玉米种子纯度SSR分子标记鉴定方法
辣椒种子纯度
SSR分子标记鉴定技术规程
编制说明
沈阳市农业科学院
2017年5月
《辣椒种子纯度SSR分子标记鉴定技术规程》
标准编制说明
一、工作简况，包括任务来源、协作单位、主要工作过程、主要起草人及其所做的工作；
2016年5月沈阳市农业科学院通过辽宁省农村经济委员会和沈阳市质量监督局向辽宁省质量技术监督局提交《项目建议书》，建议编制《辣椒种子纯度SSR分子标记鉴定技术规程》标准。经审查及公示，项目被列入辽宁省地方标准制修订2017年度计划，立项编号为2016073，沈阳市农业科学院为项目承担单位。
项目立项后，项目承担单位成立了标准起草小组，落实了标准起草经费，提供了必要的工作条件。标准起草小组的成员有：杨双、张曼丽、刘延斌、李金凤、马东梅、潘菊、胡颖、孙嘉兴、李雪、宋伟。杨双为技术总负责；李金凤、马东梅负责标准样品收集；潘菊、胡颖负责技术资料检索；刘延斌、孙嘉兴、李雪负责标准技术参数确定。标准起草小组在批准立项的一个月内制定了具体的标准起草计划。按照计划，2016年12月前完成资料收集、相关调研及试验验证；2017年4月聘请省内农业专家对征求意见稿进行修改；5月完成意见整理、分析和处理，填写地方标准征求意见汇总表；5月申请专家审查。
二、标准编制原则和确定地方标准主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则）的依据。地方标准修订项目，还应列出和原标准主要差异情况；
辣椒(Capsicum annuum L.)是辽宁省八大蔬菜作物之一，省内广泛种植，随着辣椒杂交种的种植面积不断扩大，种子纯度问题显得尤其重要。在辣椒制种过程中，无论使用两系杂交或者三系杂交，杂交一代种子中易于混入母本种子。由于亲本的生产力弱，产量低，纯度不够的种子对辣椒生产造成影响。在辣椒生产过程中，常常出现因种子纯度不高造成产量降低、品质变劣，商品性不好，严重影响经济效益。因此，大力开展辣椒种子纯度检测工作显得尤其重要。目前鉴定辣椒种子纯度一般采用田间种植或室内酯酶同工酶电泳等方法，这些方法虽简便易行，但田间种植仅靠形态观察较难做到准确判断，且耗时长，同工酶检测也会因环境和发育时期而发生变化，导致电泳结果不易判读。建议制定基于DNA多态性，依托SSR分子标记技术，具有快速、准确、易操作等特点的鉴定辣椒种子纯度技术规程，适用于省内主栽的辣椒品种的纯度鉴定，提高商品种子质量，为质量监督管理部门提供参考，同时也为辣椒品种指纹图谱的建立和品种知识产权的保护打下基础。
SSR（Simple Sequence Repeat）是一类由几个（多为1-6个）碱基组成的基本单元串联重复形成，广泛存在于真核生物的基因组中。由于个体基因组中每个SSR位点的重复单元在数量上存在多态性，可用于鉴别不同个体。基因组中这些SSR位点的侧翼DNA片段通常都是保守性较强的单一序列，可以根据侧翼的DNA片段的碱基序列设计引物，进行PCR扩增，将单个SSR位点扩增出来。不同个体的扩增产物在长度上的变化就产生多态性，可用来鉴别不同个体。
辣椒属于被子植物。根据被子植物发育原理，种皮是由珠被发育来的，其细胞内的2N条染色体全部来自母本；胚是由受精卵发育来的，其细胞内的2N条染色体一半来自卵细胞（母方），一半来自精子（父方）；胚乳是由受精的极核发育来的，其细胞内的3N条染色体有2N条来自极核（母方），N条来自精子（父方）。这样1粒杂交一代的种子的种皮为母本基因型，胚为杂交种基因型，在实际应用中，不需要提供亲本也可以通过杂交种获得亲本基因型数据。
三、主要试验（或验证）的分析报告、相关技术和经济影响论证、预期的社会经济效益；
1.DNA制备方法
植物体任何部分都可以用来提取DNA，但是幼叶相对容易，种子和种皮相对较难，因为种皮中含有大量纤维素，细胞壁厚，裂解难。解决种子和种皮的DNA提取是本研究的难点。
采用天根公司的植物基因组DNA提取试剂盒，种子和种皮提取时，通过延长裂解时间，取消漂洗步骤，无菌水反复冲洗等步骤，以期减少DNA损失，提高DNA提取量。提取幼叶时正常按照说明书提取。
用纯水浸泡辣椒种子过夜，剥取辣椒种皮及种子20mg左右（约5粒左右）至2.0ml离心管中，将液氮加入其中并迅速研碎，加入裂解液LP1，原裂解时间为10min，改为20min，取消漂洗过程，其余操作步骤同试剂盒说明。
幼叶取100mg左右，按照试剂盒说明书步骤提取。
用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA质量，结果如图1所
示。
图1 DNA电泳结果
注：1，2，3—种皮；4，5，6—种子；7，8，9—幼叶
结果显示，以植株幼叶为材料获得的DNA质量最好，但是从种子催芽到萌发需要2周左右时间，耗时长。以种子、种皮为材料获得的DNA相对幼叶较少，但也可见清晰条带。
2．纯度鉴定技术
