pLKOshRNA病毒质粒载体构建protocol方法详解

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pLKO.1 - TRC Cloning Vector

Addgene Plasmid 10878. Protocol Version 1.0. December 2006.

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Table of Contents

• A. pLKO.1-TRC Cloning Vector

o A.1 The RNAi Consortium

o A.2 Map of pLKO.1

o A.3 Related plasmids

• B. Designing shRNA Oligos for pLKO.1

o B.1 Determine the optimal 21-mer targets in your gene

o B.2 Order oligos compatible with pLKO.1

• C. Cloning shRNA oligos into pLKO.1

o C.1 Recommended materials

o C.2 Annealing oligos

o C.3 Digesting pLKO.1 TRC-Cloning Vector

o C.4 Ligating and transforming into bacteria

• D. Screening for Inserts

o D.1 Recommended materials

o D.2 Screening for inserts Plasmid Cart

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USP22 ShRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建并鉴定USP22基因ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因在鼻咽癌中的作用机制奠定基础。方法针对USP22基因的编码序列设计并合成2条特异性干扰序列，序列两端含有限制性内切酶位点HpaⅠ和XhoⅠ。寡核苷酸链退火生成寡核苷酸双链，5′端磷酸化后将含有酶切位点的寡核苷酸双链克隆到pLL3.7慢病毒表达载体。连接产物经转化、培养，提取其质粒，提取出来的质粒经HpaⅠ和XhoⅠ酶切电泳鉴定，鉴定正确的质粒进行测序。构建成功的慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA與包装载体质粒混匀共转染于293T细胞。通过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）情况，对病毒滴度和感染效率进行检测。结果成功构建慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA。与包装载体质粒共转染293T细胞后测定慢病毒滴度为4×107 TU/ml。结论本实验应用相关技术成功构建USP22 ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。

标签： USP22；慢病毒载体；构建；鉴定

肿瘤细胞中基因表达具有组织特异性，USP22泛素水解酶属去泛素化酶DUB基因家族成员，其普遍表达表明其功能的保守性，因此，USP22被归类为肿瘤干细胞的标记基因而引起高度关注[1]。国内外学者研究发现，USP22基因过表达与结直肠癌[2]、肺癌[3]、胃癌[4]、食管癌[5]、乳腺癌[6]等恶性肿瘤的浸润、转移和预后差高度相关。沉默USP22基因表达，能显著抑制膀胱癌[7]、结直肠癌[8]细胞增殖，由此推测USP22基因可能成为肿瘤治疗的一个新靶点。本研究通过基因工程技术构建USP22 ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因在人鼻咽癌细胞中的作用机制提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂及仪器

pLL3.7慢病毒表达载体及包装载体质粒购自广州永诺生物科技有限公司。T4磷酸化酶、T4连接酶、HpaⅠ酶及XhoⅠ酶均购自NEB（New England BioLabs）公司。琼脂糖购自Biowest公司。高纯质粒小量提取试剂盒和Tran5α感受态细胞购自北京全式金生物公司。质粒大提试剂盒（QIAGEN试剂盒）购自QIAGEN公司。溴化乙锭（EB）及LB培养基购自上海生工生物工程有限公司。293T细胞购自中国科学院上海细胞库。Lipofectamine（脂质体）2000购自Life

质粒提取protocol

QIAGEN large-Construct Kit提取过程：

准备工作：

(1)100mlATP溶液：2.75g无水的ATP-Na2溶解于40ml双蒸水，用10MNaOH(约1ml)调pH至7.5，用双蒸水定容至50ml，分成300μl每小份保存于-20℃。

(2)将RNaseA(220μl)溶液加入Buffer中，每瓶P1加一支RnaseA(用前离心)，终浓度为100ug/ml。

(3)将225μlExonclease Solvent溶液加入ATP-Dependent

Exonclease中，轻轻混匀。放置15min，不要激烈振荡，使其充分溶解。

(4)检查P2中是否有SDS沉淀，如果有则溶解沉淀的SDS。

(5)在4℃下预冷P3。

(6)65℃预热QF Buffer。

提取步骤：

(1)从新制备的平板上挑取单克隆接种于2～10ml含有氯霉素（终浓度为12.5ug/ml）的LB液体培养基中，37℃，300rpm摇床培养大约8h。（培养基的体积不超过培养瓶体积的1/4）

