固定化脂肪酶载体的筛选
农业基础科学现代农业科技2012年第5期脂肪酶（lipase）是一类特殊的酰基水解酶和重要的工业酶制剂品种，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，且在异相体系中具有催化活性，广泛应用于生物柴油的制备、手性化合物的拆分、油脂改性等方面的研究[1-3]。但由于脂肪酶的造价昂贵，对环境耐受力低，稳定性较差，且游离酶不易于回收、难以重复回收利用，使脂肪酶在工业化生产中深受其限[4]。为此，通过固定化技术和蛋白质工程来大幅提高脂肪酶的综合催化性能已成为当今研究热点。高阳等[5]以不同大孔树脂吸附法固定化假死酵母99-125脂肪酶，在微水有机相中的应用表明，非极性树脂NKA是最佳的固定载体。王冰等[6]以沙蒿—壳聚糖复合磁性微球为载体，采用物理吸附法固定脂肪酶，对影响酶活力的各种因素进行了分析研究。杨本宏等[7]研究了海藻酸钠法制备固定化德氏根霉脂肪酶的条件。但许多固定方法在单独使用和催化生成不同产物时都存在缺点。如：吸附法中酶与载体之间的作用力弱，对外界环境要求严格，且吸附存在非特意性易引入杂质；包埋固定化酶易流失，不利于保存，且对短链醇的有机耐受性差；共价交联过程较复杂，化学试剂的使用使酶在处理过程中容易失活等[8]。本研究通过对不同固定化材料进行比对分析，选择针对生产生物柴油所需的固定化脂肪酶进行研究，为今后的研究提供参考。1材料与方法1.1供试材料1.1.1供试药剂。海藻酸钠：国药集团化学试剂有限公司；壳聚糖：脱乙酰远远大于90.0%，国药集团化学试剂有限公司；大孔树脂：P3520，天津南开大学化工厂；硅藻土：国药集团化学试剂有限公司；脂肪酶：阿拉丁试剂公司，10万U/g；三丁酸甘油脂：阿拉丁试剂公司。1.1.2主要仪器。电子天平：德国赛多利斯股份公司；恒温磁力搅拌器：金坛市富华仪器有限公司；PB-10数字酸度计；多用途台式恒温振荡器：DDHZ-300。1.2试验方法1.2.1脂肪酶的海藻酸钠固定。准确称取1.0g海藻酸钠加入蒸馏水90mL，加热溶解后制备成海藻酸钠溶液，冷却至30℃。将酶液10mL加入到海藻酸钠溶液混匀。用注射器抽取混合液10mL，缓慢推动注射器将混合液从针头滴到4%（w/v）CaCl2溶液中，制得直径为2~3nm的球形颗粒。制得的颗粒继续在CaCl2溶液中浸泡30min，以形成稳定结构。定性滤纸过滤获得球状颗粒的固定化酶，用蒸馏水洗2次。1.2.2脂肪酶的壳聚糖微球固定化。称取壳聚糖1.0g溶于2%的乙酸溶液，制得2.5%的壳聚糖酸性溶胶。边搅拌边将上述溶胶缓慢加入到80mL液体石蜡和5mLSpan-80的混合液中，搅拌20min，使溶胶液均匀分散。加入25%戊二醛溶液1.0mL，搅拌10min后，用1moL/L的NaOH溶液将其pH值调至9~10，于70℃水浴保温3h。放置冷却后，弃去上层油层，再依次用石油醚、丙酮、无水乙醇浸洗，60℃真空干燥得到壳聚糖微球。在pH值为7.5的磷酸盐缓冲液中加入一定量的酶，与壳聚糖微球0.2g在室温搅拌3h。加入戊二醛至浓度为2%，充分交联8h。用去离子水冲洗3遍，过滤，干燥即得固定化酶。1.2.3脂肪酶的大孔树脂固定化。将大孔树脂用去离子水浸泡涨润，去杂，后用4%NaOH和4%HCl交替在磁力搅拌器下搅拌浸泡2h，并分别用去离子水冲洗至中性，最后用2倍体积以上去离子水浸泡于4℃冰箱中保存备用。称取1.0g经预处理在真空抽滤后的树脂（湿基）于50mL三角烧瓶中，加入含有一定量酶的缓冲液5mL控制温度恒定，转速110r/min，在恒温振荡器中吸附固定。加入稍过量戊二醛，充分交联8h。用去离子水冲洗3遍。固定完成后，移取一定量的上清液，测定酶的吸附率。抽滤用5℃的去离子水洗涤得到固定化酶。1.2.4脂肪酶的硅藻土固定化。将载体用去离子水浸泡去杂，烘干后充分研磨备用。用5%HCl浸泡载体2h，然后用去离子水冲洗至中性。用5%NaOH浸泡载体2h，然后用去离子水冲洗至中性。称取1.0g经预处理在真空抽滤后的载固定化脂肪酶载体的筛选研究李明廓陈光*王刚（吉林农业大学，吉林长春130118）摘要针对不同固定化载体，进行了适合生物柴油生产的脂肪酶固定化载体筛选试验。结果表明，以壳聚糖微球的固定率和甲醇耐受力相对较好，其最适给酶量为30mg，固定化时间为8.0h，pH值为7.0，固定化温度为40℃。关键词脂肪酶；固定化；载体；筛选；酶活力；影响中图分类号Q814.2文献标识码A文章编号1007-5739（2012）05-0024-03ScreeningResearchofEnzymeImmobilizationCarrierLIMing-kuoCHENGuang*WANGGang（JilinAgriculturalUniversity，ChangchunJilin130118）AbstractInordertoexploredthesuitableimmobilizationoflipase（LPS）processedbybiodieselfuel，4kindsofcarriesforlipasewerecomparedinthispaper.Resultsshowedthattheattachmentrateandmethanoltoleranceofchitosanmicrosphereswasthebestoptimumenzymeamount，immobilizedtime，pHvalue，immobilizedtemperaturewere30mg，8.0h，7.0，40℃，respectively.Keywordslipase；immobilization；carrier；screening；enzymeactivity；effect
