MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结
MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结
2008-06-19 00:00 来源：丁香园 点击次数： 1517 关键词： MEF小鼠 胚胎成纤维细胞
知识总结
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小鼠胚胎成纤维细胞的富集
1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。
2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。
3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。
4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。
5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/EDTA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。
6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。
7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。
8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。
9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。
10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。 11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。
12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。
13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。
注释：
我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。
培养基成分：
88％ DMEM
10％ FBS
1％ NEAA
1% 双抗
对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。
小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代
1、移去MEF培养基
2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。
3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。 4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。
5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。
6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。
7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。
8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37℃培养箱中进行培养。
注释：
MEF培养基成分：
89% DMEM (Gibco # 12100-046)
10% FBS (Gibco # 16000-044)
1% NEAA (Gibco # 11140-050)
MEF每传一代就会生长得更慢些。你第一次传代的比例可以是1:5，但是最后一次的传代（第4代或第5代）比例应该是1:2。
小鼠胚胎成纤维细胞的冻存
重悬培养基：
80% DMEM
20% FBS 1% NEAA
冻存培养基：
60％ DMEM
30％ FBS
20％ DMSO
1、用不含钙镁离子的PBS洗一次细胞。
2、加入胰蛋白酶/EDTA37℃消化大约5min。
3、将细胞吹打下来。
4、加入与胰蛋白酶/EDTA等体积的培养基以终止胰蛋白酶的消化。
5、吹散大块组织。如果还有大块组织存在，可将悬液加入到50ml的管中使其沉淀。
6、取上清液，将其分装到锥形管中，1000rpm离心5min。
7、每个冻存瓶中加入0.5ml（冻存液的一半体积）的重悬培养基重悬细胞。
8、逐滴加入等体积的（0.5ml/瓶）冻存培养基，混匀。现在DMSO的浓度是10％。
9、每个冻存瓶中加入1ml的细胞。
10、迅速将细胞转移到冻存的容器中，-70℃冻存过夜。（细胞不能长时间放置在室温而含有DMSO的情况下）
11、第二天将细胞放于液氮中长期保存。 注释：
提前标注好冻存细胞的以下信息：
细胞系名称
传代的代数
冻存细胞的数目
日期
Initials
注明冻存/解冻形式
小鼠胚胎成纤维细胞的解冻/复苏
1、将冻存瓶从液氮中取出。
2、放在37℃水浴中快速解冻，being careful not to immerse the vial above the level of the cap.
3、当仅还有一点冰晶残留时，用95％的乙醇消毒冻存瓶的外面，并将其置于hood中。（为什么用95％的乙醇消毒？hood是什么？）
4、轻轻地上下翻转细胞一次，将它们放入15ml锥形管中。
5、想管中逐滴加入10ml培养基。这一步操作不能少于两分钟。做快了对细胞将是一种打击，你将得到比其他方法具有更低生活能力的细胞。 6、1000rpm离心5min。
7、将细胞重悬于10ml培养基中，然后放入T75培养瓶中。
8、放入37℃培养箱。
9、注明冻存/解冻的形式，以更新数据。
1、关于如何确底胚胎期12.5d~13d的小鼠？希望大家能够介绍一下自己所采用的方法，集思广益。我所采用的方法是选择同一天出生的三对小鼠，到成熟（8~10 w）后，分三周合笼，（每周合笼一对），然后待最早合笼的小鼠产崽后，再取另两个雌鼠的胚胎。不知道这样行不行，也没注意别人是怎样做的。另外问了几个外科的同学也没找到可以查出小鼠孕期的仪器。
2、关于提取MEF的比较好的protocol
3、关于MEF转染时起耐受性如何？这个我以后主要做这些，可能会积累一定的经验，但现在肯定有各位朋友已经从事或正在从事着方面的工作，希望能够分享经验。
4、关于其分泌细胞因子能力？我从一些文献上发现，MEF除了作为胚胎干细胞的饲养层以外，也是研究天然免疫的重要材料，如日本东京大学的AKIRA的实验室，大板大学的takashi fujita实验室就发了相当多的文章。从这些文献可以看出，MEF分泌细胞因子能力远远强于HEK293等工程细胞，相当于肝实质细胞，略低于几种免疫细胞。但较免疫细胞，我认为有其不可替代的优势：
（1）其并不是主要发挥免疫功能的细胞，只有在受到外界刺激时才会应答，分泌细胞因子，免疫细胞在不受刺激时也会为了维持稳态而不断产生细胞因子，即使有严格的control 组，但专门的免疫细胞即使是同一种细胞（DC，NK，T）但不同的细胞分泌细胞因子的能力也是参差不齐的。会造成control 相对不一致。
（2）另一方面，由于这些免疫细胞大部分都是悬浮的，不太容易转染，结果阳性率也会较低。 （3）现在的分离MEF的方法很便宜，不复杂，而分离纯的免疫细胞（如NK，DC），需要MACS，FACS等，这对目前国内的实验室经费相对紧张的情况来说，不是很划算。因此除非是需要研究某一种免疫细胞，如果是为了研究天然免疫或者adaptive immune过程中某中基因，或者蛋白，或者某一信号通路等的作用，MEF 细胞不失为一种选择。
网友crepi 的观点：
1、我每次取的是16~18天的胚鼠 个人觉得无碍 我倒更喜欢大一点的胚胎 更好操作一点
2、我取的是皮肤 然后胰酶4度消化过夜 第二天终止消化 撕掉表皮 留下真皮 减碎 用的100目滤网过滤 这个胰酶消化的时间是个关键 时间长了 细胞容易死 时间少了，表皮不容易揭下来 我有此就是这样 消化了15个小时 结果接种下来的细胞不能贴壁 全死了
3、我用的培养液是DMEM+10%小牛血清 培养液也是关键 因为虽然都是成纤维细胞比较泼辣 但总归是原代 可能还是比较娇嫩 我前几天就是这样 后来发现是培养液出的问题 测的PH值都8.3了 细胞不死才怪 毕竟细胞耐酸不耐碱
