高效制备昆明鼠胚胎成纤维细胞饲养层

鸭胚成纤维细胞培养_传代及保存方法的研究_许静

2012年第34卷第13期ChinaPoultryVol.34，No.13.2012实验研究

收稿日期：2012-01-04修回日期：2012-02-20∗基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金（NY⁃CYTX-45-02）；浙江省农科院科技创新能力提升工程∗∗通讯作者，E-mail：well-being365@鸭胚成纤维细胞培养鸭胚成纤维细胞培养、、传代

及保存方法的研究∗

许静1，2，李进军1∗∗，熊胜1，陈黎1，杨倩2，卢立志1

（1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江杭州310021；2.南京农业大学动物医学院，江苏南京210095）

摘要：本研究旨在建立鸭胚成纤维细胞离体培养、传代以及冷冻保存体系，为鸭胚胎

或生殖干细胞的离体培养奠定基础。利用胰酶-EDTA消化鸭胚胎组织，10%FBS+DEME

营养液培养，获得原代和传代成纤维细胞。分别用DMSO、甘油以及乙二醇作为冷冻保护

剂对F1代鸭胚成纤维细胞进行冷冻保存，检测复苏后细胞的生长情况。利用此方法可以获

得高活性的鸭胚成纤维细胞，并可成功传至第三代。其中F1代与F2代细胞活力最好，达到

90%以上。3种冷冻剂保存的细胞复苏后均与F1代细胞的活力存在明显差异，均小于80%，

其中用DMSO冷冻保存的细胞复苏后活力最强，生长密度保持较好。关键词：鸭胚成纤维细胞；体外培养；冷冻保存；细胞活力

Culture，SubcultureandCryopreservationofEmbryoFibroblastofDuck∗

XUJing1，2，LIJinjun1∗∗，XIONGSheng1，CHENLi1，YANGQian2，LULizhi1

（1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou，Zhejiang310021；

超数排卵对家兔早期胚胎体外发育的影响

・１８・畜牧技术　东畜牧兽医科技２０１１年（第３６卷）第２期　

超数排卵对家兔早期胚胎体外发育的影响　

曹君君　（汕头大学医学院实验动物中心，广东汕头５１５０４１）　

摘要：为探讨超数排卵对家兔早期胚胎体外发育能力的影响，收集自然发情组和超数排卵处理组交　配７２　ｈ后家兔胚胎，对经筛选合格的胚胎以小鼠成纤维细胞为饲养层进行体外培养，以自然发情交配的　家兔胚胎为对照，观察培养９６　ｈ贴壁情况和内细胞团传代能力。超数排卵处理的家兔交配后经筛选所获　得的可用胚胎数量增多；其９６　ｈ贴壁率和成功传代内细胞团比率与自然发情组无显著差异。家兔超数排　卵所获得的可用胚胎对其体外发育能力无显著影响。　关键词：家兔；胚胎；体外培养；传代　中图分类号：￥８１４．４　文献标识码：Ａ　文章编号：１００５－８５６７（２０ｌ１）０２－００１８—０３　

ｌｎｆｌｕｅｎ，　ｏｆｓｕｐｅｒｏｖｕｌａｔｉｇｒｏｗｔｈ　ｏｆｅａｒｌｙ　ｅｍｂｒｙ　。ｖｉｔｒｏＩｎｔｌＵＯｎＣＣ　０　Ｓｕｌｇｅｒｏｖｕ　ｏｎ　ｏｎ　ｏ　ｒａｂｂｉｔ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｍ　ｗｔｒｏ　

Ｃａｏ　Ｊｕｎ．Ｊｕｎ　（Ｓｈａｎ　Ｔｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌ　ＣｅｎｔｅｒＧｕａｎｇ　Ｄｏｎｇ，Ｓｈａｎ　Ｔｏｕ　５１５０４１）　

