农杆菌转化步骤
植物表达载体转化农杆菌操作步骤
植物表达载体转化农杆菌操作步骤来源：郭庆水的日志植物表达载体转化农杆菌操作步骤第一部分：农杆菌介导转化水稻1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。
如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。
28℃培养。
3、农杆菌感受态细胞的制备：1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。
2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。
使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。
4、DNA直接转化农杆菌：1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。
2天左右菌落可见。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）5、重组农杆菌鉴定：1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml）。
农杆菌转化法详细过程
农杆菌转化法详细过程
一、质粒的构建
1、结合胞外表达载体DNA片段：根据需要，挑选合适的质粒载体，通常是常用的pUC18或pUC19，然后从受体DNA片段中提取事先选择好的促进脱附酶及其他酶结合位；
2、PCR扩增：使用上述质粒模板进行PCR扩增，以获得清洁的受体片段；
3、克隆：把扩增片段和质粒模板克隆到同一质粒中，然后克隆到载体存储库中，以创建定向载体用于后续研究。
二、原核转化
1、准备转化粒菌：在装满氯化物的快速离心管中，将转化菌株(一般为质粒转录系) 用冰凉的悬浮液制成2X数量的悬淋液；
2、增加plasmid 质粒：在用有抗生素控制的细菌方法中，增加转换用材料，如plasmid质粒，磷酸二钙和CaC1₂，以及可能的其他试剂；
3、原核转化：将上述的悬浮液（AP出水液）添加到悬淋液中，然后加入CaC1₂和磷酸二钙，用低频超声处理混合液使其充分作用10分钟；
4、选择转化的细胞：将处理过的转化液投入加有抗生素的培养基中，然后将这些细胞培养到辅助抗生素中，以选择转化的细胞，在抗生素抑制剂中，该细胞会死亡；
5、筛选和鉴定：原核基因转换后，体外状态选择一般会获得若干转换抗性的菌株，最终进行PCR、测序或其他方法以鉴定突变体，以确定该菌株具有最终突变基因。
农杆菌转化法的操作步骤
农杆菌转化法的操作步骤农杆菌转化法呀，这可是个很有意思的技术呢！咱就来说说它的那些步骤。
先得准备好你的受体材料，就像厨师要准备好食材一样。
这受体材料可以是植物的各种部位，比如叶片啦、茎段啦等等。
你得把它们弄得干干净净、健健康康的，这样农杆菌才愿意和它们亲近呀！然后呢，就是要培养出厉害的农杆菌啦。
这些小家伙们可是转化的关键呢！把它们放在合适的培养基里，让它们茁壮成长，就像养孩子一样精心照料。
等农杆菌长得壮壮的了，就该让它们和受体材料来个亲密接触啦。
把受体材料泡在农杆菌的培养液里，就好像让它们一起洗个澡。
这时候啊，农杆菌就会悄悄地把它们的遗传物质传递给受体材料啦，是不是很神奇？就好像是在偷偷地传递秘密一样。
接下来可不能大意哦！要给它们创造一个合适的环境，让转化能够顺利进行。
温度呀、湿度呀都要控制好，可不能让它们受委屈了。
经过一段时间后，就得检查检查转化的效果啦。
看看受体材料有没有成功地接受了农杆菌带来的新遗传信息。
这就像是考试看成绩一样，紧张又期待呢！要是转化成功了，那可真是太棒啦，就好像中了大奖一样开心。
要是没成功呢？别灰心呀，咱再来一次！就像走路摔倒了，爬起来继续走一样。
多试几次，总会成功的嘛！你说这农杆菌转化法像不像一场奇妙的冒险？每一步都充满了未知和惊喜。
它能让我们把一些好的基因导入到植物里，让植物变得更优秀、更强大。
这多有意思呀！就好像我们是植物的魔法师，能赋予它们神奇的力量。
而且哦，通过农杆菌转化法，我们可以培育出各种各样有特殊功能的植物呢！比如抗病虫害的呀，或者能生产特殊物质的呀。
这对农业、对我们的生活都有着很大的意义呢！所以呀，大家可别小看了农杆菌转化法，它可是个很厉害的技术呢！好好掌握它，就能为我们的生活带来很多的好处和惊喜哟！。
农杆菌转化法原理
农杆菌转化法原理农杆菌转化法是一种常用的植物基因转化技术，其原理是利用农杆菌在植物体内引起植物细胞的转化，使外源基因被导入植物细胞内，从而实现对植物基因的改造。
这项技术在农业生产和基因工程领域有着广泛的应用，为改良作物品种、提高农作物产量、抗病虫害等方面提供了有力的技术支持。
农杆菌转化法的原理主要包括以下几个关键步骤：1. 农杆菌感染植物细胞。
首先，将含有外源基因的质粒DNA导入到农杆菌的Ti质粒中，然后将农杆菌与植物组织接触，使其感染植物细胞。
农杆菌通过其特殊的毛状附着器将Ti质粒转移到植物细胞内。
2. 植物细胞内基因导入。
农杆菌感染植物细胞后，Ti质粒中的外源基因会被转移到植物细胞内。
这些外源基因可以是对抗病虫害、提高产量或改良品质的基因，通过农杆菌的介导，成功导入到植物细胞内。
3. 外源基因整合到植物基因组。
一旦外源基因进入植物细胞内，它们会与植物细胞的染色体发生重组，将外源基因整合到植物基因组中。
这样，外源基因就成为植物细胞的一部分，可以被遗传到后代植物中。
4. 外源基因表达。
一旦外源基因整合到植物基因组中，它们就会开始在植物细胞内进行表达。
外源基因的表达可以使植物获得新的性状，比如抗病虫害、耐逆境等，从而实现对植物性状的改良。
农杆菌转化法的原理简单清晰，通过这种方法可以实现对植物基因的改造，为农业生产提供了重要的技术手段。
在实际应用中，农杆菌转化法已经成功应用于多种作物，如水稻、小麦、玉米、大豆等，为作物的抗病虫害、耐逆境等性状的改良提供了有效途径。
总的来说，农杆菌转化法作为一种重要的植物基因转化技术，其原理清晰，操作简单，成功率高，因此在农业生产和基因工程领域有着广泛的应用前景。
随着技术的不断进步和完善，相信农杆菌转化法将会为农业生产和作物改良带来更多的机遇和挑战。
