禽呼肠孤病毒σNS和σC基因shRNA载体构建及其干扰效果测定
２０１２年２５卷２期 ＶｏＬ ２５ Ｎ０．２ 西南农业学报 Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ ＪｏｎｍＭ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
文章编号：１００１—４８２９（２０１２）０２一ｏ６９７一Ｏ６
禽呼肠孤病毒ｃｒＮＳ和（】ｒＣ基因ｓｈＲＮＡ载体
构建及其干扰效果测定
熊文婕 ，谢芝勋 ，刘加波２，庞耀姗２，谢志勤２，邓显文２，谢丽基２
（Ｉ．防城港市动物疫病预防控制中心，广西防城港５３８００１；２．广西壮族自治区兽医研究所，广西南宁５３０００１）
摘要：禽呼肠孤病毒 基因是病毒粘附蛋白， ｓ基因具有结合单链ＲＮＡ活性。根据ｓｉＲＮＡ靶序列设计原则，设计￣ｄ－＃ｔ ｓｉＲＮＡ模板并克隆到ｓｈＲＮＡ表达载体ｐＳｉｌｅｎｅｅｒ－ＣＭＶ ４．１ ｎｅｏ。分别构建了针对 ｃ基因的ｓｈＲＮＡ载体ｃ１、ｃ２、ｃ３和针对 ｓ基
因的ｓｈＲＮＡ载体ＮＳＩ、ＮＳ２、ＮＳ３。将构建的８ｈＲＮＡ载体和阴性对照分别与表达 ｃ和 Ｓ基因的融合蛋自的真核表达载体ｐＥＧ． ＦＰ‘ Ｃ及ｐＥＣＦＰ・ｃｒＮＳ共转染ＤＦ一１细胞。荧光显微镜观察结果表明，６个ｓｈＲＮＡ片段不同程度地抑制各自融合蛋白的表达。Ｒｅａ１．
ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测结果表明，Ｃ３和ＮＳ１体外干扰病毒复制的效果最佳。 关键词：禽呼肠孤病毒；ｓｈＲＮＡ；干扰
中围分类号：Ｓ８５１．３４ ７．２ 文献标识码：Ａ
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｈｏｒｔ Ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ Ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ Ａｖｉａｎ Ｒｅｏｖｉｒｕｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ
＆ｏＣ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｔｓ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｅ ｃｔ
ＸＩＯＮＧ Ｗｅｎ－ｊｉｅ‘，ＸＩＥ Ｚｈｉ・ｘｕｎ２‘，ＩＪＵ Ｊｉａ—ｂｏ２，ＰＡＮＧ Ｙａｎ—ｓｈａｈ２，ＸＩＥ Ｚｈｉ－ｑｉｎ２，ＤＥＮＧ Ｘｉａｎ－ｗｅｎｚ，ＸＩＥ Ｌｉ－ｊｉ
（１・Ｆａｎｇｅｈｏｎｇｇａｎｇ Ｃｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｇｕａｎｇｘｉ Ｆａｎｇｃｈｅｎ￣ａｎｇ５３８００１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｇｕａｎｇｘｉ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅ－
ｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｕａｎｇｘｉ Ｎａｎｎｉｎｇ ５３０００１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｖｉａｎ ｒｅｏｖｉｒａｓ口Ｃ ｇｅｎｅ ＷａＳ ｒｉｍｓ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ａｎｄ ｃｒＮＳ ｇｅｎｅ ｈａｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ
ｓｉＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｓｉＲＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅｓⅥｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｓｈＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ－ＣＭＶ ４．１
ｎｏｏ．ＳｈＲＮＡ ｖ￣ｔｏｒ Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３ ｆｏｒ叮Ｃ ｇｏｎｅ ａｎｄ ｓｈＲＮＡ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ叮ＮＳ ｇｅｎｅ ＮＳＩ，ＮＳ２，ＮＳ３ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｓｅｐａｒａｔｅｌｙ．ＳｈＲＮＡ
ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ口Ｃ ａｎｄ ａＮＳ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｈＲＮＡ ｗｅｒｅ Ｃｏ—ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ＤＦ・１ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＧＦＰ・ａＣ
ａｎｄ ｐＥＧＦＰ￣ＮＳ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ６ ｓｈＲＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃｏｕｌｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓ— ｓｉｏｎ ｏｆｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｉｎ ｓｏｍｅ ｄｅｇｒｅｅｓ．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｔｅｓｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔＣ３ａｎｄＮＳ１ ｈａｄｔｈｅｂｅｓｔｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｅｆｆｅｃｔｔｏｔｈｅ ｖｉｒａｌｒｅｐｌｉｃａ－
ｔｉｏｎｉｎ ｖｉｔｒｏ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｖｉａｎ ｒｅｏｖｉｒｕｓ；ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲｎＡ）；Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ
禽呼肠孤病毒（ＡＲＶ）是呼肠孤病毒属的成员。
ＡＲＶ广泛存在于鸡、火鸡及其他禽类，能引起鸡病
毒性关节炎、腱鞘炎、鸡矮小综合症等多种疾病¨Ｊ。
随着养鸡业的快速发展，ＡＲＶ感染呈越来越普遍的
趋势，尤其对肉鸡饲养业所造成的经济损失逐年增
加 ｑ 。目前，未见有关于治疗ＡＲＶ感染较好的药
物和治疗方法报道。小干扰ＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ
收稿日期：２０１１—０９—２２ 基金项目：国家百千万人才工程人选专项资金项目 （９４５２００６０３）；广西特聘专家专项经费（２０１１Ｂ０２０）；广西自然科 学基金项目（桂科自０９９１２２２）；广西留学回国人员基金项目（桂 科回０６３９０１６） 作者简介：熊文婕（１９８４一），女，云南个旧人，硕士研究生，主要 从事禽病分子生物学研究工作，－为通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：Ｘｉｅｚｈｉｘ－ ｕｎ＠１２６．ｃｏｒｎｏ ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）是一种快捷、高效的抑制基因表达的
技术手段，现已有很多关于ｓｉＲＮＡ抑制病毒基因表
达和复制的研究报道，在基因功能研究、基因治疗方
法研究方面具有广阔的应用前景 。’Ｊ。
ＡＲＶ的 蛋白是一个与病毒吸附密切相关的
结构蛋白，与病毒的致病性和免疫应答密切相关。
ａＮＳ蛋白是一种非结构蛋白，在病毒ＲＮＡ包装和复
制的过程中发挥着重要作用 Ｊ。本研究尝试利用
ｓｉＲＮＡ手段，通过合成特异性的短发卡ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ
ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ），对ＡＲＶ的 Ｃ基因和叮Ｎｓ基
因的体外表达进行干扰，以期寻找针对禽呼肠孤病
毒感染治疗的新途径。 ６９８ 西南农业拳搬 ２５卷
１材料与方法
１．１病毒、细胞和载体
禽呼肠孤病毒Ｓｍ３株由本实验室保存，ＤＦ－Ｉ细
胞系由广西大学韦平教授惠赠，Ｐ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ—ＣＭＶ ４．１
ｌｌｅＯ载体购自美国Ａｍｂｉｏｎ公司；ＰＥＧＦＰ—ｃｒＣ（共表达
ＥＧＦＰ绿色荧光蛋白和ＡＲＶ ｃｒＣ蛋白）和ＰＥＧＦＰ・
ｃｒＮＳ载体（共表达ＥＣＦＰ绿色荧光蛋白和ＡＲＶ ｃｒＮＳ
蛋白）由本实验室保存。
１．２主要试剂和仪器
限制性内切酶ＢａｍＨ Ｉ和矾 Ⅲ、Ｔ４连接酶、
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ购自大连宝生物公司；
反转录试剂盒购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司；脂质体２０００、Ｔ卜