参考管俊娇等（2014）、刘子记等（2014）及李晶晶（2009）的相关研究，结合http：//网站公布的辣椒分子标记的相关信息，获得多态性SSR引物。利用辽宁省栽培面积最大的麻辣椒沈椒4号、某大牛角、某甜椒作为研究材料，开展纯度鉴定研究。
2.1 反应体系
总体积10 μL，包括5μL 2×Taq PCR Mix (with Dye)、1μL 引物（10 μmol/L）、2μL DNA、2μL超纯水，混匀。
2.2 反应程序
94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸2min；4℃保存。
2.3 引物筛选及结果
选用20对SSR引物对沈椒4辣椒的种皮和杂交种子的DNA进行
扩增，结果发现，有4对引物的扩增条带在两个样品中出现明显差异，且图谱中条带较少，易于判断，见图2。
图2 沈椒4号的种皮与种子DNA的SSR标记
3. 纯度检测
选择上述1对差异引物对48粒种子样品进行检测，通过PCR及电泳，获得凝胶照片，见图3。
图3 沈椒4号纯度检测电泳结果
结果见图，从图可见，第2粒为亲本、第37粒为外源杂。
4. 不同品种进行验证
利用上述方法，分别检测某大牛角（图4）、某甜椒品种（图5），经验证该方法可用于检测不同类型辣椒品种的纯度。
图4 大牛角纯度检测电泳结果
图5 甜椒纯度检测电泳结果
综上，上述方法可以实现检测的简易化、规范化和标准化。调查资料及检测结果也显示，此检测方法有重复性好且操作简单等诸多优势，能够解决辣椒种子商品化过程中问题，可预见该检测技术的推广
使用具有很大的社会经济效益。
四、国内外现行相关法律、法规和标准情况；
随着辣椒杂种一代种植面积的不断扩大，品种的种子纯度问题显得尤其重要。在生产实践中，常常出现因种子纯度不高造成产量降低、品质变劣，商品性不好，严重影响经济效益。因此，大力开展辣椒种子纯度检测工作显得尤其重要。目前，国内辣椒纯度检测主要参考标准GB/T 3543.5-1995，该标准主要通过种子、幼苗、植株的形态上的差异来鉴定，时间长且准确度差。近年来，随着分子标记技术的不断发展和完善，基于DNA水平的辣椒种子纯度检测工作得到长足发展，本标准采用SSR分子标记技术鉴定辣椒种子纯度，该方法与常用蛋白质标记技术或其他DNA分子标记相比，在鉴定辣椒种子纯度上有稳定、清晰、高效的优势，有利于检测技术的进一步推广应用。
五、重大意见分歧的处理结果和依据；
无
六、提出标准强制实施或推荐实施的建议和理由；
辣椒种子纯度检测是种子管理部门、辣椒种子生产单位、经营部门的日常业务和控制质量的关键环节之一。随着辣椒杂种一代种植面积的不断扩大，品种的种子纯度问题显得尤其重要。在生产实践中，常常出现种子纯度不高、活力下降，造成产量降低、品质变劣，严重影响其经济效益。因此，大力开展辣椒种子纯度检测工作显得尤其重要。本标准制定的辣椒杂交一代种子纯度SSR分子标记鉴定技术规程操作相对简便、结果稳定可靠、检测精准度高的技术方法，实用性强、
适用性广，建议批准发布为地方标准，推荐有关单位和部门使用。
七、贯彻地方标准的要求、措施及标准实施时间的建议，强制性标准还应说明实施过渡期的理由；
由于标准中涉及的DNA提取技术、PCR技术、电泳技术专业性较强，操作者需具备一定的专业理论及掌握相关实验操作技术。因此，如条件允许，标准实施过渡期组织开展相关培训活动，提高检测人员的操作水平，使该标准得到推广应用。
八、其他应予说明的事项。
无
SSR标记技术在种子纯度鉴定中的研究进展(一)
SSR标记技术在种子纯度鉴定中的研究进展(一)
论文关键词：种子纯度SSR标记研究进展
论文摘要：种子纯度在种子生产中的地位日益提高，以往的形态鉴定等方法难以满足人们的要求。随着分子标记技术的发展，越来越多地被应用到种子纯度鉴定中。本文介绍了SSR分子标记技术的基本原理和特点，简要叙述了SSR标记技术在农作物种子纯度鉴定上的研究进展，并就其在杂交种纯度方面的应用潜力进行了探讨。
Keywords:Seedpurity;SSRmarkers;Researchprogresses
Abstract：ThestatusofSeedpurityareincreasedinseedproduction.Itisdifficulttomeetpeoplethatthemethodsofpastidentifications.Withthedevelopmentofmolecularmarkers,SSRareappliedtotheidentificationofseedpurityincreasingly.Inthispaper,SSRmolecularmarkertechnology,thebasicprinciplesandcharacteristicsaresummarized.ItisdescribedtheresearchprogressesofSSRmarkersinthepurityofcropseed.And,itisdiscussedthepotentialapplicationsinthepurityofhybrid.