农杆菌介导法
实验九植物遗传转化——农杆菌介导法一、目的了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术二、原理根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。
下列因子与转化过程有关：1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA)T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。
T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作用元件。
不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。
置于该边界内的任何外源基因均可被转化。
LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。
LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵子转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。
其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋白，有2个NLS。
该操纵子的表达顺序如下：vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋白→VirA被植物创伤信号分子激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。
3. 农杆菌染色体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋白、趋化性）、psc A、att、cel（合成纤维素丝，附着）。
它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。
农杆菌感受态制备与转化
农杆菌感受态制备与转化普通农杆菌感受态制备与转化：方案一1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。
2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。
3. 5k rpm离心5分钟。
4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。
5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。
如不是马上使用，可以将之按200ul分裝储存于-80℃待用。
6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。
7. 液氮中冷冻1分钟。
8. 37℃水浴溶化细胞。
9. 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。
10. 离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。
11. 涂板，28℃培养2-3天。
电转农杆菌感受态细胞制备与转化方案二1．挑取单克隆接种于2mlYEP（含50mg/l链霉素）液体培养基，28℃，250rpm，振荡培养过夜。
（如用5mlYEP，需培养36h）2．将菌液按1:100转移至200mlYEP（含50mg/l链霉素）培养液中，28℃，250rpm，振荡培养至OD=0.3(约4~5h)。
3．转入50ml的无菌离心管，4℃，4000rpm离心10min，弃上清。
4．用20ml冰浴的HEPES(1mM，PH-7.0)重悬。
5．4℃，4000rpm离心10min，弃上清。
6．重复4、5步骤2~3次。
7．用2ml冰浴的10％甘油重悬。
8．每管100μl分装于1.5ml无菌的Eppendorf管中，-70℃保存。
1mM HEPES的配制：称取0.119gHEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500ml，用NaOH调pH至7.0，灭菌后待用。
注：HEPES需现用现配。
电击法转化农杆菌感受态细胞1．取出农杆菌感受态细胞于冰上冻融。
2．加2μl质粒DNA于100μl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀。
农杆菌转化法花序的原理
农杆菌转化法花序的原理1. 引言说到花序，大家脑海中是不是会浮现出那些五彩缤纷的花儿？花开得多好看啊！可这些美丽的花儿背后，可不仅仅是花瓣那么简单，尤其是它们的遗传背景，真是一个复杂而有趣的故事。
今天，我们就来聊聊一个科学名词——农杆菌转化法，它可不是高深莫测的黑科技，而是帮助我们理解和改良植物的重要工具。
听起来有点儿神秘，其实就像魔法一样，咱们慢慢揭开它的面纱！2. 农杆菌的角色2.1 什么是农杆菌？农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）听上去像是某种外星生物，其实它是一种土壤细菌。
别小看它，这家伙在植物界可是个“大人物”。
它有个本事，就是能通过“感染”植物，植入自己的DNA。
这就像在花儿的基因里放入了一个小小的“升级包”，使得植物能够产生新的特性。
就拿苹果树来说，经过农杆菌转化的苹果，可能会更抗病、更耐旱，这可真是科学的力量！2.2 农杆菌的工作原理你可能会想，农杆菌到底是怎么做到的？其实，它有个“绝招”。
当农杆菌接触到植物时，会分泌出一种叫做“转移DNA”（TDNA）的东西。
这东西就像是小偷闯入了植物细胞的家，悄悄地把自己的遗传物质植入进去。
于是，植物的细胞就开始按照农杆菌的指示，进行各种新鲜的改变。
这就像是植物被赋予了超能力，真是妙不可言！3. 转化方法的步骤3.1 转化的准备工作我们要让花儿变得更美，首先得做好准备工作。
通常，科学家会从植物上取下花序，这些花序就像是植物的“小试验田”。