作者简介李明廓（1986-），男，吉林吉林人，在读硕士。研究方向：生物反应器开发与酶工程。*通讯作者收稿日期2011-12-3124体于50mL三角瓶中，加入含有一定量酶的缓冲液5.0mL控制温度恒定，转速110r/min，在恒温振荡器中吸附固定。加入稍过量戊二醛，充分交联8h。用去离子水冲洗3遍。固定完成后移取一定量的上清液，测定酶的吸附率。抽滤用5℃的去离子水洗涤得到固定化酶。1.3检测及计算方法1.3.1脂肪酶酶活力计算。将1.0mL三丁酸甘油酯与3.0mL甘氨酸—氢氧化钠缓冲液（pH值9.4）加入50mL具塞三角瓶中，在140r/min、35℃恒温摇床中振荡乳化15min。然后取出并加入酶制剂5μL，再置于140r/min、35℃摇床反应10min后取出并立即加入95%乙醇10mL终止反应。以1%酚酞为指示剂，利用0.1moL/L氢氧化钠溶液滴定至粉红色，记录溶液消耗体积V1。空白试验中重复上述步骤但不加酶制剂，记录氢氧化钠溶液消耗体积V0。定义每1min催化三丁酸甘油脂水解产生1μmoL丁酸所需要的酶量为1个酶活单位（LU，LipaseUnit），酶活计算公式为：酶活（LU/mL）=V1-V05×10×0.1×10-61.3.2脂肪酶固定率计算。脂肪酶固定率计算公式为：K=U2U1×100%式中，U1为1.0mL酶液的酶活；U2为相当于1.0mL酶液的固定化酶的酶活；固定化酶比活力（U/g）定义为固定化酶酶活力/固定化酶质量。2结果与分析2.1利于生产生物柴油的固定化载体筛选2.1.1不同固定材料固定脂肪酶的效率分析。取相同质量的不同载体与等量的脂肪酶进行反应，在一定时间内对其固定率进行比较（图1）。从图1可以看出，利用海藻酸钠包埋法固定脂肪酶的固定率高于其他几种材料。其随时间增大固定率逐渐降低是由于随着固定时间的增加反应生成的海藻酸钙不断积累，导致酶与底物结合，产物流出逐渐困难，使得固定化酶在单位时间内的酶活降低。因此，固定率呈逐渐降低趋势，并在6h趋于平稳。而其他3种固定材料的固定率在6h后趋于平稳和小幅回调，说明一定时间后载体的的结合位点达到饱和，而酶与酶之间的聚集也造成了一定的空间阻位，因此出现小幅回调现象。2.1.2甲醇对固定化酶的酶活力影响。比较不同载体的固定化酶和游离酶对甲醇的耐受性，分别隔1、8、24h取样测定残余酶活。从表1可以看出，固定化酶在50%的甲醇处理中，在24h时仍能保持60%以上的酶活力，而在90%的甲醇处理中仍能保持酶活不失。充分说明了固定化修饰对脂肪酶对甲醇的耐受性有着积极的影响，其中以壳聚糖微球固定化脂肪酶尤为突出。从图1和表1还可以看出，因为生物柴油的生产中有大量的短链醇存在，所以选择固定率和甲醇耐受力相对较好的壳聚糖微球为载体进行脂肪酶固定化的研究。2.2固定化条件对酶活力的影响2.2.1给酶量对脂肪酶固定化的影响。考察了不同给酶量下，脂肪酶的固定化效果。从图2可以看出，固定化酶活力随着给酶量的增加逐渐增加，在30mg时达到最高，而后逐渐减少。造成这种原因可能是载体表面的结合位点随着给酶量的增加逐步达到饱和，而后由于酶量的继续增加，但结合位点不变；大量的酶造成了聚集重叠，降低了部分酶与底物的结合机会，导致产物扩散困难，因而影响了酶的利用率。2.2.2pH值对脂肪酶固定化的影响。考察了不同pH值下，pH值对脂肪酶固定化的影响。从图3可以看出，随着pH值增加，固定化酶活力逐步增大，在pH值为7.0附近达到最大，随着pH值的逐步增加，固定化酶活力逐步降低。由此可知，pH值为7.0即为脂肪酶固定化的较适pH值。2.2.3温度对脂肪酶固定化的影响。考察了不同温度下，温度对脂肪酶固定化的影响。从图4可以看出，固定化温度对酶固定化的活力有显著影响。低温时分子运动速度慢，从而影响了酶与载体的结合效率。随着温度的升高，固定化酶活力呈现先升后降的趋势，在温度达到40℃时，固定化酶活力达到最高，后随温度升高活力逐步降低。因此，本试验的最适反应温度为40℃。2.3固定化脂肪酶固定强度分析取0.2g的固定化酶放入50mL具塞三角瓶中，并在三10020304050607080固定率∥%2648海藻酸钠固定大孔树脂固定壳聚糖固定硅藻土固定固定化时间∥h图1不同材料固定脂肪酶的效率比较材料残余酶活∥%1h8h24h50%甲醇90%甲醇50%甲醇90%甲醇50%甲醇90%甲醇游离酶810770630海藻酸钠8854750690壳聚糖1006893318417大孔树脂974785217712硅藻土965079237110表1不同浓度甲醇对固定化酶的酶活力影响