1.前言
随着我国农业经济的发展和种子市场的逐步规范，种子的真假和纯度对种子生产具有越来越重要的影响。为了保护农民以及育种者的利益，发展快速、稳定、可靠的品种纯度鉴定方法具有重要的意义。种子品种纯度鉴定主要包括品种真实性和品种纯度鉴定两个方面。品种鉴定主要指对供检样品的真实性进行鉴定。品种纯度就是对品种的一致性进行分析。种子纯度是种子质量的核心指标，是衡量种子质量的主要标准，种子纯度的高低对农业生产的产量和品质有较大的影响，因此在种子生产、加工、贮藏和经营贸易中有重要的意义，历来受到种子管理部门、种子生产者和用种者的密切关注。
SSR分子标记在玉米品种沈玉21真伪性鉴定中的应用
研究论文522012年第７期
摘要：应用SSR分子标记技术，在DNA水平上鉴定2份待检样品与沈玉21标准样品是否为同一品种。结果表明：待检样品1与标准样品为相同品种或极近似品种；待检样品2与标准样品为不同品种。建立了沈玉21的DNA指纹图谱，为鉴定种子的真伪性提供了有效有段，在品种保护工作中发挥重要作用。关键词：玉米；SSR；沈玉21；品种保护我国玉米品种丰富，但是由于少数骨干自交系的频繁使用，导致品种间的遗传基础日趋狭窄，单纯依靠形态[1]、蛋白质图谱[2]等鉴定方法很难判别品种和亲本自交系，给品种鉴定及品种保护工作带来困难。随着DNA分子标记技术的发展，使得从基因水平上鉴定种子的真伪性成为可能，在众多分子标记方法中，SSR技术因其具有快速、准确、信息量高、呈共显性分离、易于分析、重复性好等优点，已被广泛用于玉米品种鉴定工作[3]。2007年国家农业部发布玉米品种鉴定标准（NYT 1432-2007），该标准就是应用SSR技术鉴定玉米品种，目前基于SSR分子标记技术的DNA指纹图谱已成为玉米品种保护的法律依据。沈玉21是沈阳市农业科学院选育的拥有自主知识产权的中穗耐密型优良玉米杂交种，2006年通过国家农作物品种审定委员会审定，审定编号为国审玉2006021。因其具有高产、优质、抗逆性强、适应性广等特点，每年套牌生产销售沈玉21的不法商贩很多，销售量很大，甚至超过正规渠道的销售量。为加强产权保护，本研究采用SSR分子标记，建立沈玉21的DNA指纹图谱，以此判别种子的真伪。1 材料与方法1.1 材料 供试的玉米种子包括标准样品和2份待检样品，均由沈阳市农业科学院种业公司提供。试剂：DNA提取试剂盒；PCR reaction MIX；SSR引物[4]，包括20对基本核心引物，20对扩展核心引物，均购于赛百盛基因技术有限公司。仪器：高速冷冻离心机，PCR仪，电泳仪，垂直电泳槽。1.2 方法 DNA提取和检测。每份样品各取10粒种子，75%酒精表面消毒，纯水浸泡，用刀片取胚，放入2ml离心管中，加入200μl CTAB提取液，用研磨杵研磨至匀浆，加入300μl提取液，混匀，置于65℃水浴15min，之后按照试剂盒使用说明进行提取。SSR反应体系及程序。反应体系：总体积为10μl，PCR reaction MIX为5μl，引物浓度为0.5μmol/L，DNA为1μl。反应程序[5]：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min。电泳检测。在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，恒定功率80W，1h。10%无水乙醇固定3min，纯水冲洗10s，0.2% AgNO3染色5min，纯水冲洗10s，显影液（1.5%NaOH，0.4%甲醛）中显影；10%无水乙醇定影。判定标准。40对引物位点中，差异位点数≥2，判定待检样品与标准样品为不同品种；若差异位点数=1，判定待检样品与标准样品为近似品种；若差异位点数=0，判定待检样品与标准样品为相同品种或极近似品种[6]。2 结果与分析由图1可知，40对引物位点中，待检样品1与标准样品的差异位点数为0，可以判定待检样品1与标准样
SSR标记对宁单11种子纯度的鉴定
第２９卷第９期２０１０年９月 种子（Ｓｅｅｄ） Ｖｏ１．２９ Ｎｏ．９ Ｓｅｐ．２０１０ ＳＳＲ标记对宁单１１种子纯度的鉴定 李苗 。李新 ， 甘晓燕 ， 陈晓军 ， 宋玉霞 （１．宁夏农业生物技术重点实验室， 银川７５０００２； ２．宁夏农林科学院农作物研究所， 宁夏永宁７５０１０５） 摘要：采用ＳＳＲ分子标记方法，选用２４对引物，以杂交玉米宁单１１杂交种子及其父母本为实验材料，对宁单ｌ１种子纯 度进行鉴定。通过带型分析，筛选出在杂交种中呈现清晰且双亲互补带型的特异性引物，并依据特异性引物的筛选标记 结果对抽样批次的宁单１１种子样本进行纯度鉴定。