4、原代培养的最大天敌还是污染
网友baichangming的观点：
MEF对培养基和血清的要求不高，一般的都行我用过高糖DMEM和D/F-12，生长情况都行，而且看不出什么差别。血清也是以前用几百块钱的国产标准胎牛血清也长得也不错，因为要养干细胞，所以现在换成进口Gibco胎牛的血清（两千多/500ml），感觉细胞的状态确实好了一些。我的血清浓度一般是16.66666%。
网友北羽迦楼的观点： 细胞没别的，就是很容易老化，一般我都是1:5~1:3传代，3代之后细胞就出现衰老了，我感觉年轻增殖能力强的MEF应该有着清晰的细胞轮廓，细胞立体效果不错，在相差显微镜下，细胞核清晰，细胞纤长，正在分裂或是刚刚分裂的细胞没有伸出伪足，但是同样有着更加明亮的轮廓，与细胞边缘相比，细胞呈深色（我觉得是透光效果不好）。一般在4×下观察最能看出细胞的状态，此时能看到细胞呈梭形或是三角形。细胞铺展很厉害，细胞的透光效果增加，说明开始衰老。衰老的MEF最好不要做feeder,但是也不是完全不好。但是要是做转染或是感染的话，出现衰老的MEF就不行了。所以一般就是3代以内做。
我们用的就是WiCell的protocal养，和前面那位战友发的差不多。只是我们用1mg/ml Collengase IV消化40min，用什么酶不重要，我觉得最重要的就是种盘后的换液。原代2小时不管还有多少米贴都不要，传代复苏后一小时就换。消化的时候也是要舍得，0.05%Trypsin-EDTA(GIBCO)，5min消化不下来的也统统不要。因为健康的MEF就是易消化易贴壁。老化以及混杂的其他细胞（神经、上皮）就没那么快了。
附带一句，易消化易贴壁是fibroblast的共性。
小鼠成纤维细胞的marker基因_概述说明
小鼠成纤维细胞的marker基因 概述说明
1. 引言
1.1 概述
引言部分旨在给读者提供一个总览，介绍本篇长文的主题和内容逻辑。本文将重点探讨小鼠成纤维细胞的marker基因，这些基因对于研究和治疗疾病具有重要意义。在接下来的章节中，我们将详细讨论marker基因的定义、已知小鼠成纤维细胞marker基因以及它们的表达调控机制。此外，我们还将介绍使用不同方法和技术检测marker基因的实用方法，并探讨这些marker基因在疾病诊断和治疗中的应用。
1.2 文章结构
本文分为五个主要部分：引言、小鼠成纤维细胞的marker基因、marker基因的检测方法和技术、marker基因在疾病诊断和治疗中的应用以及结论与展望。
1.3 目的
本文目的在于为读者提供一份关于小鼠成纤维细胞marker基因领域最新进展以及相关应用领域的全面概述。通过深入了解这些marker基因及其调控机制，我们可以更好地理解小鼠成纤维细胞的功能和性质，为疾病的诊断和治疗提供更准确、有效的方法。此外，我们还将探讨当前marker基因研究的不足之处，并展望基于marker基因的治疗策略未来发展的前景。归纳总结这些信息将为相关领域的科学家和医生提供指导，以推动其在临床实践中的应用和发展。通过本文所呈现内容的详尽介绍，我们希望进一步促进对小鼠成纤维细胞marker基因及其潜力的理解和研究。
2. 小鼠成纤维细胞的marker基因
2.1 marker基因的定义与意义
在生物学研究中，marker基因是指特定细胞类型或组织中表达的特异性基因。这些基因的表达模式可以用来标记和识别特定细胞类型或确定其功能。对于小鼠成纤维细胞而言，marker基因的发现和研究对于了解成纤维细胞在生理和病理过程中的角色非常重要。
2.2 已知小鼠成纤维细胞marker基因
已经有一系列已知的小鼠成纤维细胞marker基因被发现和研究。其中一些已知的小鼠成纤维细胞marker基因包括：
成纤维细胞
成纤维细胞
1 / 10 成纤维细胞
科技名词定义
中文名称：
成纤维细胞
英文名称：
fibroblast
定义：
普遍存在于结缔组织中的一种中胚层来源的细胞。分泌前胶原、纤连蛋白和胶原酶等细胞外基质成分，伤口愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。
所属学科：
细胞生物学（一级学科）；总论（二级学科）
本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布