6004008001000120014001600酶活力∥U/mg30402010给酶量∥mg图2给酶量对脂肪酶固定化的影响李明廓等：固定化脂肪酶载体的筛选研究25农业基础科学现代农业科技2012年第5期1000800120014001600酶活力∥U/mg7.58.07.06.56.0pH值图3pH值对脂肪酶固定化的影响
∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥（上接第23页）污染物能吸收和散射太阳辐射，削弱了到达地面的太阳辐射，尤其是早、晚太阳高度角较小时，削弱现象更加严重。4结论通过分析1960—2010年凤翔县气候资料发现，凤翔县日照时数的变化呈下降趋势，其气候倾向率为-46.8h/10年。1966年日照时数最多，为2386.4h；1989年日照时数最少，仅为1709.2h，相差677.2h。日照时数的年代际变化表现为20世纪80年代以前正距平居多，日照时数偏多，80年代以后多为负距平，日照时数持续偏少。其中80年代和21世纪以来日照时数最少。各季日照时数除春季增多外，夏季、秋季和冬季呈减少趋势，尤以夏季减少最强烈，秋季减少最不明显。各季的变化情况也不尽相同，存在着明显的季节差异。影响凤翔日照时数的主要气象因素是云量和降水日数，但从分析看日照时数的年变化却与总（低）云量和降水日数关系不大。雾日对日照时数的影响只在秋冬季，且影响较小。由此说明，凤翔日照时数减少与气象因素关系不大，可能与空气污染有一定关系。5参考文献[1]赵国令，朱琳，李星敏，等.陕西气候[M].西安：陕西科学技术出版社，2009.[2]张淑敏.铜川日照时数变化特征及影响因素分析[J].陕西气象，2010（2）：35-37.[3]阿布都克日木·阿巴司.喀什市1952—2006年日照时数时间变化特征[J].沙漠与绿洲气象，2008（3）：22-24.[4]陈碧辉，张平，郝克俊，等.近50年成都市日照时数变化规律[J].气象科技，2008（6）：760-763.[5]任泉，蔡新婷，马文惠，等.达坂城1959—2008年日照变化特征分析[J].沙漠与绿洲气象，2010（6）：38-41.角瓶中加入蒸馏水20mL，放入恒温振荡器中，以140r/min的转速进行洗脱试验。并分别在不同时间段取样计算固定化酶酶活损失率，计算公式为：损失率（%）=脱落酶酶活/原固定化酶酶活×100从图5可以看出，随着洗脱时间的增加，固定化酶的损失率逐步升高，在8.0h后稳定在30%左右，说明固定并不牢靠的脂肪酶已基本脱落完毕，固定化脂肪酶得率稳定，且可以承受生物柴油制备过程中所产生的剪切力。3结论与讨论脂肪酶的应用是当今生物工程领域研究的热点之一[9-11]。本试验对4种酶固定材料进行了固定率和对甲醇的耐受性的分析比较。发现利用壳聚糖微球固定脂肪酶可以使酶对甲醇的耐受性大大提高，对通过脂合成反应生产生物柴油的研究将会有着积极的影响[12-14]。并确定了其最适的给酶量为30mg、固定化时间为8.0h、pH值为7.0，固定化温度为40℃，确定了固定化的机械强度。4参考文献[1]HSUAF，KERBYJ，THOMASAF，etal.Optimizationofalkylesterpro-ductiomfromgreaseusingaphyllosilicatesol-gelimmobilizedlipase[J].BiotechnologyLetters，2003（25）：1713-1716.[2]严祥辉，薛屏，卢冠忠.非水相中固定化脂肪酶的催化特性及其在手性化合物拆分合成中的应用[J].分子催化，2006，16（4）：54-57.[3]SHIMADAY，SAKAIN，SUGIHARAA，etal.Purificationofγ-Linolenicacidfromborageoilbyatwo-stepenzymaticmethod[J].JoumalofAmericanOliChemists，Society，1997（11）：1465-1469.[4]曾淑华，杨江科，徐莉，等.脂肪酶固定化及其稳定性研究[J].生物技术，2006，16（4）：86-96.[5]高阳，谭天伟，聂开立，等.打孔树脂固定化脂肪酶及在微水相中催化合成生物柴油的研究[J].生物工程学报，2006，22（1）：114-118.[6]王冰，王云普，曾家豫，等.沙蒿胶磁性微球固定化酶及部分梨花性质的研究[J].食品工业科技，2008，29（1）：143-145.[7]杨本宏，蔡敬民，吴克，等.海藻酸钠固定化根霉脂肪酶的制备及其性质[J].中国生物学文摘，2007，21（5）：6.[8]彭立凤，谭天伟.壳聚糖涂层法固定化脂肪酶的研究[J].食品工业科技，1999，20（4）：4-5.[9]李正强，陶艳春，沈家骢，等.脂肪酶机构与功能关系的FT-IR研究[J].光散射学报，2000，11（4）：338-341.[10]郭诤，张根旺.脂肪酶的结构特征和化学修饰[J].中国油脂，2003，28（7）：5-10.[11]王章存，魏翠平，王瑛瑶，等.脂肪酶固定化研究及应用初探[J].食品工业科技，2010，31（5）：174-177.[12]赵丽芳.脂肪酶的固定化及其催化性能的研究[D].长春：吉林大学，2008.[13]刘艳雅，黄平，胡长浩，等.脂肪酶的固定化及其在生物柴油中的应用[J].福建畜牧兽医，2009，31（5）：30-32.[14]向红霞，罗琳，敖晓奎，等.改性硅藻土与细菌复合体对Mn（Ⅱ）的吸附特性及动力学研究[J].非金属矿，2008，31（1）：15-18.1100100012001300140015001600酶活力∥U/mg40453530温度∥℃图4温度对脂肪酶固定化的影响100203040壳聚糖固定损失率∥%16.024.08.00.5洗脱时间∥h图5固定化脂肪酶机械固定强度分析26