结果表明：ｐｈｉ０３４、ｐｈｉ０８０、ｕｍｅ １６３８、ｂｎｌｇ４３９、ｂｎｌｇ１７９２五对ＳＳＲ引 物可用于玉米杂交种宁单１１种子纯度鉴定。 关键词：ＳＳＲ标记；宁单１１；种子纯度 中图分类号：Ｓ５１３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１１０１—４７０５（２０１０）０９－００３８－０３ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｎｉｎｇｄａｎ １ １ Ｍａｉｚｅ Ｈｙｂｉｒｄ Ｓｅｅｄ Ｐｕｒｉｔｙ ｂｙ ＳＳＲ Ｍａｒｋｅｒｓ ＬＩ Ｍｉａｏ ，ＬＩ Ｘｉｎ ，ＧＡＮ Ｘｉａｏ－ｙａｎ ，ＣＨＥＮ Ｘｉａｏ－ｊｕｎ ，ＳＯＮＧ Ｙｕ－ｘｉａ （１．Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｉｎｇｘｉａ，Ｎｉｎｇｘｉａ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｙｉｎｇｃｈｕａｎ Ｎｉｎｇｘｉａ ７５０００２，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｃｒｏｐｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎｉｎｇｘｉａ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｙｏｎｇｎｉｎｇ Ｎｉｎｇｘｉａ ７５０ １０５，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｆ１ ｏｆ Ｎｉｎｇｄａｎ １ １ ａｎｄ ｉｔｓ ｐａｒｅｎｔｓ ｌｉｎｅｓ ｗｅｒｅ ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ ｔｏ ＳＳＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ２４ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ．Ｂｙ ｚｏｎｅ ｔｙｐｅ ａｎａｌｙｓｉｓ，ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｏｕｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｈｉｃｈ ｚｏｎｅ ｔｙｐｅ ｗａｓ ｃｌｅａｒ ａｎｄ ｐａｒｅｎｔｓ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｍａｒｋｅｒｓ，ｓｅｅｄ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ Ｎｉｎｇｄａｎ １ １ ｍａｉｚｅ ｈｙｂｉｒｄ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｆｉｖｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｐｈｉ ０３４，ｐｈｉ ０８０，ｕｍｃ １ ６３８，ｂｎｌｇ ４３９，ｂｎｌｇ １ ７９２ ｗｅｒｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｓｅｅｄ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｔｈｉｓ ｖａｒｉｅｔｙ。 Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒ；Ｎｉｎｇｄａｎ １ １；ｓｅｅｄ ｐｕｒｉｔｙ 分子标记技术应用于作物种子纯度鉴定，能够克 服形态标记、蛋白电泳等传统鉴定方法中鉴定分辨率 低、周期长、误差率较大等缺陷。ＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ，简单重复序列）技术由于其标记带型简单，结 果客观，并且具有多态性高、操作程序简单、结果重复 性好等优点，被广泛应用于玉米、水稻等主要农作物的 种子纯度检测鉴定工作。李汝玉 等利用ＳＳＲ位点 上等位基因间大小的差异和共显性遗传特点，鉴定玉 米等作物杂交种的纯度。李小辉 等以２ｌ份玉米骨 干自交系及其组配的１３个杂交种为材料进行ＳＳＲ标 记分析，发现应用ＳＳＲ标记技术可快速、准确地鉴定 玉米杂交种种子纯度。薛艳颖，陈兴奎 等人利用筛 选的ｌＯ对玉米ＳＳＲ核心引物鉴定纯度，对玉米品种 锦单９号进行了种子纯度鉴定。 