(2)取0.5～1ml菌液接种至500mlLB培养基中，即按1/500或1/1000的比例接种。37℃，300rpm摇床培养12～16h（使细胞密度达到3～4*109/ml）。（培养基的体积不超过培养瓶体积的1/4）

(3)4℃，4000rpm（6000g）离心15min，以收集菌体。此菌体沉淀可存放到-20℃冻存。

(4)用20ml P1 buffer充分悬浮菌体（用P1 buffer前检查是否添加了RNaseA，此步务必要充分悬浮以使菌体裂解充分）（如果没有60ml大小的管子，则可以将重悬后的细菌分到两个50ml的管子中，分别处理完第（5）（6）步在第（7）步后再混合到一起）。

(5)加20ml P2 buffer，轻柔颠倒4～6次，混匀，室温放置5min。此步加入P2buffer后要立即盖上盖子，以防止空气中的CO2与Pbuffer作用，同时放置时间不能超过4min，此时不能剧烈摇晃。

质粒载体的构建

摘要：质粒载体的构建。首先要获得目的DNA。根据其目的基因序列和启动子序列设计引物，为提高目的基因产率，采用两次PCR的方法，即第一次设计引物扩增全序列基因，第二次设计带酶切位点的引物以第一次扩增产物为模板进行扩增，进而加尾连接到T-DNA上，再利用电转化的方法将连接产物转化到带有PCAMBIA1381的DH5α感受态细胞中复制表达。

关键词：质粒 DNA PCR 电泳感受态转化

1. 引言

质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下：

① 是染色质外的双链共价闭合环形DNA（cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。

② 能自主复制，是能独立复制的复制子。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。

③ 质粒对宿主生存并不是必需的。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体。

质粒载体pBR322是研究得最多，是使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。

质粒载体pBR322的大小为4361bp,相对分子质量较小的是它第一个优点。优点之二是它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因，可供转化子的选择标记是它的第三个优点。

克隆载体构建 Protocol

克隆载体构建是一个生物学实验中常用的过程，用于将目的基因插入到特定的DNA序列中，以便在细胞内进行表达和功能研究。以下是克隆载体构建所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。

一、所需试剂和耗材

1. 限制性内切酶：用于识别和切割特定的DNA序列。

DNA连接酶：用于将目的基因与载体DNA连接在一起。

3. 质粒DNA：用作克隆载体的DNA分子，通常使用经过改造的质粒。

4. 目的基因：需要插入克隆载体的DNA片段。

5. T4 DNA连接酶：用于将目的基因与载体DNA连接在一起。

6. 缓冲液：用于维持反应液的pH值和其他辅助因子的浓度。

7. dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）：DNA合成的原材料，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP。