脂肪酶
脂肪酶的性质
微生物脂肪酶( EC 3. 1. 1. 3) ,又称三酰基甘油酰基水解酶,是指分解或合成高级脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酸酯酯键的酶。
脂肪酶(Lipase EC3 1．1．3)又叫甘油酯水解酶，催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油二酯或甘油一酯或甘油， 过程表示如下
脂肪酶
甘油三酯+水
甘油二酯+游离脂肪酶脂肪酸； 甘油一酯+游离脂肪酸
脂肪酶甘油+游离脂肪酸
脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，只作用于异相系统， 即只在油水界面上作用， 而且只有当底物以微粒、小聚合分散状态或呈乳化颗粒时， 脂肪酶对底物水解才有显著的催化作用。
脂肪酶的最佳作用条件与酶的来源关系很大。微生物脂肪酶的最遣 用条件为pH7.0 温度37℃， 可被钙离子、低浓度胆盐激话。而动物性脂肪酶的最佳条件是pH9．0， 温度37+C， 可被油酸钙、白朊和胆盐激活。
T pH 激活剂
微生物脂肪酶 37℃ 7.0 Ca2+、低浓度胆盐
动物性脂肪酶 37℃ 9.0 油酸钙、白朊和胆盐
原理 优点
缺点
酸碱滴定法
NaOH和脂肪酶催化脂肪水解生成的脂肪酸发生中和反应，根据碱的消耗量来推算酸的生成量，得出酶的活力单位
pH缓冲液和脂肪酸之间存在着矛盾，底物需乳化，测量数据不稳定，耗碱体积小及指示剂终点变色不明显也会造成该滴定方法不准确、不灵敏
铜皂显色法 脂肪酶催化脂肪水解生成的脂肪酸与Cu2+形成铜皂，经苯萃取后，铜皂进一步与显色剂DPC（1,5-二苯基卡巴腙）结合，形成红色溶液，在一定的范围内，显色程度和脂肪酸含量呈良好的线性关系，铜皂在715nm附近有一定的吸收峰 可以弥补酸碱滴定法的不足，采用异辛烷溶液形成微乳环境，可以避免底物乳化液难配制、不稳定等缺点，避免了酸碱滴定中pH缓冲液体系的问题，提高了酶活测定的准确性 使用大量的苯进行铜皂的萃取，容易造成污染和对人体的伤害
对硝基苯酯法 在一定条件下，脂肪酶催化对硝基苯某酸酯的水解生成有色产物-对硝基苯酚，用分光光度计在一定波长下检测OD值，从而计算出脂肪酶的活力 也可以避免酸碱中和滴定的不足 底物比较昂贵
脂肪酶的大孔树脂固定化工艺条件研究
第３期（总第２０２期） 农产品加工‘学刊 ２０１０年３月 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｅｒｉｏｄｉｃａｌ ｏｆ Ｆａｒｍ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｎｏ．３ Ｍ
文章编号：１６７１—９６４６（２０１０）０３—００２３—０５
脂肪酶的大孑Ｌ树脂固定化工艺条件研究
曹立强， 邓 红，韩瑞，张琳
（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安７１００６２）
摘要：以大孑Ｌ树脂为载体，采用正交试验，探讨了脂肪酶的固定化条件。分别考察了５种不同载体固定脂肪酶的蛋白 吸附率的大小，从而确定最佳载体；同时研究了固定化时间、温度、ｐＨ值和酶液用量对固定化酶酶活回收率的影响。 结果表明，ＮＫＡ一９的固定化率最高，为脂肪酶固定化的最佳载体；固定化最佳工艺条件为：温度３３℃，固定化时间 ２ ｈ，酶液质量浓度为０．０４ ｇ／ｍＬ，ｐＨ值为７．８。在此条件下获得的固定化脂肪酶，其酶活回收率平均达９６．６６％。 关键词：脂肪酶；大孑Ｌ树脂；固定化 中图分类号：Ｑ８１４．２ 文献标志码：Ａ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊｉｓｓｎ．１６７１—９６４６（Ｘ）．２０１０．０３．００７
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｌｉｐａｓｅ ｗｉｔｈ Ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ Ｒｅｓｉｎ