收稿日期：２０１０—０５—２５ 基金项目：宁夏回族自治区科技攻关项目（ＫＧＺ一１６－０７－０２）；宁夏回族自 治区自然基金项目（ＮＺ０８６０） 作者简介：李苗（１９８２一），男，研究实习员，主要从事分子标记辅助育 种研究；Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｍｉａｏ１２２８＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ。 通讯作者：宋玉霞（１９６３一），女，研究员，主要从事生物技术育种研究。 ・３８・ 宁单１ １是宁夏农林科学院农作物研究所经多年 杂交选育而成的玉米新品种，具有抗倒性强、耐瘠薄、 耐密性好的特点和较高的丰产性 Ｊ。本研究以宁单 １１及其父母本为材料，对制成的宁单１１种子进行批 次抽样，采用ＳＳＲ分子标记方法，进行了纯度鉴定，为 杂交玉米制种工作提供理论依据。 １材料与方法 １．１材料与试剂 宁单１ １种子及其亲本来自宁夏农林科学院农作 物研究所，２４对ＳＳＲ引物序列来自ＭＡＩＺＥＤＡＴＡＢＡＳＥ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｉｚｅｇｄｂ．ｏ ）数据库，引物由北京奥科 生物技术有限公司合成，详见表１。ＰＣＲ扩增试剂购 于北京天根生物科技公司。试验所用其它相关试剂均 为分析纯。 １．２方法 １．２．１基因组ＤＮＡ的提取 采用ＣＴＡＢ法提取宁单１ １种子及亲本材料基因 组ＤＮＡｌ５］。将萌发７ ｄ的玉米叶片材料在液氮中研磨 成粉末状，加入５ ｍｌ无ＣＴＡＢ缓冲液（２００ ｍＭ Ｔｒｉｓ，
SSR分子标记技术及其在构建玉米DNA指纹库上的应用
SSR分子标记技术及其在构建玉米DNA指纹库上的应用
摘要SSR分子标记技术是在PCR基础上发展起来的一种DNA多态性检测技术，已广泛应用于植物基因组研究的各个领域。概述了SSR标记的原理、类型、功能及其引物的来源，利用SSR构建玉米DNA指纹库的进展，玉米DNA指纹库在品种鉴定、品种保护及品种监测等方面的应用等，以为玉米品种的研究提供参考。
关键词SSR分子标记;玉米;DNA指纹库;应用
AbstractSimple sequence repeat(SSR)markers on the basis of PCR as a
technology of detection DNA polymorphism have been widely used in the
studies of plant genome research in some fields. In the paper，the
theories，types，functions and sources of primers by SSR marker were
clarified. Then the processes of maize DNA fingerprinting pool
construction by SSR were elaborated. Finally the application of maize
DNA fingerprinting pool on cultivar identification，cultivar
protection，cultivar detection et al was pointed to take references for
maize varieties research.
Key wordsSSR molecular marker;maize;DNA fingerprinting
利用分子标记辅助育种
利用分子标记辅助育种
一、分子标记辅助育种概述
分子标记辅助育种是现代生物技术与传统育种方法相结合的一种高效育种技术。它利用分子标记与目标基因紧密连锁的特性，在作物育种过程中对目标基因进行追踪和选择，从而显著提高育种效率和准确性。随着分子生物学技术的不断发展，分子标记辅助育种已成为作物遗传改良的重要手段，在农业生产中发挥着越来越重要的作用。
二、分子标记辅助育种的关键技术
1. 分子标记类型
- SSR标记（简单重复序列标记）：SSR标记具有多态性高、共显性遗传、重复性好等优点。其核心是由1 - 6个核苷酸组成的简单重复序列，广泛分布于基因组中。通过设计特异性引物对SSR区域进行扩增，根据扩增产物的长度多态性来检测个体间的差异。例如，在水稻育种中，利用SSR标记可以有效区分不同品种的水稻，为品种鉴定和纯度检测提供了可靠的方法。