ｉｚｏｌ购自ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；无内毒素质粒抽提试剂盒、
胶回收试剂盒购自美国Ｏｍｅｇａ公司。荧光定量
ＰＣＲ仪为罗氏公司的Ｌｉｇｈｔ ｃｙｃｌｅ ２．０。
１．３ ＲＮＡ干扰（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．ＲＮＡ ｉ）靶位点的
设计及其ｓｈＲＮＡ表达载体的构建
根据ＮＣＢＩ上发表的禽呼肠孤病毒Ｓ嘲、Ｓｎ３３毒
株ｃｒＣ、ｃｒＮＳ序列，利用Ａｍｂｉｏｎ在线软件（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ—ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍ１）
获得１９ ｎｔ的候选ｓｉＲＮＡ靶序列，根据Ｇ＋Ｃ含量和
ＢＬＡＳＴ结果，每个基因筛选出３个ｓｉＲＮＡ靶序列，
ＳＶ４０ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ，
ＰＳｐＡＩ（４４３２｝ （４４１１）‘ （４３７５）－￣
（３５８１｝一， Ｎｒｕｌｌ３Ｓ６３）．； ｌ３５２４） １３ｏｌｙ（ＡＩ ｓｌｇｎａＩ （３２７５） Ｓｓｐｔ（３２７２）－／ ｆ３２５４）一
ＢａｍＨ Ｉ
５’一（；— ＣＣ ３－－６ 共６个（表１）。根据ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ４．１－ＣＭＶ ｎｅｏ ｓｈＲＮＡ
表达载体的特点（图１），设计出相应的具有发夹结
构的ｓｉＲＮＡ模板，每个ｓｉＲＮＡ模板由两条互补的５５
ｂｐ ＤＮＡ链构成，互相退火后能形成带有酶切位点
的ＤＮＡ双链（图２），用于连接到经酶切处理的线性
化载体Ｐ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ ４．１一ＣＭＶ ｎｅｏ中。
ｓｉＲＮＡ模板由大连宝生物公司合成，经过退火
处理，形成５’端和３’端分别带有ＢａｍＨ Ｉ和觑 Ⅲ
粘性末端的ＤＮＡ双链（图２），连接到经ＢａｍＨ Ｉ和
胁 Ⅲ双酶切的ｓｈＲＮＡ表达载体ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ４．１一
ＣＭＶ ｎｅｏ。连接反应为１Ｏ 的体系：退火处理短片
段０．３ ｐｍｏｌ，双酶切ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ４．１－ＣＭＶ ｎ￣ｏ载体０．
０３ ｐｍｏｌ，Ｔ４ ＤＮＡ连接酶Ｉ ｌｘｌ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ １ ，超纯
水补足ｌＯ ，１６℃连接过夜。次日连接产物全部
转化感受态细胞，经恒温培养４５ ｍｉｎ后，将转化液
涂布于含有氨苄青霉素的ＬＢ琼脂平板，３７℃培养
过夜。将含有氨苄青霉素抗性的ＬＢ平板筛选的菌
落送上海英俊公司测序验证。
１．４鸡胚成纤维细胞ＤＦ一１的培养
用适量生长液重悬细胞浓度至１０ ￣＂／ｍＬ，分
装于细胞板和细胞瓶，置于３７℃５％ＣＯ 培养箱
内培养。培养基为含１０％胎牛血清和促细胞生长
因子的ＤＭＥＭ。
ｒ（４７５８） ［ｐｏｌｙ ＩＡｌ ８ｉｇｍａｌ Ｉ ｒＳｓｐ［（４７６２Ｊ Ｉ，ｒＨｉｎｄｆＩＩ（４６３） ＩＩ ｒ（Ｕ
、 Ｊｉ ｒｓ ｉＲＮＡ（５１ｅ）
ｐＳｉｌｅｎｃｅｆＭ ４．１・ＣＭＶ ｎｅｏ
４９４４ ｂｐ
Ａｍｐｉｃｉｌｌｌｎ Ｊ （２３３３） （２３９４） ＣＭＶＰｒｏｍｐｔｅｒ
Ｅ１１１８）ｃｏＲＩ｛１１１９）
｛１４４８）
ＣｏｌＥ１ ｏｒｉｇｉｎ
图１ Ｐ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ ４．１－ＣＭＶ ｎｅｏ质粒图谱 Ｆｉｇ．Ｉ Ｐ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ ４．Ｉ－ＣＭＶ ｎｅｏ ｖｅｃｔｏｒ ｍａｐ
ｓｅｎｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌ ｔｇ ｎｔ）ｌｏｏｐ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ｛２１ ｎｔ】
图２退火处理的ｓｉＲＮＡ模板插入片段
Ｆｉｇ．２ Ａｎｎｅａｌｅｄ ｓｉＲＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｉｎｓｅｒｔ Ｈ；ｎｄ ｌｌＩ Ａ一３。
ＴＴＣ６＾一５
PPARγ基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效果鉴定
江苏预防医学 2021
年 5
月第 32
卷第 3
期 Jiangsu J Prev Med
，May
，2021,Vol. 32
，No. 3• 255 •
PPAM基因shRNA真核表达载体的
构建及其干扰效果鉴定