百科名片
疏松结缔组织中的成纤维细胞
成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则成纤维细胞
2 / 10 的卵圆形，核仁大而明显。 根据不同功能活动状态，可将细胞划分成成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。
目录
细胞的功能活动状态划分
来源
特征
创伤修复
分离培养
原代培养
展望
展开
编辑本段 成纤维细胞
3 / 10 细胞的功能活动状态划分
根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核仁大而明显，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动；纤维细胞（fibrocyte）功能活动不活跃，细胞轮廓不明显，核小着色深，核仁不明显，细胞质少。此二型细胞可互相转化。[1]
编辑本段
来源
成纤维细胞：数目最多，胞体大，为多突的纺锤形或星形的扁平细胞，细胞核呈规则的卵圆形，细胞轮廓不清。
成纤维细胞摄取所需的氨基酸，如脯氨酸和赖氨酸等，在粗面内质网的核蛋白体上合成前α多肽链（proalpha polypeptide
chain），多肽链输送到高尔基复合体后，组成前胶原分子（procollagen）。前胶原分子由分泌囊泡带到细胞表面，然后通过胞吐作用释放到细胞外。在前胶原肽酶催化下，将每一前α多肽链的尾段除去，成为原胶原分子（tropocollagen）。许多原胶原分子成行平行排列，结合成具有周期性横纹的胶原原纤维。由胶原原纤维互相结合形成胶原纤维。
成纤维细胞的归纳与总结
成纤维细胞的归纳与总结
成纤维细胞是一种重要的细胞类型，广泛存在于人体的各个组织中。它在维持正常组织结构和功能中起着至关重要的作用。本文将对成纤维细胞的特点、功能和应用进行归纳与总结。
一、成纤维细胞的特点
成纤维细胞是一种间充质细胞，其主要特点如下：
1. 形态特征：成纤维细胞呈梭形或椭圆形，细胞体积较大，细胞质丰富，胞内含有丰富的内质网。
2. 细胞产物：成纤维细胞能够合成和分泌胶原蛋白、纤维连接蛋白以及其他基质分子。这些细胞产物对维持正常组织结构和功能至关重要。
3. 动态特性：成纤维细胞具有良好的迁移和增殖能力，可以通过自主或受刺激进行迁移和增殖，参与组织修复和再生过程。
二、成纤维细胞的功能
成纤维细胞在人体各个组织中发挥着重要的功能，主要包括：
1. 产生细胞外基质：成纤维细胞合成和分泌胶原蛋白、弹性纤维等分子，构建和维持细胞外基质的结构和功能。
2. 促进伤口愈合：成纤维细胞在伤口愈合过程中起着至关重要的作用。它们可以通过分泌细胞外基质和促进血管生成等方式促进伤口的修复。 3. 参与炎症反应：在炎症反应中，成纤维细胞可以被激活，并参与调节免疫细胞的活动，调控炎症反应的程度和进展。
4. 调节组织结构：成纤维细胞通过合成和分泌细胞外基质，调节组织结构的稳定性和机械性能。
三、成纤维细胞的应用
成纤维细胞在医学和生物学领域有着广泛的应用价值，主要包括：
1. 组织工程：成纤维细胞可以用于构建人工组织和器官，用于治疗组织缺损或器官功能障碍。
2. 肿瘤研究：成纤维细胞与肿瘤细胞之间存在着相互作用。研究成纤维细胞的功能和调控机制，对于癌症的发生和发展具有重要意义。
3. 药物研发：成纤维细胞可以用于筛选和测试药物的活性、毒性和副作用，为药物研发提供重要的参考。
4. 纤维化疾病治疗：一些纤维化疾病，如肝纤维化和肺纤维化，与成纤维细胞的异常激活和功能失调有关。研究成纤维细胞的调控机制，有望为纤维化疾病的治疗提供新的思路和方法。
胚胎成纤维细胞的生物学特点
龙源期刊网
胚胎成纤维细胞的生物学特点
作者：冯永强 王一兵
来源：《中国美容医学》2008年第07期
1971年，Burrington发现胚胎皮肤创伤愈合后没有瘢痕组织学表现，首次提出“无瘢痕愈合（scarless healing）”的概念,由此引发了人们对无瘢痕愈合机制的研究。无瘢痕的现象只出现在孕期前2/3阶段，之后过渡为少瘢痕期，一般选择研究的无瘢痕期：人孕75～100天，大鼠14～16天，兔21～22天,绵羊60～90天[1-4]，出生后则瘢痕期。众多研究发现，胚胎无瘢痕愈合主要与环境、成纤维细胞、细胞外基质、细胞因子、基因表型等方面有关。研究认为胚胎成纤维细胞（fetal fibroblasts,fFB）是胚胎无瘢痕愈合最主要的效应细胞[5],本文主要对皮肤胚胎成纤维细胞进行综述如下。