Ｃａｏ Ｌｉｑｉａｎｇ，＂Ｄｅｎｇ Ｈｏｎｇ，Ｈａｎ Ｒｕｉ，Ｚｈａｎｇ Ｌｉｎ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｈａａｎｘｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ，Ｓｈａａｎｘｉ ７１００６２，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ，ｔｈｅ ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｒｅｓｉｎ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｓｕｐｐｏ￣，ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｌｉｐａｓｅ ｗａｓ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｔｈｅ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｎ ｆｉｖｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｒｅｓｉｎ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｓｕｐｐｏ￣ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．ｔｈｅ ｄｏｓａｇｅ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ ｌｉｐａｓｅ ａｎｄ ｐＨ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅ ｗｅｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＮＫＡ－９ ｗａｓ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｓｕｐｐｏｒｔ ｏｆ ｌｉｐａｓｅ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｌｉｐａｓｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ３３℃． ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｔｉｍｅ ２ ｈ，ｌｉｑｕｉｄ ｌｉｐａｓｅ １／２５（ｇ／ｍＬ），ｐＨ ７．８．Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅ ｗａｓ ｇｅｔ ｔｏ ９６．６６％ｉｎ
固定化脂肪酶的制备和表征
- 1 - 固定化脂肪酶的制备和表征
脂肪酶是一种被广泛应用的酶类，它们在食品、农业、医药和化学等领域都有重要的作用。近年来，随着一些科技和工程手段的运用，人们将脂肪酶固定化，使其拥有更大的稳定性，从而更早地应用到生产上来。为了更好地认识固定化脂肪酶，本文将重点介绍固定化脂肪酶的制备及其表征。
一、固定化脂肪酶的制备
1.固定化的原理
酶固定化是通过将可以使酶与氧化物或固定化剂结合的一种物质与酶相互作用，使其在固定的介质中的反应性增强的技术。据研究表明，与悬浮液酶相比，固定化酶能够节约酶的成本，减少产品的污染，提高酶的反应速率，从而提高酶活性。
2.定化脂肪酶的制备方法
（1）酰胺化固定
磷酸乙酰胺固定是一种通用的固定化方法，它通过酰胺与脂肪酶中的氨基结合，使酶与磷酸乙酰胺水解物紧紧结合。这种方法的优点在于，固定化效率高，耐受性强。
（2）小分子缩合固定
小分子缩合固定是一种呼吸酶和脂肪酶的有效固定化方法，它能够有效通过小分子与脂肪酶有机分子结合，使其与固定化剂结合，从而达到固定的效果。
（3）共价结合固定 - 2 - 共价结合法是一种常用的固定化方法，它是将能够与脂肪酶中的氨基发生酰胺缩合反应的有机配体与酶结合，使其与固定化剂紧紧结合。
二、固定化脂肪酶的表征
1.貌表征
脂肪酶固定化后可以进行形貌表征，以检测固定化剂的表面形态，确定固定化脂肪酶的形态，以及各类表面层的厚度等。
2.性表征
脂肪酶固定化后可以进行电性表征，以确定固定化剂的电性是否符合固定脂肪酶的要求。
3.学表征
力学表征主要是测试脂肪酶固定化后的表面性能，确定表面的弹性模量、粘度等，以检测固定化后脂肪酶表面是否具有良好的物理性能。
4.学表征
化学表征涉及测试固定化脂肪酶中各类有机物的含量，以确定固定化脂肪酶是否符合实际应用条件。
高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶的研究
２０１２年４月 第２７卷第４期 中国粮油学报 Ｊｏｕｍａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｅｒｅａｌｓ ａｎｄ Ｏｉｌｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｖ０１．２７．Ｎｏ．４ Ａｐｒ．２０１２