接下来，把这些花序浸泡在含有农杆菌的溶液里，就像是在给植物喝“营养汤”。
这一过程非常关键，因为这时植物细胞就有机会被农杆菌感染。
3.2 转化的实施在浸泡过后，科学家会把花序放在特定的培养基上，给它们创造一个舒适的生长环境。
此时，农杆菌就开始它的“工作”，向植物细胞传递TDNA。
经过一段时间，科学家会观察到花序中有细胞开始发生变化，这时就说明转化成功了！接下来，还需要经过筛选和培养，最终培育出新的植物品种。
农杆菌转化法的过程
农杆菌转化法的过程
农杆菌转化法是一种基因工程技术，可以被用于将外源基因引入生物体中，这种方法大大简化了基因转换的步骤，使得实现基因转换更加容易。
农杆菌转化法的过程主要包括以下几步：
1. 样本处理：处理待转换的样本，例如细胞分离、DNA提取等。
2. 农杆菌菌种培养：在特定的培养基中培养农杆菌菌种，并选择合适的载体。
3. 载体DNA插入：使用质粒或其他载体将外源DNA插入到农杆菌的DNA 中。
4. 转化：将质粒插入的农杆菌接种到特定的培养基中，使其吸收外源DNA，从而实现基因转换。
5. 筛选：根据所需目标，对质粒转化产生的农杆菌进行筛选，以确定成功转化的株系。
6. 验证：进行PCR、Southern Blot等技术，以验证转换效果。
农杆菌转化法操作流程
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关于电激法做农杆菌的转化的问题(农杆菌,电激法,质粒)
农杆菌感受态细胞制备方法1．农杆菌稀释100倍过夜培养；3．5000rpm离心5min，弃去上清液；4．沉淀用1.5 ml 25mM CaCl2悬浮,冰浴20min；5．5000rpm离心5min，弃去上清液；6．每管用50μl CaCl2悬浮，20 min 后用于转化；7．加入质粒DNA 0.1～1μg，之后冰浴30 min；8．放入液N2中5min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；10．取出10～50μl菌液涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。
转化时一般200μl感受态细胞悬液（OD600为0.5-0.6）中加入的质粒含量不超过50ng,体积不超过10μl。
电转化步骤如下：1. 从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；2. 取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。
3. 将40～100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml 的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。
4. 打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。
5. 将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部；6. 将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1000μl的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。
7．37℃，220－250rpm复苏1小时。
8. 取20ul转化产物加160ulSOC涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。
其余菌液加1：1的30％的甘油后混匀－80℃保存。
注：每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal 80μl ，SOC 80μl，IPTG 20 μl。
电击杯清洗流程1．用清水将电击杯稍冲一下。
2．向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr。
3．弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。
4．加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30分钟。
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1.micro-tom 种子的处理：
①75%乙醇侵泡种子：30s，这一步时间不宜过长。
②10% Naclo 消毒20min，无菌水清洗4-5次，最后一次浸泡半小时。
③处理完的种子放到萌发培养基上（MS固体培养基），24±1℃黑暗培养6天，转入光照
条件下4-7天，等待长出子叶。
2.农杆菌转染
①三种培养基的配制：
无抗性的生芽培养基：1/2MS + 2mg/l 6-BA + 0.5mg/l IBA
抗性生芽培养基：1/2MS + 2mg/l 6-BA + 0.5mg/l IBA + 10mg/L Hyg + 250mg/L羧苄
抗性生根培养基：1/2MS + 0.2mg/l IBA + 10mg/L Hyg + 250mg/L羧苄
②农杆菌的处理
A：转基因的农杆菌，200ul加入20mlLB液体培养基中，并加入10ul （25ug/ml）kana 和20ul（12.5ug/ml）Ref，28℃过夜培养24小时
B：取过夜培养的农杆菌200ul于20mlLB培养基中，不加入任何抗生素，加入10ul AS （100umol/L），28℃摇菌8小时，直到OD600=0.3左右
C：取无菌苗子叶，横切，放入菌液侵染15min，无菌纸吸干残留菌液，近轴面朝下，放在无抗性的生芽培养基，暗培养2天
D：2天后取出，放入抗性培养基中，筛选培养。
E：待长出不定芽，再转入抗性的生根培养基，待生根
F：炼苗，移栽
农杆菌浓度在OD600值0.3-0.4最好，侵染15min效果最好。
Hyg的浓度10mg/L最好。
AS：100umol/L。
羧苄初期抑菌的浓度一般200-300mg/L。