辛婧、沈亚非、邓飞\谢亚争、张日华2,刘云2
1.漯河市中心医院内分泌科，河南漯河462000;2•南京医科大学第一附属医院老年医学内分泌科
摘要：目的构建过氧化物酶体增殖物激活受体y
(PPARy
)基因RNA
干扰的真核表达载体，转染小鼠3T
3-L
1前体脂肪
细胞，并鉴定其干扰效果。方法选择设计2条针对小鼠PPARy
基因的干扰耙序列，构建真核表达载体PLKO
. 1-PPARy
-
GFP
-shRNAl
/2,以PCR
鉴定并进行序列分析。证实质粒构建成功后，转染小鼠3T
3-U
前体脂肪细胞，荧光显微镜下观察
绿色荧光蛋白（eGFP
)的表达，计算转染效率;采用实时定量PCR
法和Western
印迹检测载体对PPARy
基因的表达干扰效
果;采用油红染色观察PPARy
在脂肪细胞分化过程中对脂滴形成的作用。结果成功构建PPARy
干扰质粒PLKO
. 1-
PPARy
-GFP
-shRNAl
/2，PCR
和DNA
测序证实序列与设计完全一致;荧光显微镜下观察到3T
3-L
1细胞绿色荧光蛋白的表
达,证实重组质粒成功转人细胞，转染效率(92. 67士 1.53)%;实时荧光定量PCR
和Western
Blot
印记试验均显示PLKO
. 1-
PPARy
-GFP
-shRNAl
/2转染的3T
3-L
1细胞PPARy
基因分别被特异性抑制；耙点1干扰效率[(78. 2士2.1)%]高于耙点2
[(55.8±4.3)%],差异有统计学意义（PC
0.05),靶点1初步鉴定为有效靶点。油红染色显示PLKO
. 1-PPARy
-GFP
-shR
-
NA
1/2转染均可抑制3T
3-L
1脂肪细胞分化和脂滴聚集。结论成功构建了耙向干扰PPARy
基因的shRNA
禽呼肠孤病毒σ3蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定
禽呼肠孤病毒σ3蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定
谢志勤;谢芝勋;刘加波;庞耀珊;邓显文;谢丽基;范晴
【摘 要】The specific monoclonal antibody was made using expression
protein CT3 from purified competent cell and the Characteristics was
detected. The ARV σ3 genome was amplified by RT-PCR. Then the PCR
product was li-gated with the express vector PGEX-4T-1 and transferred
into E. coli. The concentration was test by protein testing Kit after
purification the protein σ3.This protein could use for ELISA test and
immunization. BALB /c mice were regularly immunized with purified
protein CT3 contain 100 μg. After injecting four times, the spleen cells
were collected and infused with myeloma cell sp2/0 follow ratio 5:1. After
selection in time and 3 times clone by limiting dilution. The monoclonal
antibody was detected by indirect ELISA, dot-ELISA, immunofluorescence
一株新型鸭呼肠孤病毒山东分离株的分离鉴定与遗传进化分析
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报
摘 要：为了确诊一起疑似由新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）引起感染的雏鸭的临床病例，本研究对山东某养殖场送检的病患雏鸭进行剖检、PCR鉴定、病毒分离鉴定以及对分离株的S1基因序列进行比对分析。鉴定结果显示：剖检后发现病鸭脾脏肿大、出血、坏死等为主要临床症状。PCR鉴定为DRV阳性，鸭其他主要病原为PCR阴性；病变组织样品过滤后经尿囊腔接种SPF鸭胚可以致死鸭胚，对扩增的病毒S1基因进行测序和比对发现，该病毒与GenBank中公布的NDRV流行毒株处于同一分支，且Sigma C蛋白氨基酸同源性达到了94.5%-98.7%，将该分离株命名为新型鸭呼肠孤病毒SDHZ分离株。该研究结果为我国NDRV的流行病学监测和防控技术研究提供了基础材料和理论依据。关键词：鸭呼肠孤病毒；分离；S1基因中图分类号：S852.659.4 文献标志码： A 文章编号：1674-6422（2021）05-0019-05