- SNP标记（单核苷酸多态性标记）：SNP标记是基因组中单个核苷酸的变异，是最常见的遗传变异类型。它具有数量多、分布广泛、检测通量高的特点。SNP标记的检测方法包括基于PCR的方法、芯片技术和新一代测序技术等。在玉米育种中，SNP标记已被广泛应用于全基因组关联分析（GWAS），用于挖掘与重要农艺性状相关的基因位点，为分子标记辅助选择提供了丰富的标记资源。
- AFLP标记（扩增片段长度多态性标记）：AFLP标记结合了RFLP（限制性片段长度多态性）和PCR技术的优点，具有较高的多态性检测效率。其原理是通过对基因组DNA进行限制性内切酶酶切，然后连接特定的接头，再进行选择性扩增。扩增产物通过电泳分离，根据片段长度多态性来分析遗传差异。在小麦育种中，AFLP标记可用于构建遗传连锁图谱，定位控制小麦抗病性、品质等性状的基因。
2. 目标基因定位与克隆
- 连锁分析：连锁分析是通过研究标记与目标基因在染色体上的连锁关系来定位目标基因的方法。当标记与目标基因紧密连锁时，它们在遗传过程中倾向于一起传递。通过分析不同个体中标记与目标性状的共分离情况，可以确定目标基因所在的染色体区域。例如，在大豆育种中，利用连锁分析成功定位了控制大豆油分含量的主效基因，为分子标记辅助选择高油大豆品种提供了依据。
SSR分子标记技术在杂交种丹玉39纯度鉴定上的应用
蓉ＩＩ珀ｉｊｌ
ＳＳＲ分子标记技术在杂交种 ２０１３．７试验研究
丹玉３９纯度鉴定上的应用
李立鑫
（辽宁省种子管理局 沈阳１１００３４）
摘要：采用２０对ＳＳＰ，．基本引物对两个玉米品种组合进行筛选，以选出相应品种的父母本双亲互补
带型的特异性引物，）－ｆｌ于对应品种的纯度鉴定，为建立玉米品种纯度鉴定的核心引物库奠定基础。 关键词：玉米；ＳＳＲ标记；纯度
种子质量的高低关系到农业生产安全，而衡 量种子质量的重要指标之一就是纯度，因此对种
子进行纯度检测在农业生产及质量监管过程中尤
为重要。
玉米是我国主要的粮食作物，对其纯度的检
测，若采用传统方法耗时长、受季节限制、多态性
差；而以ＰＣＲ反应为基础的ＳＳＲ分子标记技术以
其标记数量丰富、呈共显性遗传、重复性好、易于
操作、结果可靠等诸多优点成为快速、准确、可靠 的纯度鉴定方法
本研究以两个玉米品种组合为材料．用２０对引
物对其进行筛选．选出相应品种的父母本双亲互补 带型的特异性引物，以用于对应品种的纯度鉴定。
１材料与方法
１．１ 材料 （１）供试玉米样品：本研究使用的玉米杂交品种
及其双亲由辽宁省种子管理局收集（见表１）。
表１ 杂交种及其双亲
（２）ＳＳＲ引物：参考国内外文献资料 Ｉ，选用多
态性高、带型清晰稳定的２０对ＳＳＲ引物（见表２），由
大连ＴａＫａＲａ公司合成。
不抽生葡萄茎，出生花量中等，弱小花较少，一个
果枝开花５－６朵、结果５－６个，优质果比例大，植
株抗病性强，早熟性好。易获得产值高、效益大的
生产效果。
一７６一 （３）北京太空草莓２００８是我国第一个太空草莓
新品种，也是世界上第一个太空草莓新良种，在科研 成果自主创新和跨越式产业发展方面都具有高端的
资源条件和超前的发展潜力。
试验研究２０１３．７ 摩ｉ２础琏抛
１ Ｉ２方法
１．２．１ ＤＮＡ提取采用ＣＴＡＢ法提取玉米单粒种子
ＤＮＡＩ４－￣。
１．２．２ ＰＣＲ 及产物检 １．２．２．１ 反应体系 引物信息见表２．各组分配制见 表３。
玉米种子纯度鉴定方法
玉米种子纯度的检测：确保农业生产的一线防线
在现代农业生产中，玉米作为关键的粮食作物之一，其种子的纯度直接关系到作物产量和质量。真正的高纯度种子能够保证作物的遗传稳定性和生长的一致性，是实现现代化农业高效生产的前提。本文将从技术方法、实验标准、以及现场应用三个角度，对玉米种子纯度鉴定方法进行深入分析。
一、技术方法的探索
在技术方法的探索上，科学家和种植专家们尝试了一系列用于鉴定玉米种子纯度的方法，目的是为了提升检测的准确性和效率。
（1）形态学鉴定
传统的种子纯度鉴定依据形态学特征，通过人工进行种子的视觉检查，对比种子的大小、色泽、形状等特征。
（2）生物化学检测
该方法使用一系列生物化学反应来检测种子中特定的蛋白质或酶活性，从而辨别种子的类型和纯度。
（3）分子标记技术
分子标记技术通过分析种子DNA中的特定基因序列，准确判定种植材料的遗传纯度，这是一种高效且精确的方法。
二、实验标准的制定
标准化的实验流程和评估标准是保证种子纯度检测可重复性和准确性的关键。
（1）采样标准
确定合理的采样数量和采样方法，保证样品可以代表整批种子的状况。
（2）实验操作的规范
制定严格的实验操作流程，包括种子的处理、反应的设置以及结果的读取等，确保每一步骤都符
继我们对玉米种子纯度鉴定方法的初步探讨后，我们将深入分析用于确保检测精确性和操作简便性的先进技术和创新方法。
一、先进技术的整合
在种子纯度检测中，整合多种先进技术是提升检测能力的关键。