Ａｂｊ蛐ｃａｃｔ：Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓｕｐｅｒｏｖｕｌａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｏｆ　ｅａｒｌｙ　ｒａｂｂｉｔ　ｅｍｂｒｙｏｓ。７２　ｈｏｕｒ．ａｇｅｄ　ｒａｂｂｉｔ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ－ｆｒｏｍ　ｎａｔｕｒａｌ　ｉｎｔｅｒｃｏｕｒｓｅ　ｒａｂｂｉｔｓ　ａｎｄ　ｓｕｐｅｒｏｖｕｌａｔｉｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ　ｒａｂｂｉｔ，　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　ｏｎ　ｍｏｕｓｅ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｅｅｌｌ　ｌａｙｅｒｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｔｈｅ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｉｎ　９６ｈ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｉｎｎｅｒ　Ｃｅｌｌ　Ｍａｓｓ（ＩＣＭ）ｗａｓ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｉｎ　ｐａｓｓａｇｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｓｕｐｅｒｏｖｕｌａｔｉｏｎ　ｄｉｄ　ｎｏｔ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ａｆｆｅｃｔ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ａｆｔｅｒ　９６ｈ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ　ｐａｓｓａｇｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｉｎｎｅｒ　Ｃｅｌｌ　Ｍａｓｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｓ，ａｌｔｈｏｕｇｈ　ｓｕｐｅｒｏｖｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｉｎ　ｓｕｐｅｒｏｖｕｌａｆｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｓｕｐｅｒｏｖｕｌａｔｉｏｎ　ｈａｄ　ｌｉｔｔｌｅ　ｉｍｐａｃｔ　ｏｎ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｒａｂｂｉｔ　ｅｍｂｒｙｏ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．　Ｋ斜ｗ０Ｉｄｓ：Ｒａｂｂｉｔ；Ｅｍｂｒｙｏｓ；Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏ；Ｐａｓｓａｇｅｃｕｌｔｕｒｅ　

不同饲养层对牛胚胎干细胞培养的影响

张守宝1，柏学进1，2，朱金香1，王文明1，刘玮1，董雅娟1，2

（1．青岛农业大学动物胚胎工程中心，山东青岛266109；

2．山东布莱凯特牧业科技有限公司，山东淄博256306）

摘要：本研究建立牛胚胎干细胞（BovineEmbryonicStemCellsESCs）的分离培养体系，摸索牛ESCs的培养条件。对牛运用FSH减量注射法进行

超数排卵获取胚胎。从获得的胚胎中分离ESCs，在不同的饲养层（牛骨髓间充质干细胞、牛成纤维细胞、牛乳腺干细胞）上培养，对牛ESCs进

行形态学观察及鉴定。牛MSCs做饲养层与牛SFCs、牛MaSCs相比差异显著，牛MSCs的效果最佳（P＜0.05）。牛ESCs在牛MSCs做饲养层的条

件下更易生长。分析了不同饲养层对牛ESCs分离培养的影响，建立了一种分离培养牛ESCs的饲养层体系，为进一步深入研究ESCs的诱导分化

和应用打下基础。

关键词：超数排卵；饲养层；牛胚胎干细胞

中图分类号：S814.6文献标识码：A文章编号：0529-5130（2010）05-0044-05

胚胎干细胞（ESCs）指从桑椹胚的卵裂球（seg-

mentationsphere），附植前胚胎的内细胞团（Inner

CellMass，ICM），上胚层细胞（EpiblastCell）或原

始生殖嵴细胞（Primordialgermcells，PGCs）分离出

来全能干细胞。饲养层细胞是通过细胞接触机制和非

接触机制促进ESCs增殖并阻止其分化。它能分泌多

种细胞因子，提供ESCs生长的环境和信号。饲养层

对ESCs的分化抑制是其分泌的多种因子共同作用的

结果。不同ESCs的最佳饲养层不尽相同，不同的饲

养层细胞在使用上也各具优缺点。最可靠的方法还是

根据动物种类筛选最佳饲养层来对ESCs进行培养。

LeroyStevens发现小鼠畸胎瘤细胞（embryoniccarci-

nomacell，EC），揭开了研究动物胚胎干细胞的序

高中生物第章细胞工程.1动物细胞培养学案选择性3

22.13

- 1 - 动物细胞培养

必备知识·素养奠基

一、动物细胞培养概念

从动物体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。

二、动物细胞培养的条件

1。营养条件:

(1)合成培养基：将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成。

（2)天然成分：血清等.