Isolation, Identifi cation and Phylogenetic Analysis of a Novel Duck Reovirus
Isolated from Shandong Province
LI Xuesong1,2, SUN Yue2, SHI Xiaona2, SU Xin2, YAN Dawei2, WANG Siqi2, LIU Jinhua1, LI Zejun2
(1. College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)
禽呼肠孤病毒分离株σ2蛋白基因克隆及序列分析
广西农业科学２０１０，４１（９）：９７７—９８０ Ｇｕａｎｇｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ・９７７・
禽呼肠孤病毒分离株ｏｒ２蛋白基因克隆及序列分析
谢志勤・，谢芝勋 ，邓显文 ，宋 杨 ，温 娟 ，刘加波 ，庞耀珊 ，谢丽基 ，
蓝如束 ，张振荣 ，黄海强
（１广西兽医研究所，南宁５３０００１；２南宁市动物卫生监督所，南宁５３０００１；３南宁市动物疾病预防诊断中心，南宁５３０００１； ４广西疾病预防控制中心，南宁５３００２８；５武宣县动物疾病预防诊断中心，广西武宣５４５９００）
摘要：为了解禽呼肠孤病毒（ＡＲＶ）广西分离株与常用疫苗株在基因水平上的差异，将从广西某鸡场分离获得的２ 株ＡＲＶ（Ｒ１、Ｒ２）分离株的盯２蛋白基因经ＲＴ—ＰＣＲ扩增后，连接ｐＭＤ１８一Ｔ载体并转化大肠杆菌ＤＨ５￣ｘ，重组质粒经ＰＣＲ、 双酶切鉴定及序列分析。结果表明，２株ＡＲＶ分离株的盯２蛋白基因已成功克隆到质粒载体上；经序列分析发现，２株 ＡＲＶ分离株与ＡＲＶ标准株Ｓ１１３３的核苷酸同源性分别高达９９．２％和９９．３％，其推导的氨基酸同源性分别高达９８．１％和 ９８．４％；两分离株间的核苷酸同源性为９９．７％，其推导的氨基酸同源性为９８．５％，具有很高的同源性。 关键词：禽呼肠孤病毒；分离株；盯２蛋白基因；序列分析 中图分类号：￥８５２．６５＋９．４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２—８１６１（２０１０）０９—０９７７—０４
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｒｅ０ＶｌｒＵＳ ｏｆ Ｉ】ｒ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ａｖｉａｎ
ｉｓｏｌａｔｅｓ
ＸＩＥ Ｚｈｉ—ｑｉｎ ，ＸＩＥ Ｚｈｉ—ｘｕｎ ，ＤＥＮＧ Ｘｉａｎ—ｗｅｎ ，ＳＯＮＧ Ｙａｎｇ ，ＷＥＮ Ｊｕａｎ。，ＬＩＵ Ｊｉａ—ｂｏ ，
ＰＡＮＧ Ｙａｏ—ｓｈａｎ ，ＸＩＥ Ｌｉ＿ｊｉ ，ＬＡＮ Ｒｕ－ｓｈｕ ，ＺＨＡＮＧ Ｚｈｅｎ－ｒｏｎｇ ，ＨＵＡＮＧ Ｈａｉ－ｑｉａｎｇ
禽呼肠孤病毒感染SPF鸡后免疫器官中IL-18的定量检测
禽呼肠孤病毒感染SPF鸡后免疫器官中IL-18的定量检测
张昆丽;谢芝勋;黄莉;谢丽基;刘家波;邓显文;谢志勤;范晴;罗思思
【摘 要】[目的]掌握禽呼肠孤病毒(ARV)感染SPF鸡后免疫器官中白细胞介素18(IL-18)的相对动态转录时相,为揭示ARV的致病机制奠定基础.[方法]利用鸡IL-18实时荧光定量PCR检测分析ARV感染对SPF鸡免疫器官中IL-18mRNA动态转录水平的影响.[结果]SPF鸡感染ARV后,免疫器官发育不良,其脾脏、胸腺、法氏囊重量均低于对照组.与对照组相比,除感染后21d的胸腺、法氏囊和35 d的脾脏、胸腺中IL-18表达下调外,其他时间点免疫器官中的IL-18均表达上调,且都在ARV感染后第1d达峰值,上调倍数分别为3.59(脾脏)、7.99(胸腺)和8.35(法氏囊)倍.[结论]ARV感染可导致IL-18转录时相发生变化,推断IL-18与ARV对免疫器官的损伤与免疫抑制相关.
【期刊名称】《南方农业学报》
【年(卷),期】2015(046)001
【总页数】4页(P166-169)
【关键词】禽呼肠孤病毒;SPF鸡;IL-18;转录水平;实时荧光定量PCR
【作 者】张昆丽;谢芝勋;黄莉;谢丽基;刘家波;邓显文;谢志勤;范晴;罗思思
【作者单位】广西大学 动物科学技术学院,南宁 530005;广西兽医研究所/广西畜禽疫苗新技术重点实验室,南宁 530001;广西兽医研究所/广西畜禽疫苗新技术重点实验室,南宁 530001;广西兽医研究所/广西畜禽疫苗新技术重点实验室,南宁
530001;广西兽医研究所/广西畜禽疫苗新技术重点实验室,南宁 530001;广西兽医研究所/广西畜禽疫苗新技术重点实验室,南宁 530001;广西兽医研究所/广西畜禽疫苗新技术重点实验室,南宁 530001;广西兽医研究所/广西畜禽疫苗新技术重点实验室,南宁 530001;广西兽医研究所/广西畜禽疫苗新技术重点实验室,南宁 530001
