的风险、动脉粥样硬化形成指标以及心 血管疾病发生的可能 。Ｊ。但此种化合物调节成骨 分化作用、机制目前仍不甚明了 Ｊ。本实验通过雷 洛昔芬介导的大鼠脂肪来源的间充质干细胞体外培 养，探讨雷洛昔芬诱导脂肪干细胞向成骨分化的能 收稿日期：２０１０～１０—０８，修回日期：２０１０—１１—２３ 基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ ３０７７１０３６） 作者简介：卢翔（１９８０一），男，博士生，研究方向：药理学，Ｔｅｌ：０２５－ ８３５９６５９４，Ｅ—ｍａｉｌ：ｋａｋａ—ｂｂ＠１６３．ｅｏｍ； 张峻峰（１９６８一），男，博士，教授，研究方向：药物靶向性 治疗与药理学，通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊ￣ｈａｎｇ＠ｎｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 力及其机制。 １材料与方法 １．１材料 １．１．１ 实验动物ｓＤ大鼠，早，体质量（２００±２０） ｇ（维通利华动物试验中心，合格证编号：ＳＣＸＫＩ１— ００—０００９）。 １．１．２试剂与药品 雷洛昔芬（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ，Ｒａ１）由 山东银飞达药业有限公司提供。ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ，Ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ，Ｓ ｍｅｄｉｕｍ）培养基、胎牛血清（ｆｅｔａｌ ｂｏ— ｖｉｎｅ ｓｅｒｔｌｍ，ＦＢＳ）、青一链霉素溶液、十二烷基磺酸 钠（ＳＤＳ）购自美国Ｇｉｂｃｏ公司；维生素Ｃ（ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ）、３－磷酸甘油（３－ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、地塞米松 （ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、ＩＩ型胶原酶（ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、 胰蛋白酶（ｔｒｙｐｓｉｎ）、溴化甲基噻唑基四唑（ｍｅｔｈｙｔｈｉ— ａｚｏｌｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ，ＭＴＴ）、茜素红（ａｌｉｚａｒｉｎ）购 自美国Ｓｉｇｍａ公司；ＢＭＰ２、Ｃｏｌ—Ｉ抗体购自武汉博士 德生物技术有限公司。ＴＲＩｚｏｌ购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司。碱性磷酸酶（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＡＬＰ）试剂 盒购自南京建成生物技术研究所；ＰＣＲ引物由Ｉｎ． ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成。用于逆转录和ＰＣＲ的分子生物 学试剂全部购自Ｅｔ本ＴａＫａＲａ公司。一氧化氮（ｎｉ． ｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ，ＮＯ）试剂盒购自碧云天生物技术研究所。 其他相关试剂均购买自南京生兴生物有限公司，均 为国产或者进口分析纯。 １．１．３ 主要实验仪器和设备 电子天平（德国 Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司）；离心机（美国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）；紫 外分光光度计（深圳爱克分析仪器有限公司）；ＣＯ。 恒温培养箱（上海华明医化器械厂）；２９３４型倒置相 差显微镜（ＣＯＩＣ公司）；ＭｏｄｅＢ５０酶联免疫检测仪 （日本ＢＩＯ—ＲＡＤ公司）；ＰＣＲ仪（日本ＢＩＯ—ＲＡＤ公 司），ＨＮＺ一１．１Ｆ垂直流形超净工作台（南通沪南科 学仪器有限公司）；培养板（Ｃｏｍｉｎｇ—Ｃｏｓｔａｒ，ＮＹ，美 国） １．２方法 １．２．１细胞培养断颈处死大鼠，提取腹股沟脂肪 组织。按文献ｌ６一 中的方法，提取脂肪干细胞，将５ ｍｌ的细胞以２×１０ ｃｅｌｌｓ・Ｌ 的密度接种于培养瓶 中，４８ ｈ后换液，待细胞达８０％汇合时，
人诱导多能干细胞ipsc实验步骤
人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）实验步骤一般包括以下几个步骤：
1. 细胞来源：从人体组织中提取成纤维细胞或皮肤细胞等，经过重编程后获得iPSCs。
2. iPSCs的培养：将iPSCs置于含有胎牛血清和抗生素的培养皿中培养，并在培养液中添加适当的生长因子和激素。
3. iPSCs的鉴定：使用荧光标记的抗体检测iPSCs的细胞表面标志物，如SSEA-4和TRA-1-81等。
4. iPSCs的定向分化：将iPSCs定向分化成所需的细胞类型，如心肌细胞、神经元、肝细胞等。
5. 细胞培养和分离：将分化后的细胞进行培养和分离，以获得足够数量的细胞用于实验。
6. 实验操作：根据实验目的进行相应的操作，如细胞移植、药物筛选、基因编辑等。
7. 结果分析：对实验结果进行分析，如细胞形态、基因表达、细胞功能等方面的分析。
需要注意的是，iPSCs实验涉及到细胞操作和遗传操作等高风险操作，需要严格遵守实验室安全规定和操作规范。