全组织免疫组织化学染色
全组织免疫组织化学染色指南
全组织免疫组织化学染色指南和疑难解析： 全组织染色尤其是胚胎，是指组织并没有切片，而是组织的一小块进行的整体
染色方法。胚胎干细胞、胚胎发育学研究者以及神经学者通过动物的不同发育
阶段表达不同的目的蛋白这一特点而对不同阶段的动物全胚胎进行染色。
全组织染色与免疫细胞化学以及冰冻切片染色十分类似。如果一种抗体可以应
用于冰冻切片（并不包括石蜡包埋的切片）染色中的话，那么在全胚胎染色中
也是适用的。
不同之处在于全胚胎染色的样品比正常的切片样品更大更厚。因此，固定、封
闭、抗体孵育、洗脱、通透以及底物显色过程都需要更长的时间，以使得溶液
可以渗透到达样品的中心。虽然研究者们使用不一样的次数，但必要的话这些
步骤中的细节对于优化实验也可以提供指导。
一、固定中很重要的一点： 使用同一种抗体时，在冰冻切片中成功使用的固定液，一般都适合用来做全组织
染色的。然而，大多数研究人员偏好于使用4%多聚甲醛。
虽然4%多聚甲醛的这个浓度是很低的，但这还是需要整个样品等待长时间以使
得溶液可以渗透到样品的中心。因此，这并不适合所有的抗体，这是由于4%多聚
甲醛固定液引起的蛋白交联会使很多抗体不能识别其抗原表位。
一般，石蜡切片需要进行抗原修复。而由于抗原修复中的加热步骤会损坏胚胎样
品，故胚胎样品不需要加热修复抗原这一步骤。如果多聚甲醛固定在组织整体固定
中不可行的话，这就可能是因为抗体对于蛋白交联比较敏感，那么就需要选择其他
的固定液。甲醇是人们在组织整体免疫染色步骤中固定液的第二种常用选择。
斑马鱼胚胎的固定和准备需要额外的步骤以确保卵膜被彻底渗透。
二、获取图像：
观看全胚胎图像可以使其在爬片之前漂浮在一个盛有甘油溶液的培养皿中观察。
如果胚胎很小的话，可以使用甘油爬片后，盖盖玻片之前进行观察。
在这种情况下，可以在盖玻片周围滴加油脂，使其不易移动且可以减少使用显微
镜观察时造成的盖玻片的损坏。然而，如果通过全胚胎很难观察一个清晰的染色图
像的话，也可以使用明胶对全胚胎进行分开后观察，这种情况尤其适用于大的后期
胚胎阶段和大的组织样品。
如果使用免疫荧光标记的话，共聚焦显微镜是很好的观察全胚胎的工具。这样就
不用在染色后又将全胚胎分成几个玻片进行观察了。
三、选择胚胎的年龄（阶段）： 随着胚胎的生长，越大的胚胎越难染色。像固定液、抗体、显影液等试剂也不易
于渗透到样品的中心，染色的细胞很难获得一个清晰的图像。那么，必要的话，大
的或者后期的胚胎可以在染色之前可以将其分开成几块。
推荐年龄：
• 鸡胚胎：6天
• 鼠胚胎：12天
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学和HE（Hematoxylin and Eosin）染色是常用的组织学研究技术。免疫组织化学用于检测组织中特定抗原的表达，可以帮助研究者了解细胞和组织的功能和性质。HE染色则是常用的常规组织染色方法，用于观察组织的形态学特征。下面将分别介绍免疫组织化学和HE染色的实验步骤。
1.获取组织标本：首先，需要获取要研究的组织标本，可以是活体组织或固定的组织。固定的组织标本一般使用10%缓冲福尔马林进行固定。
2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。切片厚度一般为3-5微米。
3.去蜡：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，使组织切片恢复水化。
4.抗原修复处理：将切片放入抗原修复液中，通过高温或酶解方法进行抗原修复处理，使细胞或组织中的抗原保持完整。修复液的选择和具体实验要求有关。
5.阻断非特异性结合：将切片浸入阻断液中，阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果。
6.一抗孵育：将合适浓度的一抗溶液加到切片上，使其孵育一段时间。根据要检测抗原的性质选择合适的一抗。