shRNA抑制禽流感病毒转基因鸡的研究的开题报告
慢病毒载体介导的siRNA/shRNA抑制禽流感病毒转基因鸡的研究的开题报告
一、选题背景
禽流感病毒是一种高度传染性病毒，可以在家禽中引起严重的呼吸道疾病。近年来，由于病毒的变异和演化，禽流感病毒的传染性和致病性不断加强，对家禽养殖业造成极大威胁。因此，开发新的禽流感病毒治疗手段具有重要的意义。
RNA干扰是一种基因沉默技术，可以靶向特定基因的mRNA，进而抑制基因表达，为研究生物过程和治疗疾病提供了有力工具。近年来，siRNA和shRNA由于具有高效、选择性和可靶向等优点被广泛应用于基因沉默研究中。然而，尚未有研究报道利用RNA干扰技术治疗禽流感病毒感染的转基因鸡。
本研究拟利用慢病毒载体介导siRNA/shRNA抑制禽流感病毒转基因鸡的基因表达，探究RNA干扰在禽流感病毒治疗中的应用价值。
二、研究目的
本研究旨在构建慢病毒载体介导的siRNA/shRNA抑制禽流感病毒转基因鸡的实验模型，探究RNA干扰技术在治疗禽流感病毒感染中的应用价值。
三、研究内容和方法
1.构建慢病毒载体
通过PCR扩增禽流感病毒的靶标基因片段，将其克隆到慢病毒载体中，构建载有siRNA/shRNA的慢病毒载体。
2.分离和培养鸡卵巢细胞
从禽流感病毒感染的转基因鸡体内分离鸡卵巢细胞，并进行培养。 3.慢病毒载体转染细胞
将构建好的慢病毒载体转染至鸡卵巢细胞内，使其表达siRNA/shRNA。
4.禽流感病毒感染模型的建立和治疗
将构建好慢病毒载体的细胞分为两组，一组感染禽流感病毒，另一组不感染。观察siRNA/shRNA对禽流感病毒复制的影响，并评估RNA干扰技术治疗禽流感病毒感染的效果。
四、预期结果和意义
本研究预计构建出慢病毒载体介导的siRNA/shRNA抑制禽流感病毒转基因鸡的实验模型，并探究了RNA干扰技术在治疗禽流感病毒感染中的应用价值。结果可为开发新的禽流感病毒治疗手段提供理论依据和技术支持。
禽呼肠孤病毒变异株的分离鉴定
禽呼肠孤病毒变异株的分离鉴定
赵振芬;徐为燕;杜念兴
【期刊名称】《中国病毒学》
【年(卷),期】1996(000)004
【摘 要】从病鸡肝分离到一株病毒，经电镜检查，理化特性分析，核酸电泳和中和试验等证明它为禽呼肠孤病毒（ＡＲＶ）。该病毒只在鸡胚肝细胞（ＣＥＬｉ）上产生细胞病学（ＣＰＥ）和鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）和Ｖｅｒｏ细胞上不增殖，它对热敏感，Ｍｇ＾２＋不能增强其对热的稳定性，其基因组中的４个小节段的迁移率与ＡＲＶＦＤＯ和Ｓ１１３３株明显不同表明它是不同于ＦＤＯ和Ｓ１１３３的ＡＲＶ变异株。
【总页数】1页(P352)
【作 者】赵振芬;徐为燕;杜念兴
【作者单位】南京农业大学动物医学院;南京农业大学动物医学院
【正文语种】中 文
【中图分类】S852.65
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2.禽呼肠孤病毒强毒株和弱毒疫苗株感染鸡肝癌细胞的转录组学分析 [J], 黄莉;曾婷婷;王盛;张民秀;谢芝勋;谢丽基;黄娇玲;谢志勤;范晴;邓显文;罗思思;张艳芳
3.禽呼肠孤病毒强毒株和弱毒疫苗株感染Vero细胞的蛋白质组学研究 [J], 黄莉;谢芝勋;谢丽基;邓显文;谢志勤;范晴;罗思思;黄娇玲;曾婷婷
4.一株肉鸡呼肠孤病毒变异株的分离鉴定 [J], 于可响;宋敏训;刘存霞;宫晓;路晓;胡峰;郭效珍;马秀丽;李玉峰;黄兵
5.一株新型鸭呼肠孤病毒山东分离株的分离鉴定与遗传进化分析 [J], 李雪松;孙悦;石晓娜;宿鑫;闫大为;王思琪;刘金华;李泽君
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禽呼肠孤病毒σB蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
禽呼肠孤病毒σB蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
陈祥;吴海洋;王永强;李晓齐;曹红;郑世军
【期刊名称】《中国兽医杂志》
【年(卷),期】2015(051)006
【摘 要】为了制备禽呼肠孤病毒(ARV)σB蛋白的单克隆抗体,以实验室保存的融合蛋白His-σB为免疫原免疫BALB/c小鼠,经过融合、筛选、亚克隆后,获得2株能稳定分泌抗σσB蛋白单克隆抗体的特异性杂交瘤细胞株,分别命名为3C3、4H11.经间接ELISA方法测定,2株单抗的亲和力解离常数分别为5.17×10-10和5.04×10-10,均为高亲和力抗体.2株单抗的重链类型分别为IgG2a和IgG2b.间接免疫荧光和Western Blot结果分析表明,该两株单抗均能特异性识别ARV感染DF-1细胞后产生的σB蛋白.以Western blot方法利用单抗检测不同截短的σσB蛋白,初步确定3C3、4H11两株单抗抗原识别表位分别位于101aa～120aa之间和121aa～140aa之间.该单抗为检测ARV及研究ARV σB蛋白的生物学功能奠定了基础.