（3）一般使用液体培养基,即培养液。

2。无菌、无毒的环境：

(1）培养液和培养用具灭菌处理。

(2）无菌环境下操作.

（3）培养液定期更换的目的：清除代谢物,防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。

3。温度、pH和渗透压:

(1)适宜的温度：哺乳动物多以36。5±0。5 ℃为宜。

(2）适宜的pH:多数细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。 22.13

- 2 - (3)适宜的渗透压。

动物细胞培养能否体现动物体细胞的全能性？说明你的理由。

提示:不能。动物细胞培养只是细胞的增殖，没有体现细胞的全能性。

4.气体环境：95％空气和5%CO2。

（1)O2作用：细胞代谢所必需的。

(2）CO2的主要作用：维持培养液的pH。

三、动物细胞培养的过程

填一填：基于动物细胞培养的过程，完成下面的问题:

（1)过程①处理方法有:机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理的方法.

(2）过程②为原代培养,培养的动物细胞有两类:

①悬浮在培养液中生长增殖;

②贴附于某些基质表面生长增殖。 22.13

- 3 - (3）进行过程③时,悬浮培养的细胞直接用离心法收集;贴壁细胞需要使用胰蛋白酶等处理，然后用离心法收集.

（4)过程③为传代培养，进行过程③的原因主要有:细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏和接触抑制等。

四、干细胞培养及其应用

1。干细胞分布：早期胚胎、骨髓和脐带等。

2.种类：胚胎干细胞和成体干细胞。

3.判一判：基于干细胞的类型和应用,判断下列说法的正误。

(1)胚胎干细胞和成体干细胞都具有形成机体的所有组织和器官,甚至个体的潜能. (×)

高考生物专题复习题：动物细胞工程

1 / 6

高考生物专题复习题：动物细胞工程

一、单项选择题（共6小题）

1. 细胞工程中常使用技术手段将两种细胞融合形成一个细胞。下列相关叙述正确的是（）

①植物体细胞杂交技术、动物细胞融合技术和动物细胞核移植技术的原理都涉及细胞膜的流动性

②植物体细胞杂交技术需要使用胰蛋白酶将组织分散成单个细胞后再诱导融合

③植物体细胞杂交技术依据细胞全能性原理将杂种细胞培育成新植物体

④可使用PEG或灭活病毒诱导动物细胞融合

⑤B淋巴细胞与骨髓瘤细胞可通过细胞膜上的糖蛋白相互识别并特异性融合成为杂交瘤细胞

⑥在动物细胞核移植技术中，通过电融合法使供体细胞与去核卵母细胞融合可形成重构胚

A．①②④⑥ B．②③⑤⑥ C．①③④⑥ D．①③④⑤

2. 细胞工程在农业、医药工业等方面有着广泛的应用，并取得了显著的社会效益和经济效益。下列关于细胞工程的叙述错误的是（）

A．利用茎尖组织培养技术培育出的脱毒马铃薯往往比未脱毒马铃薯产量高

B．利用植物体细胞杂交技术可以获得白菜-甘蓝植株，打破了生殖隔离

C．使用胚胎分割技术获得同卵双胎或多胎的过程属于有性生殖

D．将病人自身体细胞诱导形成的iPS细胞移植回病人体内，理论上可避免免疫排斥

2 / 6

3. 如图为某团队制备iPS细胞（诱导多能干细胞）的过程示意图：①小鼠胚胎成纤维细胞培养→②用分别含有Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4基因的四种慢病毒载体感染小鼠胚胎成纤维细胞→③置于含有饲养层细胞的胚胎干细胞培养基中培养→④鼠胚胎成纤维细胞脱分化，形成iPS细胞。相关叙述正确的是（）