7.二抗孵育和信号增强：将与一抗结合的二抗溶液加到切片上，同时可以加入信号增强剂，提高检测灵敏度。 8.反应显色：将切片加入显色液中，使阳性细胞或组织部分显示出颜色反应。常用的显色方法有原位杂交、过氧化物酶法和碱性磷酸酶法等。
9.脱水和封片：经过显色后，将切片在酒精中进行脱水处理，然后用透明介质嵌片，并保护封片，以便于观察。
HE染色的实验步骤如下：
1.获取组织标本：同样，首先需要获取组织标本，可以是活体组织或固定的组织。
2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。切片厚度一般为3-5微米。
3.去蜡和水化：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，然后用醇和水进行水化，使组织切片恢复水化。
4.酸性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用血红素作为酸性染料，将细胞核染成蓝色。
免疫组织化学染色实验步骤
免疫组织化学染色实验步骤
1. 实验准备
确保所有实验所需的试剂、器材和设备都已准备齐全。主要试剂包括抗体、抗原、染色液、封闭液等。器材包括显微镜、离心机、微量移液器、培养箱等。设备应进行适当的清洁和消毒，保持实验环境的无菌状态。
2. 组织样本的准备
选择合适的组织样本并进行固定处理。通常使用10%中性缓冲福尔马林固定液进行组织固定，固定时间一般为24小时，固定后应将组织转移至PBS缓冲液中保存。固定后的组织样本需经过脱水、透明化和浸蜡等步骤，进行切片。切片厚度通常为46微米，将切片放置于玻片上，进行后续的处理。
3. 切片的脱蜡和再水化
4. 抗原修复
抗原修复是提高抗体特异性的重要步骤。选择适当的抗原修复液（如柠檬酸缓冲液或EDTA缓冲液），将其加热至沸腾并保持一定时间（通常为1020分钟），以去除固定过程中可能产生的抗原遮蔽效应。之后将切片转移至冷却缓冲液中，待其冷却至室温。
5. 封闭非特异性结合位点
用封闭液（如含有5%牛血清白蛋白的PBS溶液）处理切片，以封闭组织中可能存在的非特异性结合位点。封闭液通常需要在室温下孵育30分钟。
6. 加入一抗（初级抗体） 将一抗稀释至适当浓度，滴加在切片上。抗体稀释液的选择应根据抗体的说明书进行，常见的稀释液包括PBS或含有0.1% Triton
X100的PBS。覆盖切片后，置于湿箱中在4°C下孵育过夜，以保证抗体与抗原充分结合。
7. 洗涤切片
用PBS洗涤切片，去除未结合的一抗。洗涤液的选择应为无菌PBS，洗涤次数通常为3次，每次5分钟。
8. 加入二抗（次级抗体）
将二抗稀释至适当浓度，滴加在切片上。二抗应选择针对一抗的相应标记抗体，常用的标记物包括荧光素、酶（如HRP、AP）等。孵育时间为30分钟，孵育条件为室温，避免光照。
9. 洗涤切片
用PBS洗涤切片，去除未结合的二抗。洗涤操作与步骤7相同。
10. 显色反应
根据使用的标记物不同，选择相应的显色试剂进行显色反应。例如，使用HRP标记的二抗时，需加入DAB显色液，并在显微镜下观察反应情况。显色时间应根据试剂说明书进行调节，避免过度显色。
免疫组化染色操作步骤
免疫组织化学染色原理和操作步骤
一、免疫组织化学原理
免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。
PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。
生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。
图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）
SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。SP法简化了操作步骤，同时也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免疫绥化染色技术。