【总页数】5页(P3-6,113)
【作 者】陈祥;吴海洋;王永强;李晓齐;曹红;郑世军
【作者单位】中国农业大学动物医学院农业生物技术国家重点实验室,北京海淀100193;中国农业大学动物医学院农业生物技术国家重点实验室,北京海淀100193;中国农业大学动物医学院农业生物技术国家重点实验室,北京海淀100193;中国农业大学动物医学院农业生物技术国家重点实验室,北京海淀100193;中国农业大学动物医学院农业生物技术国家重点实验室,北京海淀100193;中国农业大学动物医学院农业生物技术国家重点实验室,北京海淀100193
【正文语种】中 文
【中图分类】S852.65+9.4
【相关文献】
1.禽呼肠孤病毒σ3蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定 [J], 谢志勤;谢芝勋;刘加波;庞耀珊;邓显文;谢丽基;范晴
禽呼肠孤病毒病的研究进展
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毱毱毱●综述与专论●禽呼肠孤病毒病的研究进展
李巨银，胡新岗，魏宁（江苏畜牧兽医职业技术学院，江苏泰州225300）中国图书分类号：S855.3文献标识码：A文章编号：1006—799X（2011）04—0038—03呼肠孤病毒是1954年Ramos和Sbani等先从健康儿童的粪便中分离出来的，1975年国际病毒命名委员会定名为呼肠孤病毒科（Reoviridae）。呼肠孤病毒科是一类无囊膜双股分节段的RNA病毒。包括9个属，其中与兽医学有关的是正呼肠孤病毒属、环状病毒属和轮状病毒属，广泛分布于自然界。禽呼肠孤病毒感染引起了世界各国养禽生产严重的经济损失，2002年波兰学者报道了与吸收障碍综合症有关的鸡肠型呼肠孤病毒、以及以肝脾肾有坏死性病灶为特征的坏死型。本病以5～7周龄肉用鸡多发，肉用鸡的发病率可达100%，死亡率为1%～3%。近年来，随着禽呼肠孤病毒的感染、流行日趋增加和临床疾病形式的不断多样化，防制禽类呼肠孤病毒感染的难度不断增大。为有针对性的防制禽类呼肠孤病毒感染，为我国禽类呼肠孤病毒所致疫病的防治提供理论依据，现将其综述如下。1病原研究1954年，Fahey和Crawley首次从有慢性呼吸道疾病的鸡的呼吸道内分离到禽呼肠孤病毒。1972年，Walker等人通过电镜观察定名为呼肠孤病毒。1976年，hwaitz首次报道了蛋鸡的呼肠孤病毒感染，Fujskai等人在1969年从火鸡分离到几株呼肠孤病毒。1982年，Pgae首次报道了火鸡的呼肠孤病毒感染。据报道新西兰（1987年）、印度（1988年）和波兰（2000年）都分离到高致病性的鸡源呼肠孤病毒。此外，意大利、荷兰、巴西、阿根廷、法国、以色列、英国相继报道了呼肠孤病毒感染。1984年，有人用琼扩法初步证实我国部分地区的鸡场中有本病存在。1985年王锡坤证实了我国也有鸡病毒性关节炎发生。1988年，长春某鸡场发生了与鸡病毒性关节炎相似的鸡病，后确定为病毒性关节炎病毒－禽呼肠孤病毒。同年，江西省某市也爆发了疑似呼肠孤病毒病，初步认为是禽呼肠孤病毒所致的病毒性关节炎。1992年陈士友从患关节炎病鸡肠道内分离到一株禽呼肠孤病毒，定名为NAu－8902。1993年，陈士友等从外观正常的鸡胚中分离到一株AVR病毒株。1996年，南京农业大学赵振芬分离到一株无毒株。禽呼肠孤病毒很容易从禽源细胞培养物中分离。常用的细胞培养是禽原代细胞，包括鸡胚成纤维细胞、肝、肺、肾、巨噬细胞和睾丸细胞。最常用的是雏鸡肾细胞（2～6周龄），用各种方法分离本病毒的比较结果表明，以鸡肝细胞最敏感，其次为鸡肾细胞。感染呼肠孤病毒的鸡源细胞培养物能够形成合胞体，细胞浆内有包涵体。经卵黄囊接种，呼肠孤病毒容易在鸡胚内生长。初次分离，一般在接种后3～5d鸡胚死亡，胚体因皮下出血而呈淡紫色。2病毒特性和结构特点研究禽类呼肠孤病毒为无囊膜，呈球形，双层83甘肃畜牧兽医2011年4（总216）期衣壳和二十面对称的dsRNA病毒。粒子直径约60～80nm，外层衣壳上有92颗中空的颗粒。在CsCI梯度中，感染病毒子的密度为1.29～1.30/mL，无感染性空衣壳为1.29～1.309/mL，病毒芯髓为1.44g/mL。纯化病毒只含有RNA和蛋白质，平均含量分别为18.7%和81.3%。病毒在胞浆内复制，有时呈晶格排列。对热、pH3和DNA代谢抑制物有抵抗力。70%乙醇和0.5%有机碘可灭活病毒。一般无血凝活性。另外它还具有独特的生物学特性：①无血凝活性，能诱导细胞融合和多数毒株对自然宿主具有致病性。②血清学方法证实禽类呼肠孤病毒各毒株之间具有共同的群特异性抗原（与哺乳类RoeV无交叉抗原），但由于存在大量的交叉反应，有些群不能作为独立的血清型，故禽类呼肠孤病毒只能以抗原亚型存在。③通过对禽类呼肠孤病毒各代表株进行SDS一队GE核酸电泳分析，禽类呼肠孤病毒的核酸电泳图谱明显有别于哺乳类呼肠孤病毒株，即使在禽类呼肠孤病毒株之间也存在明显的多态性，但目前尚未发现这种差异与血清型及致病性相关。3流行病学禽类呼肠孤病毒广泛存在于自然界，现已从许多种鸟类发现该病毒。目前认为鸡和火鸡是唯一可引起关节炎或键鞘炎的自然或实验宿主。同时认为不同品系的肉鸡对本病的易感性稍有差别。蛋鸡偶尔也有发生。