1胚胎皮肤成纤维细胞形态学
皮肤fFB外形狭长，边缘不整齐，培养4～6天后会出现相暗的微粒，呈整齐的放射状排列，大小较心脏来源胚胎成纤维细胞小[6]。在透射电镜下大鼠fFB呈长梭形，细胞质内有丰富的粗面内质网，细胞核大，核仁明显，表面有许多短小突起，可见微绒毛核胞浆褶皱，随着传代数的增加，突起和绒毛减少，胞浆内质网扩张，排列无序，膜表明脱颗粒，胞浆出现空泡以及大小不均的板层状或同心圆状颗粒，线粒体数目减少，体积增大，高尔基复合体增多，溶酶体增大增多[7-8]。
2增殖与凋亡
在无血清培养基里，胚胎成纤维细胞的培养情况如图1，胚胎成纤维细胞倍增时间为75.3h，正常细胞的倍增时间为41.1h，培养72h后细胞数目开始下降[9]。胚胎成纤维细胞的凋亡受多种因素调控，其中PDGF-BB可以作用于PDGFR-β抑制胚胎成纤维细胞的凋亡，调节其增殖、迁移，从而对创面的愈合产生影响[10]。
3胚胎成纤维细胞与细胞外基质
ICR小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层制备
ICR小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层制备
方驰华;胡海北;郝建志;陈霞
【摘 要】背景:小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层能有效促进胚胎干细胞及诱导多能性干细胞增殖并维持其未分化特性和多潜能性,且效果优于无饲养层单独添加一些细胞因子,而且可以为上述两种细胞提供类似的胚胎发育环境.目的:建立稳定高效的ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系,用于培养人胚胎干细胞及诱导多能性干细胞.方法:使用胰蛋白酶消化法分离ICR小鼠胚胎成纤维细胞,观察不同的胰蛋白酶水平及消化时间对获取小鼠胚胎成纤维细胞的量及其增殖活性的影响;利用不同质量浓度丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞1,1.5,2,2.5,3,3.5 h制备饲养层细胞,MTT法检测其增殖活性,探索其制备饲养层的最佳条件.结果与结论:分离ICR小鼠胚胎原代成纤维细胞最佳胰蛋白酶浓度为0.05%,消化时间为12～15 min,丝裂酶素最佳作用质量浓度和时间为10 mg/L作用2.5 h,成纤维细胞饲养层可以维持8～12 d.0.05%胰蛋白酶消化15～20 min效果优于0.15%,0.25%胰蛋白酶消化;10 mg/L丝裂霉素C处理胚胎成纤维细胞2.5 h能有效抑制其增殖,表明该条件下的饲养层细胞能很好的支持胚胎干细胞及诱导多能性干细胞生长.
【期刊名称】《中国组织工程研究》
【年(卷),期】2010(014)023
【总页数】4页(P4299-4302)
【关键词】胚胎成纤维细胞;丝裂霉素C;饲养层;胚胎干细胞;诱导多能性干细胞
【作 者】方驰华;胡海北;郝建志;陈霞 【作者单位】南方医科大学附属珠江医院肝胆一科,广东省广州市,510180;南方医科大学附属珠江医院肝胆一科,广东省广州市,510180;南方医科大学附属珠江医院肝胆一科,广东省广州市,510180;南方医科大学附属珠江医院超声诊断科,广东省广州市,510180
【正文语种】中 文
【中图分类】R394.2
小鼠胚胎干细胞自我更新的信号调控机制
小鼠胚胎干细胞自我更新的信号调控机制
在生命科学的广袤领域中，小鼠胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）自我更新的信号调控机制一直是备受关注的研究热点。这不仅对于深入理解胚胎发育的奥秘至关重要，还为再生医学和疾病治疗带来了无限的可能。
要明白小鼠胚胎干细胞的自我更新机制，首先得清楚什么是胚胎干细胞。简单来说，胚胎干细胞是一种具有全能性的细胞，它们有潜力分化成身体内的各种细胞类型。而自我更新，则指的是这些细胞在保持未分化状态的同时，能够不断地分裂增殖，产生更多的相同类型的胚胎干细胞。