免疫组化染色常见问题及解释
一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。
在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。
二、组织脱水必须彻底干净
组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成年人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。
三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折
应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一， 不平。如果切片有汽泡切片在烘烤时，由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织，在其周围可观察到深浅不一的染色。如果切片有邹折，免疫组化染色后，在邹折的地方有深浅不一的颜色，这是一种假阳性，容易引起混淆。
全自动免疫组织化学染色技术的应用讨论
２０１３年第２５期 ８７
穿孔等并发症。
６ 讨论
高强度聚焦超声是一种无创性局部治疗肿瘤的新型超声加
热技术，被称为无创性超声切除，具有穿透性强、准确、无损、快速
和高温等特点。治疗肿瘤无创伤性，对周围组织结构的完整性无
影响，治疗肿瘤与放化疗有协同作用，可降低肿瘤的复发与转移。
晚期胰腺癌患者最常见、最严重的临床症状是疼痛，因此，
解决疼痛是治疗胰腺癌首要任务。胰腺癌患者疼痛的原因有① 肿瘤组织浸润腹腔后神经组织。②胆管、胰管梗阻压力增高刺激
内脏感受器引起的疼痛。高强度聚焦超声具有明显的止痛作用。
其机制是有效的杀死了肿瘤细胞，控制了肿瘤生长，同时也破坏
了肿瘤边缘及内部的神经末梢使疼痛缓解。本组１５例胰腺癌患
者经ＨＩＦＵ治疗后的临床症状缓解程度，结果有５３％的患者术
后感觉疼痛缓解或消失，部分患者止痛药用量减少，并在治疗中
未发现１例与治疗相关副反应，提高了患者的生活质量。因此认 为高强度聚焦超声治疗胰腺癌是一种有效的治疗方法，尤其对
放化疗不敏感不能手术的一些中晚期患者有其独特的作用。
不足是本组的样本量小，缺乏随机对照及长期随访等问题， 对治疗后生存期是否延长不确定，尚需大的样本进一步研究。 ７ 结论
高强度聚焦超声能有效的缓解晚期胰腺癌患者的疼痛，在
改善生活质量方面作用明显。
参考文献 ［１】叶欣，费兴渡，何申戊．高强度聚焦超声治疗肿瘤『Ｊ］．国外医学 肿瘤学分册，２００４．
【２】叶欣，葛忠民，邹玉红，等．应用高强度聚焦超声缓解胰腺癌患 者疼痛症状的观察『Ｊ１．中国临床康复，２００４，８：５６６７．
【３】谢德荣，姚波，陈积圣，等．高强度体外聚焦超声热疗治疗晚期胰
腺癌近期疗效观察『Ｊ１．肿瘤防治杂志，２００１．８：５１０—５１２． 【４】熊文林，姚松森，李清，等．高强度聚焦超声所致组织坏死形式
实验研究【Ｊ１．中国超声医学杂志，２００３，１９（：４８５—４８７． 【５１高强度聚焦超声肿瘤治疗系统临床应用指南ｆＪ］．中华医学杂
免疫组化染色步骤
免疫组织化
[检验原理]
生物素标记的山羊抗小鼠/兔lgG与结合在组织片上的一抗反应形成免疫复合物， 辣根酶标记链霉卵白素与生物素免疫复合物结合进一步形成聚合物，聚合物上的HR催化底物过氧化氢与DAB (或AEC) 反应，最终形成棕褐色(或红色)不溶性色原，从而在显微镜下显示出组织片中的特定杭原的位点。
[试剂]
1:内源性过氧化物酶阻断剂试剂
2:封闭用正常山羊血清工作液试剂
3:生物素标记山羊抗小鼠兔lgG试剂
4:辣根酶标记链霉卵白素工作液
[储存条件及有效期]
2~ 8C避光保存，不得冻存:产品有效期为12个月。
使用时即拿即放，使用后应立即放回冰箱，开封后试剂有效期6个月。
[样本要求]