（1）遥感技术的应用
利用遥感技术监测作物生长的一致性，获取大面积种植区域的数据，间接评估种子纯度。
（2）自动化图像分析
借助计算机视觉进行种子外观的自动化分析，通过算法识别种子形态差异，有效辅助纯度分析。
（3）快速DNA条形码鉴定
采用快速DNA条形码技术进行种子DNA的快速筛查，提高种子遗传纯度的检测效率。
二、创新方法的探索
随着科技的进步，研究人员在种子纯度检测的方法上不断创新，以适应不同条件下的检测需求。
贵州西山系列玉米杂交种SSR标记纯度鉴定的研究
第３３卷 第１期 西南师范大学学报（自然科学版） ２００８年２月
Ｖｏ１．３３ Ｎｏ．１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｆｅｂ． ２００８
文章编号：１０００—５４７１（２００８）０１～００３６—０４
贵州西山系列玉米杂交种ＳＳＲ标记纯度鉴定的研究
曾桂萍 ， 戴保威 ， 田兴文
１．贵州大学农学院，贵阳５５００２５；２．贵州省六枝地区种子公司，贵州六枝５５３０００
摘要：以Ｉ１个贵州西山系列玉米杂交种及相应的１５个亲本自交系为材料，采用ＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ） 分子标记方法，从６Ｏ对多态性高的引物中分别筛选了双亲互补型特异引物，并利用特异引物进行玉米杂交种纯度 鉴定的检验． 关’键词：玉米；Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ（ＳＳＲ）；纯度鉴定
中图分类号：Ｓ５１３ 文献标识码：Ａ
玉米杂交种室内纯度鉴定是玉米种子质量控制体系中的关键环节．种子纯度和品种真实性这项重要指
标的检验，采用籽粒形态鉴定、幼苗鉴定和田间小区种植鉴定等方法均存在一定缺陷．籽粒形态鉴定可供
比较的性状差异少，鉴定准确性差；幼苗鉴定只适用于某些差异较大的品种，可鉴定的品种少；广泛采用
的田间小区种植鉴定方法不仅费用高，而且时间长，几乎相当于一个生长发育周期，种子企业常因在种子
销售季节开始时还没有鉴定种子纯度而导致标签失真；监督检验机构常在种子销售以后甚至农民播种以后
才能鉴定出种子纯度，失去了阻止劣质种子播种的机会Ｌ１］．同工酶或种子储藏蛋白质电泳技术具有简单、
快速、准确、成本低等优点，根据该技术制定的玉米杂交种纯度鉴定技术标准正在得到广泛应用Ｅ引，然而，
仍有部分玉米杂交种因双亲间种子储藏蛋白质或同工酶谱带无多态性或杂交种谱带为非互补类型等原因，
利用蛋白质电泳技术难以找到杂交种特征谱带，使得这部分玉米杂交种缺乏快速、可靠的纯度鉴定手段．
SSR分子标记在玉米品种沈玉21真伪性鉴定中的应用 2
呻固种业 种子加工 大型玉米种子揉搓脱粒系统技术经济效益分析 王振中 （甘肃省酒泉奥凯种子机械股份有限公司，７３５０００） 摘要：采用揉搓式玉米脱粒机械，使玉米种子破碎小，种子 质量高。采用每小时脱粒２０－５０ｔ的大型玉米脱粒系统，可大大 缩短玉米种子脱粒周期，防止冻害对玉米种子的影响。本文主 要介绍使用大型玉米脱粒机械的优越性，以及工作原理、性能、 经济效益分析等。 关键词：玉米；脱粒周期；清选；破碎；经济效益 根据用户的要求，通过市场调查，并结合本公司的 实际情况，开发了大型玉米种子揉搓脱粒系统。该系 统着重解决了玉米果穗的大吨位脱粒问题，以及脱粒 时产生的破碎大问题。 １项目的主要内容 大型玉米种子揉搓脱粒系统主要由升降控制机、 玉米果穗喂人仓、振动给料器、玉米果穗大倾角皮带输 送机、脱粒系统、筛选系统、风选系统、以及子粒皮带输 送机、出芯皮带输送机等组成。 玉米果穗经升降控制机、喂人仓、大倾角皮带输送 机输送到脱粒机的进料口，经进料口进入脱粒室，通过 弧形齿板、弧形板和格栅凹板的揉搓使其脱粒。玉米 芯经过脱粒室的排芯口排出机外，经出芯皮带输送机 将其送至预定地点。 子粒进入筛选及风选系统，首先经过上吸风道，通 过除尘系统的风机，将子粒中较轻的杂质吸人沉降室， 最轻的杂质和粉尘从出风口排出。脱下的子粒进入上 筛箱进行筛选，经过上筛，将玉米子粒中的大杂质去除， 上筛下面的物料再经过下筛箱中的下筛将子粒中的小 杂质去除。下筛上的物料再经过下吸风道进行第二 次风选除杂，清选后的玉米种子经种子出口排出机外， 进人子粒皮带输送机，将子粒输送至另一种子加工系 统。 ２主要性能指标 大型玉米种子揉搓脱粒系统主要技术性能指标 为：脱净率≥９９．５％，生产率２０～５０ｔ／ｈ（喂入量），破碎 率≤０．９％，选后净度≥９６％，噪声≤９０ｄＢ（Ａ）。 ．工Ｉ乞 ．址．址． 止— ．Ｓ也 ．Ｓ ．地．Ｓ止．Ｓ ．Ｓ止 ．Ｓ ．Ｓ — ．Ｓ也．． ．Ｓ值 ．Ｓ迪 址 Ｓ止 ． 