8. 无菌水：用于稀释和配制溶液。

9. 酚/氯仿/异戊醇混合液：用于抽提质粒DNA。

10. 氯仿：用于沉淀和分离DNA。

11. 无水乙醇：用于洗涤和沉淀DNA。

12. 70%乙醇：用于清洗PCR管和其他器具。

二、实验仪器 1. 实验室搅拌器：用于混合和振荡反应液。

2. 离心机：用于离心DNA溶液和其他反应液。

3. 水浴锅：用于保温反应液。

4. 移液器：用于精确添加试剂和溶液。

5. PCR仪：用于扩增目的基因。

6. 电泳仪和电泳槽：用于分析DNA样品。

7. 紫外分光光度计：用于测量DNA浓度。

8. 显微镜：观察细胞和组织样品。

三、准备工作

1. 阅读实验步骤和注意事项，了解所需的试剂和耗材及其使用方法。

准备好所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。

3. 检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。

4. 准备好实验服、口罩、手套等个人防护用品。

5. 用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。

6. 用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等。

7. 设置PCR仪的温度循环程序以及其他相关参数。

载体构建步骤

1. pSIH-H1-Ctl（1818 ng/μL）载体线性化

双酶切反应体系：

10*buffer K 3 μL

EcoRI 1.5 μL

BamHI 1.5 μL

质粒 2 μL（4μg）

H2O 22 μL

TOTAL 30 μL

单酶切反应体系：

10*buffer K 1.5 μL

EcoRI/ BamHI 0.75 μL

质粒 0.5 μL（1μg）

H2O 12.25 μL

TOTAL 15

1%琼脂糖凝胶电泳切胶回收

AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒

2. shRNA退火

shRNA的浓度至50nmol/mL，（加shRNA的nmols数ⅹ20的μL）

5* PrimeSTAR Buffer(Mg2++plus)，Lot A2801A, TakaRa

反应体系：

H2O 18

5* PrimeSTAR Buffer(Mg2++plus) 5μl

Oligos + 1μl

Oligos - 1μl

TOTAL 25μl

反应条件：

95℃ 5min

80℃ 10 min

70℃ 10 min

60℃ 10 min

50℃ 10 min

37℃ 10 in

3．连接反应

H2O 2 μl

pSIH-H1- BamHI/EcoRI 1 μl

退火后的shRNA+/- 5 μl

T4 Buffer 1 μl

T4 酶 1 μl

共 10 μl

16℃连接过夜

4. 转化铺板向连接反应里加入40 μL感受态，冰浴30min，热激42°C 90s，再冰浴5min。

加入200 μl无氨苄的LB培养基，震荡培养1h。

后把液体均匀滴在LB培养皿上，37°C孵箱中过夜。

5. 挑单克隆摇菌

6. 提取质粒酶切验证

体外靶向TP53BP2_基因shRNA_慢病毒载体的构建及功能鉴定

∗基金项目:北京市自然科学基金资助项目(编号:7192084);

首都卫生发展科研专项(编号:2020-2-1152);北京市属医学研究

所公益发展改革试点项目(就医研2021-10)

作者单位:100069北京市首都医科大学附属北京佑安医院北

京肝病研究所

第一作者:霍云飞,男,23岁,硕士研究生。E-mail:yunfeihuo@

共同第一作者:寇卜心,女,32岁,大学本科,检验技师。E-mail:koubuxin@

通讯作者:石英,E-mail:yingshi@·实验性肝炎·

体外靶向TP53BP2基因shRNA慢病毒载体的

构建及功能鉴定∗

霍云飞,寇卜心,柴梦音,豆双双,高明慧,石英,刘晓霓

【摘要】　目的　本研究旨在构建靶向肿瘤蛋白p53结合蛋白2(TP53BP2)基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载

体,以抑制肝癌细胞TP53BP2的表达。方法　设计了2对针对TP53BP2基因的RNA干扰序列,并合成相应的shRNA序

列。shRNA退火形成双链oligo序列后,应用基因重组技术构建重组质粒,经菌落PCR和测序鉴定,将重组正确的质粒进

行慢病毒包装和滴度测定,并采用WesternBlot、qRT-PCR和激光共聚焦技术观察慢病毒Lenti-shTP53BP2对HepG2细胞TP53BP2基因的干扰效果。结果　测序比对结果显示,各重组慢病毒载体与设计参考序列一致,提示各重组慢病毒体构

建成功;重组慢病毒载体经慢病毒包装后,显示pHS-ASR-LW429、pHS-ASR-LW512和pHS-ASR-LW513的滴度分别为9.7×108TU/mL、6.1×108TU/mL和6.4×108TU/mL;用慢病毒Lenti-shTP53BP2(pHS-ASR-LW512和pHS-ASR-LW513)

感染HepG2细胞后,与对照慢病毒(pHS-ASR-LW429)比,经WesternBlot、qRT-PCR和激光共聚焦结果显示两个Lenti-shTP53BP2均能显著下调HepG2细胞TP53BP2基因水平和蛋白表达量。结论　本研究成功构建了靶向TP53BP2基因