A．利用iPS技术不能把体细胞培养成生物个体

B．步骤②由于慢病毒载体会受到免疫细胞的攻击，可能导致感染效率的降低

C．步骤④形成iPS细胞的实质是基因的选择性表达，使其功能趋向于专门化

D．iPS细胞进一步分化成各种组织细胞的过程，可以体现细胞全能性

4. 某研究小组将鼠肝癌细胞和正常肝细胞分别置于相同培养液中培养，进行了相关实验。下列相关叙述错误的是（）

MEF及饲养层的制备(实验记录)

mef及饲养层的制备（实验记录）

1.mef的获取：（步骤4－12已经进行实践）（1）激素处理小鼠，同期发情和超数排卵

（2）2：1合笼过夜(雌：雄)*r%m)e3y6i\

（3）取出有阴道栓（即乳白色或淡黄色冻胶状物，确定其已经怀孕）的开始记时间为0.5天-u1}-b)o*p

（4）抽出胎儿12.5-14.5天的小鼠为实验材料

（5）颈椎脱臼法处死孕小鼠，放于盛有75%酒精的烧杯中消毒，拿到超净工作台上解剖，先剖开腹部皮肤，暴露子宫，然后换另外一套手术器械，用眼科镊提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角，取出子宫，置于装有pbs的培养皿中。

（6）抽出胎鼠，在pbs中冲洗数次。除去头、尾、内脏和四肢，仅领躯干部。在pbs中充份冲洗，弃除红细胞。(用两个镊子协调即可除去羊水膜、胎盘、头尾、内脏、四肢)（若是想要培育神经干细胞，则用剪刀穗序前脑展开培育即可）（可以一起处置多个胚胎）1n.s#@$g$@

（7）在新的培养皿中加入少量pbs，放入躯干部分，用眼科剪刀剪成1mm3以下的组织块碎片（可以剪的更碎一点，下步的消化时间就可以缩短）。

（8）重新加入2~4ml0.25%胰蛋白酶，培养箱中消化10―15min，消化完结后重新加入等体积（多加点也行及，只要不是太少提，确保全盘的中止消化反应）的mefmedium中止消化反应，轻轻王繇，并使细胞集中。（搞原代消化的时间稍长，胰酶用量也小，若是搞传代，则只需重新加入500持续上升，最多1ml的胰酶，消化1~3min。）（躯干非政府难于消化，搞原代和传代时，故都用0.25%胰蛋白酶；而脑组织较易消化（脑肿瘤非政府），原代和传代都用0.05%胰蛋白酶。）（消化可能将不全然，也可以室温静置5－10min，弃非政府块，这样下面过滤器就相对难。）（如果消化获得的细胞太太少，可以Vergt弃上清，pbs冲洗，再次提胰酶消化）（胰蛋白酶，trypsin,拉沙泰格赖厄县条件ph8.0，37度，溶液中钙镁离子和血清可以减少其活力，故消化用的胰蛋白酶中重新加入了edta。消化完结时重新加入不含血清的培养基即可中止反应）

浅谈昆明种小鼠胚胎干细胞的培养及鉴定

摘要：目的从昆明种小鼠的早期胚胎中获取并培养胚胎干细胞。方法

收集小鼠 d的囊胚培养，用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层，形成的ES细胞样集落，72 h后分离隆起生长的内细胞团并继续培养，观察集落的生长状态，并通过碱性磷酸酶染色进行鉴定。结果 ES细胞有其典型的形态学特征：集落呈鸟巢状，边缘清楚，表面平滑，结构致密，隆起生长，细胞之间界限不清楚；单个细胞体积小、核大；对ES 细胞碱性磷酸酶进行检测，在AKP底物作用下，未分化的ES 细胞显微镜下为棕褐色，分化的不着色。结论昆明种小鼠囊胚在小鼠胚胎饲养层细胞上可以发育为胚胎干细胞。