1、 标本类型:活检或手术切除标本。
2、标本固定:所有组织标本离体后(1小时内)尽快采用10%中性缓冲福尔马林固定，固定液与所浸泡组织的比例应足够。固定时间以8~72小时为宜。
3、 组织切片:未染色的切片置于室温不宜超过6周，以防抗原丢失。切片厚度3~ 5μm黏附在防脱玻片上，56~ 60摄氏度烤片2小时。
[检验方法]
1、检验所需仪器、设备:移液器、恒温箱、修复仪、免疫组化笔、计时器、孵育盒、染色架、盖玻片、光学显微镜、洗瓶。
2、试剂准备:显色液需要在使用前配制。
3、操作程序:
a) 脱蜡和水化
石蜡切片置于新鲜二甲萃中， 浸泡10分钟x3次:去除多余的液体后，置于无水乙醇中，浸泡3分钟x3次:去除多余的液体后，置于95%乙醇中,浸泡3分钟x2次:去除多余的液体后，置于75%乙醉中，浸泡3分钟x2次:蒸馏水冲洗1分钟，蹕于PBS缓冲液中。
b) 抗原修复，参见抗说明书。
c 阻断内源性过氧化物酶加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10分钟:
PBS 缓冲液冲洗3分钟心3次。
免疫组织学化学染色步骤
免疫组织学化学染色步骤
免疫组织学化学染色是一种广泛应用于生物医学领域的技术，它可以用于检测细胞和组织中的特定蛋白质或其他分子。这种技术主要基于抗体与抗原之间的特异性结合，通过标记抗体或抗原来实现染色。下面是免疫组织学化学染色的步骤：
1. 取样：首先需要从组织或细胞中取得样品。这可以通过活体组织切片、细胞培养等方法来实现。
2. 固定：将样品进行固定处理，以保持其形态和结构不变。常用的固定剂包括甲醛、乙醛、乙酸等。
3. 脱水：将样品逐渐浸泡在不同浓度的乙醇中，以去除水分，使其逐渐变得透明。
4. 渗透：将样品逐渐浸泡在不同浓度的蜡中，使其逐渐渗透并浸润其中。
5. 切片：将样品切成非常薄的切片，通常为3-5微米。
6. 抗原修复：对切片进行抗原修复处理，以恢复抗原的免疫原性。常用的抗原修复方法包括加热、酶解、酸解等。
7. 阻断：将切片浸泡在蛋白质阻断剂中，以防止非特异性结合发生。
8. 一抗：将特异性的一抗加入到切片中，使其与目标抗原结合。
9. 二抗：加入与一抗结合的标记二抗，以形成一抗-二抗复合物。
10. 染色：加入染色剂，使标记二抗发生染色反应，从而可视化目标抗原的分布和定位。
11. 脱色：将多余的染色剂去除，使切片变得清晰可见。
12. 封片：将切片用透明胶封装，以保护其结构和形态。
以上就是免疫组织学化学染色的步骤，这种技术可以用于研究细胞和组织中的蛋白质、细胞因子、核酸等分子，为生物医学领域的研究和诊断提供了重要的工具。
免疫组织化学及HE染色实验步骤 2
免疫组织化学及HE染色实验步骤
1.取得组织标本：首先需要从患者或动物身上获得组织标本。在手术过程中或尸检后，将组织标本取出并固定。
2.标本处理：将取出的组织标本进行固定处理，常用的固定剂有10%的中性缓冲甲醛。需要将标本完全浸泡在固定液中，并确保标本完整。
3.嵌入和切片：将固定处理后的组织标本进行脱水和透明处理，然后用蜡块将其嵌入。嵌入后的标本可以使用旋转式微切机进行切片，切片厚度通常为4-6微米。
4.脱蜡：将蜡包围的组织切片放入脱蜡剂中，蜡会被溶解并去除，以使细胞可被染色剂染色。
5.抗原检出：用特异性抗体结合试剂来检测组织中的特定抗原。将切片在温床上恢复，然后用蛋白酶消化膜蛋白，以增强抗原的敏感性。之后，使用特定的一抗（主抗体）与待检测的抗原结合，形成特异性抗原-抗体复合物。
6.二抗检出：使用特异性标记的二抗来检测抗原-抗体复合物。通常，二抗为小鼠单克隆抗体，与抗体结合后，可通过酶标记法、光学染色或荧光染色等方法来检测二抗信号。
7.显色和镜检：通过给予染色剂，如DAB和H2O2溶液，产生可见的显色反应。显色后的标本可以用显微镜进行观察和评估。
HE染色实验步骤：
1.取得组织标本：与免疫组织化学实验类似，首先需要从患者或动物身上获得组织标本。 2.标本处理：将取出的组织标本进行固定处理，使用10%的中性缓冲甲醛溶液进行固定。需要将标本完全浸泡在固定液中，并确保标本完整。