高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶的研究
刘 晶 王 雪 张佳宁 李 越 王校红 于殿宇
（东北农业大学食品学院 ，哈尔滨１５００３０） （黑龙江省粮食科研所 ，哈尔滨１５００３０）
摘 要 研究了以醋酸纤维素／聚丙烯复合膜为载体的高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶的固定化条件，采 用响应面分析法对固定化条件进一步优化，并对固定化酶膜的酶学性质进行了讨论。结果表明，以固定化酶
活力为指标，当高碘酸钠浓度为Ｏ．１５ ｍｏｌ／Ｌ，活化为６０ ｍｉｎ时，浓度为０．０１３ ｇ／ｍＬ的酶液与ｐＨ ８．０的磷酸盐
缓冲溶液于戊二醛质量分数０．２４％，温度４℃下，进行交联反应，反应３．１ ｈ后，获得的固定化酶活最高，为 ０．５２ Ｕ／ｃｍ 。固定化酶膜的酶学性质为：固定化酶最适温度３５℃，最适ｐＨ为９．０。
关键词 高碘酸钠 醋酸纤维素／聚丙烯复合膜脂肪酶 固定化 中图分类号：ＴＳ２２９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００３—０１７４（２０１２）０４—００６８—０６
脂肪酶是一种广泛分布于动物、植物和微生物中
的酶，能够进行可逆的甘油酯键水解或合成。在一定 的条件下，脂肪酶可以主要催化合成反应，即可以用来
合成生物柴油。无论在小规模的实验还是工业规模的 酯合成中，作为催化剂，脂肪酶已经得到成功应 用 ］。固定化酶技术，就是将酶结合在载体上，或将
其限制在有限空间内的一类技术，酶仍能进行相应催 化活性，并方便回收利用 Ｊ。一般将酶的固定化技术
分为酶与载体的结合和包埋两大类。其中结合法包括 物理吸附、离子吸附、共价键结合及交联法等 Ｊ。
固定化方法是否成功很大方面取决于选择合适 的载体。固定化载体的选择主要考虑是否拥有固定
化所需的最佳性能，如机械强度、稳定性、亲水疏水 性、孔隙度、反应性、再生性及经济性等方面¨…。常 用的载体主要有微晶纤维素、硅藻土、硅胶等。而以
脂肪酶酶解奶油制备天然香原料
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香精香料被广泛用于食品添加剂、化妆品、饲料等方面, 其需求量也逐年呈大幅度增加趋势。根据BBC Research公司发布的全球香精香料市场报告预测，2011年将达78亿美元。世界各国所用的香精香料也有差距,美国的食用香料种类约为2000余种，欧盟的食用香料大约有3000余种，中国批准使用的食用香料大约有1500多种。随着人们生活质量的提高，消费者要求天然香料的愿望日益增加，并希望获得品质和性能更好的香料产品。
奶味香精是食品工业中应用最广泛的香精之一，酶解乳脂是食品工业中重要的一种原料，目前应用广泛且具有很大的应用潜力，如作为添加剂应用于焙烤食品(面包、蛋糕、曲奇等)、谷物食品(薄饼)、糖果(巧克力产品、太妃糖)、乳制品(咖啡伴侣、糖霜、干酪、黄油)以及其他一些产品(调味品和点心)、乳制品（发酵酸奶、调味奶）等。
1 天然香料
根据美国联邦法典规定，天然香料指“来源于天然物质的芳香油类、浸提香精油、香料或净油、蛋白水解物、馏出液以及食品通过烘焙、加热或酶作用而产生的含有香料的物质，其在食品中的主要功能是调香而非营养作用。这些天然物质指香辛料、果汁、蔬菜或菜汁、食用酵母、草药、树木的根、茎、叶、芽或类似的植物材料、肉类、海产类、禽蓄、蛋类、奶制品或发酵产品”。
生物转化法生产香料正好可以满足这些要求，这些制备香精香料的生物方法大致可分为以下三类: 一、生物催化法合成；二、借助微生物细胞发酵；三、通过植物细胞或者组织提取。
生物催化法是指采用生物催化剂，即酶作用于天然物质，通过合成或分解反应而获得天然香料的方法。生物催化法有许多优点。首先，该法生产的香料是全天然的；其次，采用的催化剂酶可在温和的反应条件常温、常压和正常值范围下进行，且催化效率相当高，具有很强的立体专一性和区域、对应体选择性；第三，香料生成过程中的副产物少，易于分离纯化，而且，即使有副产物，也是天然无害的；第四，生物催化法能生产品种多样的香料，几乎所有的细胞成分都能通过分解和合成反应产生香料物质。生物催化技术在香精香料应用方面，其中脂第 2 页 共 8 页 肪酶(Lipase)占很大比例。
酶工程技术在现代生物化工中的研究与应用
酶工程技术在现代生物化工中的研究与应用
第一篇范文
酶工程技术在现代生物化工中的研究与应用
酶工程技术作为生物技术领域的一个重要分支，在现代生物化工中发挥着越来越重要的作用。生物化工是指利用生物系统和生物反应器来生产化学品的过程，而酶工程技术则是实现这一目标的关键技术之一。本文将详细介绍酶工程技术在现代生物化工中的研究与应用。
一、酶工程技术的研究
1. 酶的筛选与改造
酶是生物体内的一种特殊蛋白质，具有高效、专一和可逆的催化作用。通过筛选和改造酶，可以提高其催化效率和稳定性，从而实现更高效的生物化工过程。目前，研究人员已经通过基因工程技术成功改造了许多酶，例如脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶等。