关键词：小鼠胚胎干细胞 ES细胞系

胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell， ES)是一种多能的未分化细胞，是从早期胚胎的内细胞团(inner cell mass，ICM)中分离出的多能干细胞。由于它可以参与胚胎发育，将所携带的基因导入受体，生成嵌合体，因此ES细胞已成为制作转基因动物的主要途径之一。也可以利用ES细胞模拟早期胚胎细胞的发育过程，分析参与早期发育中细胞分化与决定的因素，研究基因的调控，建立疾病的动物模型，利用ES细胞还可以为临床提供器官移植、修复器官或组织的原材料［1，2］。最近，基因打靶及基因捕获又成为应用胚胎干细胞进行研究的热点［3］。小鼠的ES细胞分离培养最早是在1981年由英国Evans和Kaufman［4］完成的，以后又有陆续建立了数百个小鼠ES细胞系［5-7］。但这些小鼠细胞系多来源于129，C57BL/6J等品系，而国内应用最广泛的昆明种小鼠ES的建系率很低。本实验尝试建立昆明种ES细胞系，为进一步的研究工作提供条件。

1 材料和方法

动物来源

来自辽宁医学院实验动物中心，昆明种小鼠，6～8周龄，体重25～35 g。

试剂

昆明鼠胚胎干细胞系建立中原代克隆生长及其传代方法的研究

李娟;王磊光;魏斌;董云玲;盖凌;王洪岩;吴爱华;邱毅

【摘要】Objective: Try to investigate the separation method of the inner

embryonic cell mass of Kunming mouse, separation time of primary

colonies and the effect of passage method on the efficiency of stem cell

establishment. Method: The cell line of embryonic stem cells was

established from Kunming mouse blastocysts at fetal age 3. 5 day. The

affect of the establishment efficiency was compared between intact

embryo cultivation and immunosurgery for the isolation of the inner cell

mass. The separation time of the primary clone was observed. The affect of

the establishment efficiency was compared between mechanical method

passage and enzymatic digestion passage. Results: We established 3 cell

lines of embryonic stem cells after 30 blastocysts were cultured by intact

MEF及饲养层的制备(实验记录) 2

MEF及饲养层的制备(实验记录)

MEF及饲养层的制备（实验记录）

1.MEF的获取：（步骤4－12已经进行实践）（1）激素处理小鼠，同期发情和超数排卵

（2）2：1合笼过夜(雌：雄)* r% m) E3 Y6 i\

（3）取出有阴道栓（即乳白色或淡黄色冻胶状物，确定其已经怀孕）的开始记时间为0.5天 - U1 }- b) o* p

（4）取出妊娠12.5-14.5天的小鼠为实验材料

（5）颈椎脱臼法处死孕小鼠，放于盛有75%酒精的烧杯中消毒，拿到超净工作台上解剖，先剖开腹部皮肤，暴露子宫，然后换另外一套手术器械，用眼科镊提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角，取出子宫，置于装有PBS的培养皿中。

（6）取出胎鼠，在PBS中洗涤数次。去除头、尾、内脏和四肢，仅留躯干部。在PBS中充分漂洗，弃除红细胞。(用两个镊子配合即可除去羊水膜、胎盘、头尾、内脏、四肢)（若是想培养神经干细胞，则用剪刀剪取前脑进行培养即可）（可以一起处理多个胚胎）1 n. s# @$ g$ @