慢病毒载体PLKO．1-shHIF-2α的构建及鉴定

刘鹏飞;崔春萍;门同义

【摘要】目的：构建绿色荧光蛋白（GFP）标记的干涉缺氧诱导因子（HIF）-2α表达的慢病毒载体，并对所得产物进行鉴定。方法体外合成的单链HIF-2α干涉片段经过退火后形成的双链片段和以质粒 PCDH为模板扩增出的EF1-EGFP 均与PLKO．1-puro连接，形成重组的慢病毒载体质粒PLKO．1-shHIF-2α，后者与pMD2G，pSAX2共转染293 FT细胞中进行包装，产生重组慢病毒颗粒。用其感染786-0细胞，检测细胞中GFP表达情况。结果成功扩增出干涉HIF-2α片段和EF1-EGFP片段，酶切鉴定及测序均证实PLKO．1-shHIF-2α质粒构建成功。转染293FT细胞产生的重组慢病毒颗粒感染786-0细胞后高表达绿色荧光。结论成功构建了高效的带GFP报告基因并稳定干涉HIF-2α表达的慢病毒载体。

【期刊名称】《山东医药》

【年(卷),期】2014(000)014

【总页数】3页(P32-34)

【关键词】肾细胞癌;缺氧诱导因子-2α;绿色荧光蛋白;RNA干扰

【作者】刘鹏飞;崔春萍;门同义

【作者单位】山东省医学科学院，济南250021; 济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院;军事医学科学院放射与辐射医学研究所;山东省千佛山医院

【正文语种】中文

【中图分类】Q291

近20年来肾细胞癌的发病率和病死率不断升高［1，2］，已经成为男性中第 7、女性中第 8 位的常见癌症。研究证实，缺氧诱导因子(HIF)在肾癌的发生中起重要作用，其作为转录因子参与血管生成、肿瘤细胞的增殖、细胞的迁移等过程［3］。HIF由一个α 亚基(HIF-1α、HIF-2α 和 HIF-3α)和一个 β 亚基组成。β亚基作为结构单位稳定存在，而α亚基作为功能单位很不稳定，只有在低氧环境中存在;最近的研究表明HIF-2α在肾细胞癌的致癌中起重要作用。为研究HIF-2α表达对下游靶基因、细胞生物学特征和致癌能力的影响，我们构建了带绿色荧光蛋白(GFP)并稳定干涉 HIF-2α的 PLKO.1-shHIF-2α的慢病毒载体，并对所得产物进行了鉴定。现报告如下。

载体构建操作流程

一、载体准备

1、质粒准备

电泳检测载体质量

好的质粒为三条带，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）；也有观点认为是质粒两条链没有断裂的超螺旋结构，开环DNA和线性DNA。超螺旋结构应至少占到90%。

测定质粒浓度

用核酸定量仪测定质粒的浓度，A230、A260和A280值。

2、质粒双酶切

根据需要的酶切位点，选择对应的酶，查找适合的Buffer，进行单酶切。

以TaKaRa的限制酶为例，双酶切的体系如下：

试剂体积

质粒<1 μg

Enzyme I 1μL

Enzyme II 1μL

10×X Buffer 2μL

灭菌水to 20μL

总体积20μL

将上述体系置于37℃（不同酶可能存在差异）水浴锅中酶切。

根据酶切效率不同确定酶切时间，可以去除2 μl进行电泳检测。

3、回收质粒

凝胶回收

参照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒说明书。

1)称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1μl进行计向胶

块中加入胶块融化液Buffer GM，我们一般用1%的琼脂糖凝胶电泳，所以一般加入3个凝胶体积量。

2)均匀混合后室温15-25℃融化胶块。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化

（约5～10分钟）。

3)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。将上述操作的溶液转

移至Spin Column 中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。

4)将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000

rpm离心30秒钟，

弃滤液。

5)重复操作步骤。

6)将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm离心1分钟。