那么，是什么在背后操控着这一神奇的过程呢？其中，一系列的信号通路起着关键的调控作用。
首先，LIF/STAT3 信号通路在小鼠胚胎干细胞的自我更新中扮演着重要角色。LIF（Leukemia Inhibitory Factor，白血病抑制因子）与细胞表面的受体结合后，激活了 STAT3（Signal Transducer and Activator of
Transcription 3，信号转导与转录激活因子 3）。活化的 STAT3 进入细胞核，调控一系列与自我更新相关的基因的表达。当 LIF 存在时，STAT3 被激活，促进胚胎干细胞的自我更新；而缺乏 LIF 时，STAT3
活性降低，胚胎干细胞容易发生分化。 再者，BMP（Bone Morphogenetic Protein，骨形态发生蛋白）信号通路也对小鼠胚胎干细胞的自我更新有着重要影响。BMP 与相应的受体结合后，通过一系列的信号转导，激活下游的 Smad 蛋白。这些被激活的 Smad 蛋白会与其他转录因子相互作用，调节与自我更新和多能性相关的基因表达，从而维持胚胎干细胞的未分化状态。
除了上述两条主要的信号通路，还有其他一些因素也参与其中。例如，Wnt 信号通路在小鼠胚胎干细胞的自我更新中也发挥了一定的作用。当 Wnt 信号通路被激活时，它可以抑制胚胎干细胞的分化，促进其自我更新。
羊柄菜多糖对小鼠胎儿成纤维细胞生长、增殖及代谢的影响
《饲料工业》・２０１０芷第３１誊第２４期 饲养
羊栖菜多糖对小 鼠 胎儿威 纤壤镶瓞 爨长
撵赎震撼落 酶 黪噫
安立龙张土保吴凌锋苑麟勇胡洋徐汉进
摘 要：用含５、１０、２０、４０、８０ ｍｇ／］羊栖菜多糖（ＳＦＰＳ）的培养液培养小鼠胎儿成纤维细胞ｆＭＥＦ）， 研究ＳＦＰＳ对ＭＥＦ生长增殖、营养物质吸收利用和细胞因子分泌的影响。结果表明：５、１０、２０ ｍｇ／１
ＳＦＰＳ对ＭＥＦ形态和生长增殖均无显著影响（Ｐ＞０．０５），４０、８０ ｍ ＳＦＰＳ对ＭＥＦ表现出明显的抑制作用 （Ｐ＜０．０５１，使ＭＥＦ突触分叉，细胞内颗粒增多；ＳＦＰＳ可显著促进ＭＥＦ对葡萄糖的摄取利用（Ｐ＜Ｏ．０５），但
对钙和氨基酸的利用无显著影响（Ｐ＞０．０５）；低浓度ＳＦＰＳ有促进ＭＥＦ碱性成纤维细胞因子（ｂＦＧＦ）、干细
胞生长因子（ＳＣＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）分泌的趋势，但高浓度ＳＦＰＳ对ｂＦＧＦ、ＳＣＦ和ＬＩＦ的分泌无显
著影响。
关键词：羊栖菜多糖；小鼠胎儿成纤维细胞；增殖；细胞因子
中图分类号：￥８１６．７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１—９９１Ｘ（２０１０）２４—００３９～０６
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ
ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ
Ａｎ Ｌｉｌｏｎｇ，Ｚｈａｎｇ Ｔｕｂａｏ，Ｗｕ Ｌｉｎｇｆｅｎｇ，Ｙｕａｎ Ｌｉｎｙｏｎｇ，Ｈｕ Ｙａｎｇ，Ｘｕ Ｈａｎｊｉｎ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（ＭＥＦ）ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ５，１ ０，２０，４０，８０ ｍｇ，ｌ
Ｓａｒｇａｓｓｕｍ Ｆｕｓｉ￣ｒｍｅ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ＳＦＰＳ），ｔｈｅｎ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＳＦＰＳ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｕｔｉ—
lif
gp130在小鼠ES细胞增殖过程中的作用建系之初，人们注意到小鼠ES细胞只有与小鼠胚胎
成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF )共培养才可以维持其自我更新的特性；若
失去MEF的支持则立即发生分化，说明MEF能促进ES细胞增殖并/或抑制其分化。之后的研