（7）在新的培养皿中加入少量PBS，放入躯干部分，用眼科剪刀剪成1mm3以下的组织块碎片（可以剪的更碎一点，下步的消化时间就可以缩短）。

（8）加入2~4ml 0.25%胰蛋白酶，培养箱中消化10―15min，消化结束后加入等体积（多加点也行，只要不是少加，保证彻底的终止消化反应）的MEF Medium终止消化反应，轻轻吹打，使细胞分散。（做原代消化的时间稍长，胰酶用量也大，若是做传代，则只需加入500微升，最多1ml的胰酶，消化1~3min。）（躯干组织不易消化，做原代和传代时，故都用0.25%胰蛋白酶；而脑组织较易消化（脑肿瘤组织），原代和传代都用0.05%胰蛋白酶。）（消化可能不完全，也可室温静置5－10min，弃组织块，这样下面过滤就相对容易。）（如果消化得到的细胞太少，可以离心弃上清，PBS洗涤，重新加胰酶消化）（胰蛋白酶，Trypsin ,最适条件pH8.0，37度，溶液中钙镁离子和血清会降低其活力，故消化用的胰蛋白酶中加入了EDTA。消化结束时加入含血清的培养基即可终止反应）

丝裂霉素C对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响

・　１Ｏ　・　《上海畜牧兽医通讯》２０１３年第４期　

丝裂霉素Ｃ对ＩＣＲ小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响　

郝同杨　陈世豪　张光景　王杏龙　

（扬州大学动物科学与技术学院　江苏扬州　２２５００９）　

【摘要】目的：探索不同浓度的丝裂霉素ｃ（ＭＭＣ）处理对ＩＣＲ小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响，用于　

分离和培养干细胞。方法：取１３．５　ｄ胎龄ＩＣＲ鼠胚分离原代成纤维细胞，利用不同浓度ＭＭＣ处理胚胎成纤维细　

胞制备饲养层，比较观察ＭＭＣ对细胞增殖的抑制作用，制作细胞生长曲线；取妊娠３．５　ｄ的ＩＣＲ小鼠胚胎在不同　

浓度ＭＭＣ处理的饲养层上培养，观察胚胎贴壁和增殖情况。结果与结论：胎儿成纤维细胞贴壁生长，增殖迅速，６　

代后细胞逐渐衰老；ＭＭＣ能有效抑制胎儿成纤维细胞的增殖，最佳处理方法为２Ｏ　Ｆｇ／ｍｌ、２　ｈ。妊娠３．５　ｄ的ＩＣＲ　

小鼠胚胎在１Ｏ、２０￣ｇ／ｍｌ　ＭＭＣ处理的饲养层上孵出率和贴壁率显著高于５／ｚｇ／ｍｌ　ＭＭＣ处理的饲养层，在５、１０　

和２０“ｇ／ｍｌ　ＭＭＣ处理的饲养层上，内细胞团增殖率无显著差异。因此，ＩＣＲ小鼠胚胎成纤维细胞最佳处理方法　

为２０“ｇ／ｍｌ　ＭＭＣ作用２　ｈ。　

关键词：胚胎成纤维细胞；丝裂霉素Ｃ；饲养层；ＩＣＲ小鼠　

胚胎干细胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ，ＥＳＣｓ）是一种分离于　

动物早期胚胎内细胞团（ｉｎｎｅｒ　ｃｅｌｌ　ｍａｓｓ，ＩＣＭ）和原始生殖细　

胞（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ，ＰＧＣｓ）的全能性细胞　。对于　

ＥＳＣｓ的分离和培养，饲养层是重要的影响因素之一。成纤　

维细胞能够分泌白血病抑制因子（１ｅｕｋｅｍｉａ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ，　

ＬＩＦ）和碱性成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃ—ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　

ｆａｃｔｏｒ，ｂＦＧＦ）。这些细胞因子能够抑制ＥＳＣｓ体外分化，维　

持ＥＳＣｓ的增殖和多能性。此外成纤维细胞易于获得，易于　贴壁铺层。因此，成纤维细胞已经成为培养ＥＳＣｓ的主要饲　