3.组织处理：将固定处理后的组织标本进行脱水，以至能够与石蜡亲和。
4.嵌入和切片：将脱水的组织标本注入熔化的石蜡中，以便于嵌入。然后，使用旋转式微切机将嵌入后的标本切为薄片，厚度通常为4-6微米。
5. 脱蜡和染色：将蜡包围的组织切片放入脱蜡剂中，蜡会被溶解并去除，以使细胞可被染色剂染色。接下来，将切片放入hematoxylin染色剂中，染出细胞核的蓝色。
6. 酸性染色：将切片转移到eosin染色剂中，以染出细胞质和胞外基质的红色。
免疫组织化学染色的实验步骤及注意事项
十五、免疫组化流程
1、65℃烤片1-2h
2、从65℃烤箱中拿出切片立即放入二甲苯Ⅰ中脱蜡15min，二甲苯Ⅱ15min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，95%乙醇5min，85%乙醇5min，75%乙醇5min。
3、自来水冲洗5min。
4、蒸馏水冲洗3遍。
5、高压修复（先将修复液煮沸后，将片子放入煮沸溶液中，将压力锅盖盖好，当气阀冒气时，开始计时2分40秒，此时将温度调至140℃）。
6、将电磁炉电源关闭，用自来水冲洗压力锅锅盖，至气阀自然落下，将锅盖打开，自然降至室温（约40min左右）。
7、PBS浸泡5min*3次。
8、3%的H2O2封闭30min。
9、蒸馏水冲泡2次。
10、PBS浸泡5min*3次。
11、加Ⅰ抗 8张片子，每片80μl 8*80=640μl
配700μl 700μl（释液）+7μl（Ⅰ抗）
12、室温放置30min，放4℃过夜。
13、第二天拿至室温平衡30min（提前准备PBS）
14、PBS洗5min*3次
15、加Ⅱ抗 50-100μl张 37℃ 30min，或室温1小时
16、PBS洗5min*3次
17、DAB显色（2min）。
18、流水中止，流水冲洗5min。
19、苏木素复染（2min），流水中止，流水冲洗5min。
20、梯度酒精脱水各5min（从无水乙醇拿出风干片子，再放入二甲苯中）。
21、二甲苯透明各15min。
22、用中性树胶封片。
盐酸酒精 500ml无水乙醇+250ml蒸馏水+6ml盐酸
氨水 600ml蒸馏水+2m氨水
85%乙醇 透明
75%乙醇 95%乙醇 无水乙醇Ⅱ 无水乙醇Ⅰ 二甲苯Ⅱ 二甲苯Ⅰ
盐酸酒精 氨水
75%乙醇 85%乙醇 95%乙醇 无水乙醇Ⅱ 无水乙醇Ⅰ 二甲苯Ⅱ 二甲苯Ⅰ
盐酸酒精作用：分化
氨水作用：返蓝 脱蜡
免疫组织化学染色步骤
免疫组织化学染色步骤
免疫组织化学染色步骤：
1.石蜡切片脱蜡至水化。
2.3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
3.蒸馏水冲洗，磷酸缓冲盐溶液（PBS）浸泡5分钟，（如需采用抗原修复，可在此步后进行）。4.5~10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃。
5.PBS冲洗，5分钟×3次。
6.滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%牛血清白蛋白（BSA）-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
7.PBS冲洗，5分钟×3次。
8.滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
9.PBS冲洗，5分钟×3次。
10.显色剂显色（DAB或AEC）。
11.自来水充分冲洗，复染，封片。
12.冰冻切片免疫组化染色步骤。
13.冰冻切片4~8mm,室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3.用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。