址．址．址—喜屯．工屯．Ｓ也 —址．Ｓ止—址—Ｓｌ上舢 ．Ｓ —址．址 Ｓ ．Ｓ也．．Ｓ Ｌ．址．Ｓ也．．址．Ｓ也．．Ｓｌ上 品为相同品种或极近似品种；待检样品２与标准样品的 差异位点数为３，分别在第ｌ２、ｌ５、３０对引物位点出现 差异条带，可以判定待检样品２与标准样品为不同品种。 ３讨论 ＳＳＲ分子标记技术以其多态性高、重复性好、共显 性等特点，在玉米品种鉴定中发挥了非常重要的作用 】。 值得注意的是，ＳＳＲ产物的电泳图谱有许多杂带，这给 图谱分析带来一些麻烦。产生这些杂带的主要原因是 由于引物特异性差，退火温度不适合这两个原因。因 为引物特异性差会导致结合位点变多，杂带就会出现， 再有多引物在同一退火温度下进行扩增，所选择退火 温度并不是所有引物的最适温度，这也会导致非特异 扩增出现。为了辨别哪些是主带哪些是杂带，通常需 要在多次重复、反复对比的基础上做出判断。一般来 说，颜色较深的为主带，主带前后易出现影子条带，在 判读时可以剔除；对于一些比较淡的条带，可以对比多 次重复电泳图谱，时而出现、时而不出现的条带，可以 判定为非特异条带，判读时也需要剔除。为了减少非 特异扩增，一般可以对引物进行重新设计，使其达到理 想效果，或者采用适当提高退火温度，降低引物浓度， 降低模板浓度等方法进行改进 。 参考文献 ［１］王丽萍．杂交玉米种子田间小区种植鉴定技术．中国种业，２０１ｌ，２：７２ 【２】甄广田．盐溶蛋白超薄层等点聚焦电泳技术鉴定近缘玉米杂交种．中 国种业，２０１ １，５：４８—４９ ［３】袁进成，刘颖慧，郭建东．应用ＳＳＲ标记技术鉴定玉米杂交种纯度．中 国种业，２００９，９：４６—４７ 『４］赵久然，王风格．玉米品种ＤＮＡ指纹鉴定技术研究与应用．北京：中 国农业科学技术出版社。２００９ ［５］中华人民共和国农业行业标准．ＮＹ／Ｔ １４３２—２００７，玉米品种鉴定ＤＮＡ 指纹方法．北京：中华人民共和国农业部，２００７ ［６】周岚，陈殿元．ＳＳＲ分子标记技术及其在玉米种子鉴定上的应用．中国 种业，２００５，６：５１—５２ ［７］Ｙａｎｇ Ｓ，Ｚｈａｏ Ｊ Ｌ，Ｐａｎ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ｏｎ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｍｅａｒ ｏｆ ＩＳＳＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，１３６：６２７ （收稿日期：２０１２．０４．１６）
SSR分子标记实验操作及其注意事项
SSR分子标记实验操作及其注意事项
SSR(Simple Sequence Repeats ) 又称微卫星DNA，是一类由几个(多为1~6个) 碱基组成的基序
(motif )串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，它们广泛分布于整个基因组的不同位置上，每个座
位上重复单位的数目及重复单位的序列都可能不完全相同，因而造成了每个座位上的多态性。SSR标记数
量丰富，覆盖整个基因组，而且分布均匀，多态性高，呈共显性遗传，重复性好，操作简便，是一种理想
的分子标记技术，被广泛应用于构建基因连锁图分子辅助育种品种鉴定遗传资源的保存等方面。
一、试剂配制
1.0.2%亲水binding silence（现配现用）：1500μL95%乙醇，7.5μL冰醋酸，再加入3μLbinding silence，
混匀后使用。
2.0.5%疏水repel silence（购买后可直接使用）
3.TBE母液（5×TBE）：Tris Base,54g;硼酸,7.5g;EDTA(0.5M pH8.0),20ml.搅拌溶化，定容至1000ml，
无需灭菌，室温保存，母液的pH值应保持在8.3左右。
4.Urea－TBE(一块胶板用量)： 5×TBE,12ml;尿素,27g.加双蒸水溶解后定容至51ml，使用漏斗过滤。
5.40％丙烯酰胺：丙烯酰胺,380g;甲叉双丙烯酰胺,20g.加热至37℃使之溶解，加水定容至1000ml，用
醋酸纤维素滤膜（入Nalge滤器，0.45μm孔径）过滤，棕色瓶避光保存于室温。
6.10％APS（过硫酸铵）：超纯过硫酸铵,2g;超纯水,18ml.溶解后，4℃保存。
7.TEMED（购买后可直接使用）：电泳级的TEMED可购自Bio-Rad，Sigma或其他供应商。
8.Loading buffer：去离子甲酰胺,50ml;0.5MEDTA(pH8.0),1ml;二甲苯腈蓝cyanol,0.125g;溴酚
蓝,0.125g.混匀后置于4℃保存。