究表明：MEF通过分泌白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)抑制ES细胞的
分化［10,11］。LIF属于IL-6细胞因子家族，该家族细胞因子主要有IL-6、IL-11、LIF、
CNTF、CT-1、OSM等。该家族不同细胞因子具有相同或相似的生物学效应。例如，OSM，CNTF，
CT-1及LIF都能抑制ES细胞分化。ES细胞不表达IL-6的受体，故IL-6不能抑制ES细胞分
化，但当IL-6和其可溶性受体共同作用于ES细胞时即可以抑制ES细胞的分化［12］。IL-6
家族不同因子具有相同生物学效应的分子基础是它们共同的受体gp130［13］。gp130是一种
跨膜蛋白，属细胞因子受体超家族，本身无激酶活性，其介导的信号传递依赖于细胞内一种
非受体型酪氨酸(Tyr)蛋白激酶JAK (Janus kinase)。gp130与配基结合引起细胞内的不同
JAK分子之间的靠近和相互磷酸化，活化的JAK继而使gp130特定位点的Tyr残基磷酸化。
继而，下游信号分子（如：STAT，SHP-2）则依赖SH2(Src homology 2)结构域与gp130上磷
酸化的Tyr残基结合，而JAK则能够使与gp130 结合的该信号分子磷酸化而活化［14］。STAT3
(signal transducer and activator of transcrip- tion) 即是JAK下游具有SH2结构
的主要信号分子，当其与gp130上的磷酸化Try结合后，JAK可以将其磷酸化，继而进入核
内调节相关基因的转录和表达。除JAK-STAT3通路外，gp130还可以激活PI3K通路及
小管形成实验的原理和目的及操作流程
小管形成实验的原理和目的及操作流程
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一、实验原理
小管形成实验主要是通过观察小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）与人类诱导多能干细胞（iPSC）的相互作用，从而验证诱导多能干细胞的能力。在实验中，将iPSC和MEF混合后培养在培养皿中，观察其形成小管的情况，通过观察小管的形成情况来验证iPSC的多能性。小管形成实验是生物医学研究中的重要手段，能够验证细胞的再生能力和多能性，对于研究干细胞、组织再生等方面具有重要意义。
MEF的制备
配制试剂：
D-MEM培养基的配制
GIBCO CAT. NO. 12800-017 D-MEM
HYCLONE SH30070.03 Fetal Bovine Serum
1、 D-MEM一盒10小包，每一小包可配1L，将D-MEM一包加2克Na2CO3在1L ddH2O中完全溶解，0.22u滤膜过滤，500ml一瓶分装置4℃冰箱备用。
2、 FBS为500ml一瓶装，置56℃水溶30分钟灭活血清中的补体，后分装至50ml离心管，置-20℃冰箱备用
3、 青霉素1000X：国产青霉素，80万单位一瓶，取1瓶完全溶解于8ml ddH2O，560ul一支分装置-20℃冰箱备用
4、 链霉素1000X：国产链霉素，100万单位一瓶，取1瓶完全溶解于10ml ddH2O，560ul一支分装置-20℃冰箱备用
5、 D-MEM一瓶500ml + FBS一支50ml + 青霉素1支 + 链霉素1支(血清10%，青霉素100U/ml，链霉素100U/ml)
Trypsin-EDTA 10X的配制
Trypsin
EDTA·4Na·2H2O Gibco 11267-028 MW 416
1、 Trypsin 2.5克 + EDTA 1.1克完全溶解500ml PBS(-)中0.22滤膜过滤，10ml一支分装，置-20℃冰箱备用
2、 此溶液Trypsin浓度0.5%，EDTA浓度2.2mg/ml，一般ES cell 使用的浓度为Trypsin
0.1%，将原液稀释5倍即可.
MEF（原代胚胎成纤维细胞）的制备
1． 129小鼠（怀孕13天）断颈处死，取出胚胎（一般每个小鼠可获得10个左右胚胎）；
2． 在10cm dish中用眼科剪刀和镊子去除胚膜用PBS（-）洗净血只留胚胎移如另一加了PBS（-）的dish中；
3． 用眼科剪刀和镊子去除胚胎的头和内脏只留胚胎的躯干，用PBS（-）洗3次移入另一加了PBS（-）的dish中；