2. 酶固定化技术
酶固定化技术是将酶固定在一定载体上，使其在反应体系中可重复使用的一种技术。固定化酶具有较高的稳定性和重复使用次数，可以降低生产成本，提高产品质量。目前，常见的酶固定化技术包括物理吸附法、共价结合法和包埋法等。
3. 酶反应器的设计与优化 酶反应器是进行酶催化反应的装置，其设计和优化对生物化工过程的产量和效率具有重要影响。目前，常见的酶反应器包括批次反应器、连续流反应器和固定床反应器等。研究人员通过优化反应器的设计参数，可以提高酶催化反应的产量和效率。
二、酶工程技术在生物化工中的应用
1. 生物制药
酶工程技术在生物制药领域具有广泛的应用。例如，在生产胰岛素、生长激素和疫苗等药物的过程中，酶工程技术可以用于优化生产流程、提高产品质量和降低生产成本。
2. 生物催化反应
酶工程技术在生物催化反应中具有重要作用。例如，在生物炼油、生物化工材料和生物能源等领域，酶工程技术可以用于提高催化效率和选择性，从而实现高效、绿色的生产过程。
3. 环境保护
酶工程技术在环境保护领域也具有广泛应用。例如，在废水处理、废气净化和固体废弃物处理等方面，酶工程技术可以用于降解有机污染物，实现环境的清洁和可持续发展。
使用国产环氧树脂LXEP-120固定化脂肪酶研究
使用国产环氧树脂LXEP-120固定化脂肪酶研究
徐珊;李任强;张继福;张云;孙爱君;胡云峰
【摘 要】使用国产环氧树脂LXEP-120对猪胰脂肪酶进行固定化,研究其固定化工艺的最佳条件,并且对固定化酶和游离脂肪酶的酶学性质作初步的比较.结果显示,最佳固定化条件为:选用pH6.0、1.0 mol/L的磷酸钾缓冲液,载体投放量5.0 g,固定化温度22℃,固定化时间12 h.最终得到的固定化酶酶活400 U/g,酶活回收率92.79％,固定化酶重复使用10次后仍保持70％左右的酶活.与游离酶相比,固定化酶的最适反应pH(pH8.0)没有变化,最适反应温度(45℃)提高5℃,pH耐受性、热稳定性和重复使用性显著增强.同时,固定化酶具有较好的储存稳定性.研究结果证明国产环氧树脂LXEP-120在工业酶的固定化应用上具有很好的应用潜力.
【期刊名称】《广西师范大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2018(036)004
【总页数】11页(P108-118)
【关键词】国产环氧树脂LXEP-120;脂肪酶;固定化;酶学性质
【作 者】徐珊;李任强;张继福;张云;孙爱君;胡云峰
【作者单位】暨南大学 生物工程学系,广东 广州 510632;暨南大学 生物工程学系,广东 广州 510632;广东省中医院,广东 广州 510120;中国科学院南海海洋研究所
中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室,广东 广州 510301;中国科学院南海海洋研究所 广东省海洋药物重点实验室,广东 广州 510301;中国科学院南海海洋研究所 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室,广东 广州 510301;中国科学院南海海洋研究所 广东省海洋药物重点实验室,广东 广州 510301;中国科学院南海海洋研究所 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室,广东 广州 510301;中国科学院南海海洋研究所 广东省海洋药物重点实验室,广东 广州 510301
生物柴油脂肪酶产生菌的筛选及培养条件研究
第２ｏ卷第１期 ２０１０年２月 茂名学院学报
ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＡＯＭ Ｇ ＵＮⅣＥＲＳｎＹ Ｖ０１．２０ Ｎｏ．１ Ｆｅｂ．２０ｏ９
生物柴油脂肪酶产生茵的筛选及培养条件研究
韩寒冰，李松佳，沈伟煌，彭翠苹，吴小梅
（茂名学院化学与生命科学学院，广东茂名５２５００ｏ）
摘要：从长期被脂肪油脂污染的土壤中分离得到能够以橄榄油为唯一碳源和能源的脂肪酶产生菌，通过在含有演．甲酚紫的 培养基培养筛选一株脂肪酶活力最强的菌株，经显微镜观察和生理生化实验，初步鉴定为巨大芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌａｃ ｍｅｇａｔｅｒｉ－ ｕｎ１）。在ｐＨ７．０，橄榄油浓度在８１２ｍｇ／Ｌ和以１．５％蛋白胨为氮源的培养条件下三天，脂肪酶的活力最大，达到１９．３Ｕ／ｍＬ。 关键词：脂肪酶菌；酶活力；生物柴油 中图分类号：Ｑ８１５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７１—６５９０（２ｏ１Ｏ）０ｌ一００１２—０３
生物柴油具有无毒、能生物降解、不含芳香烃且含硫量很低、可以以任意比例与石油柴油混兑的特点。 开发生物柴油不仅有利于减小大量进口对我国的能源安全造成的威胁；还对实现经济可持续发展，推进能