家兔、仓鼠、大鼠、小鼠、豚鼠、鸽和金丝雀对该病的实验性感染一般不敏感。南非、法国和以色列报道鸭中有一种病毒病，死亡率很高，表现为全身不适并伴有腹泻。患禽，尤其是受感染的幼龄鸡和番鸭，为同舍禽群的潜在传染源。本病的传播可分为水平传播和垂直传播两种，水平的传播主要是由鸡间的直接或间接引起的。垂直传播主要是通过鸡蛋传播。在生殖器官中也己证明有病毒存在，但经卵传播率较低。病毒可在鸡体存活289d以上，并经肠道排出，随粪便污染饲料和饮水。所以，带毒鸡是重要的传染源。许多试验表明，该病毒可从试验的攻毒鸡向非直接接触的对照鸡传播，这可能是由呼吸道排出的病毒通过空气传播所致。本病的潜伏期因感染的途径不同而有所差异，实验接种2周龄鸡表明，足垫接种为1d，肌肉、皮下、静脉、窦内接种为11d，气管接种为9d，接触感染可达13d。经口和呼吸道接种为4d，各器官均可见到病毒，而接种后14～15d则大大减少，25d后除骨盆和键部有局限性病毒外，其他器官均未见到病毒。4诊断方法动物在受到病毒感染后，体内产生抗体，如果能与相应的病毒粒子特异性地结合，使后者丧失感染力，这种抗体就称为中和抗体，中和抗体一般是针对病毒的蛋白衣壳或囊膜抗原的，并不针对病毒粒子的内部成分。应用己知的病毒或病毒抗原，可以测知病畜体内中和抗体的存在及其效价。应用己知的抗病毒血清或中和性单克隆抗体，也可以进行病毒的鉴定，因此中和实验也常用于新分离病毒株的鉴定，中和实验具有高度的敏感性和免疫特异性，常可用于侦察其他血清学反应难以测出的病毒株之间的抗原差异。应用同一病毒的不同型的毒株或者应用不同型的标准血清，即可测知相应抗血清或病毒的型别。进行中和实验，首先要选择实验宿主。中和实验的宿主系统主要有动物、鸡胚、细胞三大类。由于大多数病毒可在组织培养细胞内生长、增殖、并产生细胞病变，而应用组织培养细胞进行中和实验，又远较实验动物和鸡胚方便，结果比较稳定一致，不存在个体差异问题，因此目前主要应用组织培养细胞进行中和实验。近年来应用微量培养板上培养的单层细胞进行微量中和实验，又比一般的试管法简便的多，而且易于判定实验结果，适于进行大量实验。93Vol.41，№4综述与专论鸭疫里默氏杆菌病的防治研究进展
SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT—PCR检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因方法的建立
广西农业科学２０１０，４１（４）：３６６—３７０ Ｇｕａｎｇｘｉ ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒＭ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ检测禽呼肠
孤病毒 Ｃ和５ＮＳ基因方法的建立
熊文婕 ，谢芝勋 ，唐 熠 ，谢丽基 ，刘加波 ，庞耀姗 ，邓显文 ，谢志勤
（１广西大学动物科学技术学院，南宁５３０００５；２广西兽医研究所，南宁５３０００１）
摘要：为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒６ｃ和８ＮＳ基因的ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光定量Ｒ１ ．ＰｃＲ方法，针对８Ｃ、８ＮＳ基 因分别设计了１对特异性引物，同时选择了１对内参基因１３一ａｃｔｉｎ￣ｌ物，将常规ＰＣＲ扩增的片段分别连接到ｐＭＤ１８一Ｔ载 体上构建重组质粒，经筛选、鉴定纯化后，梯度倍比稀释作为标准品，用于构建ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检 测８Ｃ、８ＮＳ基因及内参基因１３一ａｃｔｉｎ的标准曲线。结果表明，建立的标准曲线具有良好的线性关系，Ｒ 均在０．９９以上；最 小检出量为１０拷贝／ｔｘＬ的阳性标准品，且具有良好的重复性，能够校正抽提样品中细胞数量不均带来的差异。可见， ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ方法能满足检测微量样品中禽呼肠孤病毒８Ｃ和８ＮＳ基因表达的要求，具有快速、 敏感性高、重复性好等特点。 关键词：禽呼肠孤病毒；８Ｃ基因；８ＮＳ基因；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ；相对定量 中图分类号：￥８５２．６５０．４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２—８１６１（２０１０）０４—０３６６—０５
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｖｉａｎ ｒｅｏｖｉｒｕｓ ８Ｃ ａｎｄ ８ＮＳ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ
Ｉ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙ
ＸＩＯＮＧ Ｗｅｎ－ｊｉｅ ，ＸＩＥ Ｚｈｉ－ｘｕｎ ，ＴＡＮＧ Ｙｉ ，ＸＩＥ Ｌｉ－ｊｉ ，ＬＩＵ Ｊｉａ－ｂｏ ，ＰＡＮＧ Ｙａｏ－ｓｈａｎ ，