源替代，减轻环境压力等具有深远的经济与社会效益。酶法制备生物柴油具有化学催化法不可比拟的优
越性，是工业化生产的发展方向…。生物柴油是由动植物油脂与醇经酯交换反应而得的脂肪酸单烷基酯，
最典型的生物柴油是脂肪酸甲酯。脂肪酶（“ｐａｓｅ，Ｅ Ｃ．３．１．１．３）是指分解或合成高级脂肪酸与丙三醇 形成甘油三酸酯酯酶，在催化合成生物柴油的研究中已获得应用【２Ｉ３】，但生产中酶的成本过高、甲醇和甘
油对酶的毒害作用这两大问题还未能得到根本性的解决，使得生物酶法一直不能在工业生产上得到推广 应用。因此，通过筛选或是利用基因工程技术对现有的脂肪酶产生菌进行改造，以获取催化活性更高、对
短链醇耐受能力更强的脂肪酶，深入研究脂肪酶的固定化方法和研究影响脂肪酶活性的条件，为实现工业 化生产提供依据。
固定化脂肪酶催化棉籽油合成生物柴油
第２６卷第５期 ２００８年ｌ０月 石河子大学学报（自然科学版） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｈｉｈｅｚｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ） Ｖ０１．２６ Ｎｏ．５ Ｏｃｔ．２０ｏ８
文章编号：１００７．７３８３（２００８）０５．０５９８．０５
固定化脂肪酶催化棉籽油合成生物柴油
李元元 ，李春 一，唐凤仙 ，徐小琳
（１北京理工大学生命科学与技术学院生物技术系，北京１０００８１； ２新疆兵团化工绿色过程重点实验室／石河子大学化学化工学院，新疆石河子８３２００３）
摘要：对比多种载体固定化脂肪酶的吸附效果，确定了以大孔吸附树脂Ｄ１０１为载体，采用先吸附后交联的方法固 定脂肪酶。固定化后脂肪酶的稳定性得到较明 改善，最适反应温度５０￣Ｃ，最适反应ｐＨ值为８。确定了固定化脂 肪酶催化棉籽油与甲醇转酯化反应合成生物柴油工艺条件，醇油比３：１，含水量１．２５％（Ｖ／Ｖ），加入质量比（酶量与 固定化载体）０．４８的固定化酶，反应介质辛烷，在４０℃反应２４ｈ催化生物柴油的合成，最高转化率可达到６５％。 关键词：生物柴油；棉籽油；脂肪酶；固定化；转酯化；交联 中图分类号： Ｉ ５ 文献标识码：Ａ
脂肪酶是一种生物催化剂，广泛应用于催化酯
化和酯交换反应。由于游离酶不易回收重复使用，
且分散于有机溶剂中往往容易失活ｌｌ Ｊ。而将脂肪酶
固定于不溶性载体上可重复使用。常用的固定脂肪 酶方法有：吸附法、共价法、包埋法及交联法等＿２ｊ。
其中吸附交联法是先将酶吸附在载体的表面，再用
戊二醛等多功能试剂进行交联固定脂肪酶的方法，
其吸附过程操作简单方便，吸附容量大，而酶分子间
的交联又保证了酶分子紧紧地结合于载体上，因此， 固定化酶稳定性较高。
酶法合成生物柴油，即用动物油脂和低碳醇通
过脂肪酶进行转酯化反应，制备相应的脂肪酸甲酯
或乙酯。与传统的化学催化技术相比较，脂肪酶催
化酯化与甲醇解作用更温和、更有效，不仅可以减少
ZIF-8原位自封装固定化脂肪酶的研究
2021
年3
月
第42
卷第5
期
1 -—基础研究貪品研究与开发
DOI: 10.12161Zj.issn.1005-6521.2021.05.001
ZIF-8
原位自封装固定化脂肪酶的研究
梁鑫叫张成楠1
「周威％李秀婷1
，2
宀万澄莹1,2
(1.
北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京工商大学，北京1000482
北京工商大学食品与健
康学院，北京100048
；3
・北京工商大学理学院，北京10004&4.
北京市食品添加剂工程技术研究中心，
北京工商大学，北京100048
)
摘 要：该研究使用沸石-咪座框架
-8
(zeolitic imidazolate framework-8 ,ZIF-8
)多孔结构材料原位自封装皱褶假丝酵
母源脂肪酶(
Candida rugosa lipase, CRL)制备固定化脂肪酶(
CRL@ZIF-8 ),利用红外光谱(
Fourier transform infrared
spectroscopy, FT-IR)、
X-射线衍射(
X-ray diHraction, XRD )和扫描电子显微镜(
scanning electron microscopy, SEM )等技
术研究金属离子来源、反应时间、金属离子浓度和有机连接体的浓度等因素对固定化酶催化活性和形貌特征的影响。
确定固定化脂肪酶的最适合成条件
：2-甲基咪座浓度为
1.0mol/L，醋酸锌浓度为
0.5moVL,反应时间为
30 min。在该
条件下制备的固定化脂肪酶
CRL@ZIF-8酶活力可达到
9.8 U/g,其温度稳定性有显著的提高。
关键词：脂肪酶;沸石-咪哇框架
-8
(ZIF-8
);原位封装法;
2-甲基咪哇;醋酸锌
Study on Immobilization of Lipase by In-situ Encapsulation in ZIF-8
LIANG Xin12, ZHANG Cheng-nan1 2* , ZHOU Wei3, LI Xiu-ting1*2*4, WAN Cheng-ying1 2